妊娠期糖尿病患者腸道菌群變化特征及與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系和對妊娠結(jié)局影響

陳悅?cè)?費(fèi)華麗 夏建妹*

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院(310006)；2.浙江省杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期婦女常見并發(fā)癥[1]，可導(dǎo)致產(chǎn)婦不良妊娠結(jié)局，且產(chǎn)婦產(chǎn)后發(fā)展成為2型糖尿病概率較高，胎兒成年后出現(xiàn)糖耐量異常與糖尿病風(fēng)險增加[2]。近年來諸多研究表明，腸道菌群改變會通過參與機(jī)體代謝從而促進(jìn)GDM發(fā)生[3]。而既往研究表明，炎性反應(yīng)、免疫功能與GDM發(fā)生發(fā)展相關(guān)密切[4]。但有關(guān)GDM患者腸道菌群變化特征與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系及其對妊娠結(jié)局的影響研究較少?；诖?，本研究探究GDM患者腸道菌群與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性及其對妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月-2020年12月本院產(chǎn)科建檔定期產(chǎn)前檢查并分娩的孕婦126例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②單胎妊娠，妊娠24～28周；③可正常溝通，聽力與理解能力正常；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕前糖尿病高血壓；②妊娠期間有抗生素或腸道調(diào)節(jié)藥物服用史；③合并消化道疾病或近1個月有腹瀉史；④合并心肝肺等器官疾??； ⑤合并感染或血液系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批，孕婦均簽署知情同意書。按照孕24～28周糖耐量檢測結(jié)果分為GDM組與正常組。

1.2 檢測方法

1.2.1腸道菌群檢測采集孕婦晨自然排出糞便置無菌干燥采便盒內(nèi)送檢。取送檢糞便1.0g，用滅菌稀釋液10倍稀釋，使用相同方法稀釋10倍至10-8，混勻后制成懸液。每稀釋度取50μl懸液涂抹于不同培養(yǎng)基上，類桿菌、乳桿菌、梭菌、擬桿菌于36±1℃厭氧培養(yǎng)48h，腸球菌、腸桿菌、酵母菌、葡萄球菌于36±1℃厭氧培養(yǎng)24h，對所需菌群進(jìn)行定量、定性檢測。定性檢測方法為培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板培養(yǎng)皿中菌落數(shù)，于10-3稀釋度的培養(yǎng)液中未檢出為陰性；定量檢測方法為通過革蘭染色鏡檢、生化反應(yīng)于菌落形態(tài)等鑒定計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算出同一稀釋度下平均菌落數(shù)，每個標(biāo)本的菌含量=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×500。具體鑒定方法為：腸球菌為染色鏡檢為G-桿菌、計(jì)數(shù)有明顯褐色圈的所有菌落；腸桿菌染色鏡檢為G-桿菌、計(jì)算發(fā)酵乳糖所有菌落；擬桿菌采用API20A、G-無芽胞桿菌；乳桿菌采用觸霉陰性、G+無芽胞桿菌、APICH50；雙岐菌采用食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)。

1.2.2血清檢測抽取孕婦晨空腹靜脈血離心取上清液-80℃保存。2ml靜脈血加入肝素抗凝管中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。采用免疫熒光法檢測超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平，試劑盒均來自江蘇省蘇微微生物研究有限公司生產(chǎn)。

1.3 治療

GDM組患者采用綜合方式治療，包含胰島素皮下注射、適量運(yùn)動與飲食控制，要求孕婦減少糖攝入，在保證胎兒正常發(fā)育同時根據(jù)患者病情注重飲食搭配、營養(yǎng)均衡，當(dāng)血糖超出正常范圍時給予注射胰島素治療。

1.4 觀察指標(biāo)

比較兩組孕婦腸道菌群變化特征與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群及妊娠結(jié)局差異，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般資料

GDM組52例，年齡(25.4±1.8)歲(23～28歲)，體質(zhì)指數(shù)(BMI)(21.6±5.3)kg/m2(16～28 kg/m2)，孕周(26.2±1.3)周(25～28周)，孕(1.3±0.3)次(1～3次)。正常組74例，年齡(25.1±1.7)歲(23～27歲)，BMI(22.1±5.0)kg/m2(17～28 kg/m2)，孕周(25.9±1.4)周(24～28周)，孕(1.3±0.3)次(1～3次)。兩組比較無差異(P>0.05)。

2.2 腸道菌群分布特征

兩組孕婦梭桿菌菌落數(shù)無差異(P>0.05), GDM組雙歧桿菌、乳桿菌菌落數(shù)少于正常組，腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌菌落數(shù)高于正常組(P<0.05)。見表1。

2.3 炎性因子水平

GDM組TNF-α、IL-6、hs-CRP水平高于正常組(P<0.05)。見表2。

2.4 T淋巴細(xì)胞亞群水平

GDM組CD8+水平高于正常組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平少于正常組(均P<0.05)。見表3。

表1 兩組腸道菌群分布比較

表2 兩組炎性因子水平比較

表3 兩組T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

2.5 GDM患者腸道菌群分布特征及與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系

Spearman 相關(guān)性顯示，GDM患者腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌與TNF-α、IL6、HsCPR、CD8+呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及組別呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；乳桿菌、擬桿菌與TNF、IL6、HsCPR、CD8+呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及組別呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 GDM患者腸道菌群分布特征與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系

2.6 妊娠結(jié)局

GDM組妊娠正常41例(78.8%)、異常11例(21.2%)，正常組妊娠正常69例(93.2%)、異常5例(6.8%)，GDM組孕婦妊娠不良總發(fā)生率多于正常組(P<0.05)。見表5。

2.7 GDM孕婦不同妊娠結(jié)局者腸道菌群分布特征

GDM組中不同妊娠結(jié)局孕婦梭桿菌菌落數(shù)無差異(P>0.05),妊娠不良孕婦雙歧桿菌、乳桿菌菌落數(shù)少于妊娠正常孕婦，腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌菌落數(shù)高于妊娠正常孕婦(P<0.05)。見表6。

表5 兩組孕婦妊娠不良結(jié)局比較[例(%)]

表6 GDM組不同妊娠結(jié)局者腸道菌群分布比較

3 討論

腸道菌群種類有一千多種，在生物機(jī)體正常生理功能中具有營養(yǎng)、抗腫瘤、抗衰老、排毒、拮抗等重要作用，尤其在代謝性疾病人群中的調(diào)控作用已逐漸成為醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注重點(diǎn)，但研究多集中于2型糖尿病人群，GDM相關(guān)報道較少[6-7]。

機(jī)體腸道中厭氧菌占共生菌群的98%以上，是人體最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。雙歧桿菌與乳桿菌是腸道菌群重要的組成成員，具有抑制腸桿菌、腸球菌等生長繁殖，改善腸道酸性環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用[8]。腸道內(nèi)菌群平衡可組成天然屏障，抵御外來病原菌侵襲；當(dāng)機(jī)體腸道雙歧桿菌、乳桿菌因各種原因減少時，腸道微生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境失衡[9]。在本研究中，兩組孕婦在梭桿菌菌落數(shù)上無明顯差異,GDM孕婦雙歧桿菌、乳桿菌菌落數(shù)少于糖耐量正常孕婦，腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌菌落數(shù)高于糖耐量正常孕婦。提示GDM孕婦體內(nèi)伴有較嚴(yán)重腸道菌群失調(diào)。分析原因可能為[10-11]：雙歧桿菌與乳桿菌均為益生菌，具有抑制致病菌生長，降低腸道PH值的作用；腸桿菌、腸球菌是最常見致病菌，威脅機(jī)體健康；擬桿菌利于維持腸道菌群平衡，梭桿菌與腸道黏膜完整相關(guān)密切。當(dāng)益生菌菌落數(shù)下降、致病菌增多時，使腸道微生態(tài)環(huán)境破壞，腸道菌群失衡，使宿主循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)毒素進(jìn)入體內(nèi)，增加胰島細(xì)胞損傷，導(dǎo)致糖尿病等代謝疾病發(fā)生。

妊娠期胰島素抵抗是GDM的發(fā)病基礎(chǔ)，而炎性因子升高是胰島素抵抗的直接結(jié)果[12]，主要表現(xiàn)為：單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活，促炎因子釋放，發(fā)生慢性炎性反應(yīng)。而GDM患者機(jī)體代謝產(chǎn)物增加，腸道PH值與厭氧環(huán)境發(fā)生改變，益生菌多屬厭氧菌，對腸道內(nèi)環(huán)境改變敏感，當(dāng)腸道代謝異常時益生菌大幅減少，機(jī)體炎性表達(dá)升高，加重胰島素抵抗，糖代謝異常更為嚴(yán)重。在本研究中，GDM孕婦TNF-α、IL-6、hs-CRP水平高于糖耐量正常孕婦，且腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌與TNF-α、IL-6、HsCPR呈正相關(guān)，乳桿菌、擬桿菌與TNF-α、IL-6、HsCPR呈負(fù)相關(guān)。

腸道菌群平衡是機(jī)體天然屏障，腸道內(nèi)菌群改變會改變腸道黏膜免疫應(yīng)答。正常健康個體不對正常腸道菌群誘發(fā)免疫應(yīng)答，而腸道菌群改變后益生菌較少，免疫菌群紊亂影響免疫功能，打破機(jī)體免疫耐受，降低機(jī)體免疫功能[13]。本研究中，GDM組孕婦CD8+水平高于正常組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平少于糖耐正常組，且腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌與CD8+呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)；乳桿菌、擬桿菌與CD8+呈負(fù)相關(guān)，與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈正相關(guān)。反映出菌群失調(diào)后免疫功能的變化。

既往研究提出，GDM一定程度影響妊娠結(jié)局，增加不良妊娠發(fā)生概率[14]。在本研究中，GDM組妊娠不良總發(fā)生率多于正常組，且妊娠不良組GDM產(chǎn)婦雙歧桿菌、乳桿菌菌落數(shù)少于妊娠正常組，腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、酵母菌菌落數(shù)高于妊娠正常組，提示腸道菌群分布與妊娠結(jié)局有一定關(guān)系。但腸道菌群影響GDM妊娠結(jié)局不良相關(guān)機(jī)制仍不清楚，需后期深入研究。

綜上所述，GDM患者存在腸道菌群失衡，且與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群有一定相關(guān)性，并一定程度影響GDM患者的妊娠結(jié)局。