藥物中阿莫西林含量的高效液相色譜法測(cè)定

王淑靜（河南省平頂山市食品藥品檢驗(yàn)所,河南 平頂山 467021）

阿莫西林是一種青霉素藥品，抗菌性強(qiáng)，在臨床中應(yīng)用廣泛，也是藥品研制和管理部門(mén)的重要研究對(duì)象。阿莫西林為β內(nèi)酰胺類抗菌藥物，是常見(jiàn)的抗生素，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌的殺菌作用都比較高效[1]。檢測(cè)阿莫西林制劑、血樣等中含量的方法研究受到重視。根據(jù)阿莫西林具有酸堿兩性的特點(diǎn)，阿莫西林的含量測(cè)定大部分采用高效液相色譜法。檢測(cè)阿莫西林含量常用高效液相色譜法。高效液相色譜法以高壓下液體為流動(dòng)相，使用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)，適用性廣泛，不會(huì)受到樣品熱穩(wěn)定性及揮發(fā)性的影響，比氣相色譜法更有優(yōu)勢(shì)[2]。高效液相色譜法靈敏度高，分離效能高，高速快捷，在醫(yī)學(xué)、化學(xué)、工業(yè)等方面發(fā)揮重要的作用。本文主要探討藥物中阿莫西林含量的高效液相色譜法測(cè)定。

1 資料和方法

1.1 一般資料 ①使用儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀、UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度儀（日本島津）、METTLER TOLEDO XPE 205DR 型電子分析天平、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元泵、檢測(cè)器、脫氣機(jī)、色譜工作站。②使用藥劑：阿莫西林咀嚼片、色譜純乙腈、阿莫西林對(duì)照品、超純水等藥劑。

1.2 方法 ①參數(shù)設(shè)置：采取高效液相色譜法檢測(cè)，設(shè)置固定相的參數(shù)，預(yù)柱為（20×3.9mm），AgillentSB-C18色譜柱（4.6×150mm，3.5μm）。流動(dòng)相為0.05mol·L－1磷酸鹽緩沖液，制備方法，使用13.6g磷酸二氫鉀，稀釋，通過(guò)加水溶解至2000mL，然后調(diào)節(jié)pH值，使用8mol·L－1氫氧化鉀溶液，直到pH值為（5.0±0.1）。柱溫設(shè)置為30℃。流速設(shè)置為1.0mL/min。乙腈（97.5∶2.5，v／v）。進(jìn)樣量20μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

②流動(dòng)相配置：使用6.8g磷酸二氫鉀固體粉末，加純水1000mL溶解。取試劑瓶，采取量筒精密量取975mL磷酸二氫鉀溶液，放入其中。精密量取25mL乙腈溶液。與磷酸二氫鉀溶液混合。超聲處理10min，以備使用。

③對(duì)照品溶液制備：使用稀釋溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液等。取50mL量瓶，精密稱取阿莫西林對(duì)照品適量，放入其中。使用上述配置的流動(dòng)相溶解。充分搖勻。對(duì)照溶液制成備用，規(guī)格為0.5mg/mL。

本次研究分析阿莫西林對(duì)照品溶液稀釋方法，稀釋與制備7種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)的溶液以備實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。選擇應(yīng)用7種實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物。進(jìn)行樣品檢測(cè)和分析?；旌蠈?shí)驗(yàn)檢測(cè)溶液與藥物，應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)定不同藥物中的阿莫西林含量。制備實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物樣品，混合檢測(cè)藥物及阿莫西林對(duì)照溶液。保證達(dá)到實(shí)驗(yàn)相應(yīng)的精確的濃度值。不同的濃度水平下，測(cè)定藥物樣品中阿莫西林的含量。嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)范操作，制備整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物樣品，并進(jìn)行樣品檢測(cè)。根據(jù)要求嚴(yán)格控制操作，避免影響檢驗(yàn)分析的精確性。

2 結(jié)果

2.1 線性及線性范圍 精密稱取適量阿莫西林對(duì)照品，將磷酸鹽緩沖液加入其中，制定濃度不同的混合溶液。濃度分別為：1.44mg/mL，1.20mg/mL，0.96mg/mL，0.71mg/mL，0.48mg/mL?；旌喜煌幬铮瑴y(cè)定分析進(jìn)樣20μL。根據(jù)Y=15.89×106X＋11.61×105（R2=0.9998）回歸方程進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，阿莫西林濃度與其峰面積在0.48-1.44mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下，平行檢測(cè)6次，結(jié)果如表1所示，應(yīng)用高效液相色譜法顯示具有良好的精密度。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取6份樣品，計(jì)算標(biāo)示量，分別為100.5%，101.3%，102.1%，100.2%，101.5%，101.2%，RSD為0.75%，應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)顯示良好的重現(xiàn)性。

2.4 模擬回收率試驗(yàn) 精密取適量阿莫西林對(duì)照品。將空白敷料及藥物加入，與處方量相符。進(jìn)行均勻混合，計(jì)算回收率和測(cè)得量，結(jié)果如表2所示。藥物阿莫西林在不同的濃度下，檢測(cè)顯示阿莫西林成分，提取回收率大約88.3%-98.6%。檢測(cè)藥物阿莫西林中，應(yīng)用高效液相色譜檢驗(yàn)法，具有較好的提取回收率。并且適用于其他有關(guān)藥品制備及成分檢測(cè)。

3 討論

阿莫西林是新一代半合成廣譜抗生素，屬抗生素中的青霉素類藥物，帶有氨基側(cè)鏈，為世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的口服β內(nèi)酰胺類抗生素的首選[3]。對(duì)于許多革蘭氏陰性菌，阿莫西林的作用較強(qiáng)，比如嗜血桿菌、沙門(mén)菌、變形桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、布魯菌等。對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌，阿莫西林的效力不及青霉素。對(duì)沙門(mén)菌、腸球菌屬，阿莫西林的效力比氨芐西林更強(qiáng)。對(duì)于耐青霉素的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，阿莫西林不能發(fā)揮作用。細(xì)菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林有完全的交叉耐藥性。阿莫西林制劑用藥方便，副反應(yīng)少，殺菌力強(qiáng)，吸收迅速，性質(zhì)穩(wěn)定，并且價(jià)格便宜，應(yīng)用比較廣泛[4]。阿莫西林的作用機(jī)制，主要是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抑制。結(jié)合細(xì)菌胞質(zhì)膜上的青霉素結(jié)合蛋白，使其喪失活性，阻礙敏感菌內(nèi)黏肽的交叉連接，也激發(fā)細(xì)胞自溶酶的活性，同時(shí)提升菌體內(nèi)滲透壓，胞內(nèi)不斷進(jìn)入胞外水分，最終導(dǎo)致菌體過(guò)度膨脹裂解死亡。阿莫西林一般稱為繁殖期殺菌劑，用于正在繁殖的細(xì)菌。阿莫西林結(jié)構(gòu)中有氨基和羧基，具有兩性化合物的性質(zhì)。早期檢測(cè)阿莫西林的方法眾多，比如流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、旋光法、微生物效價(jià)測(cè)定法、電位滴定法、碘量法等。阿莫西林具有紫外吸收的特征，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中含有氨羥芐基[5]。阿莫西林是一種常見(jiàn)的抗生素類藥品，應(yīng)用普遍且廣泛。

阿莫西林的化學(xué)特性，不溶于乙醇，可溶解于水。檢測(cè)研究阿莫西林藥物特性及作用，常用高效液相色譜法。采用高效液相色譜法，阿莫西林溶于水，流動(dòng)性較好。為保證檢測(cè)中的色譜柱的穩(wěn)定性，在檢測(cè)阿莫西林作用特性時(shí)，通常添加一定的乙腈，保障檢測(cè)結(jié)果的精確性[6]。但應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)與分析阿莫西林含量時(shí)，需要合理控制乙腈的添加量。如果乙腈不足，或者過(guò)多，就會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。比如影響峰形、分離度、峰面積、保留時(shí)間等。在檢測(cè)操作中，雜質(zhì)比較多。容易影響檢測(cè)阿莫西林含量的結(jié)果。藥物中阿莫西林含量應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，合理設(shè)置色譜條件，控制好色譜柱流動(dòng)相。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的情況，控制流動(dòng)相pH值，保證其在相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)范圍[7]。由此在分離操作中，能夠使峰值變化的主峰區(qū)分更加準(zhǔn)確，保證阿莫西林含量檢測(cè)的可靠性。

高效液相色譜法檢測(cè)藥物中的阿莫西林含量，在阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，加入空白藥物進(jìn)行檢驗(yàn)。濃度不同的情況下，藥物樣品的色譜圖變化也具有差異性。阿莫西林成分含量的峰面積存在差異。根據(jù)檢驗(yàn)情況進(jìn)行分析，及時(shí)記錄及調(diào)整。比較不同濃度下，藥物阿莫西林的色譜圖峰面積變化。分析藥物中阿莫西林含量提取回收情況。最大限度保證檢測(cè)藥物中阿莫西林含量的準(zhǔn)確性。基于高效液相色譜檢測(cè)原理，還有反相色譜檢測(cè)、柱切法等，均可以準(zhǔn)確檢測(cè)藥物中阿莫西林的含量[8]。但由于操作復(fù)雜性較高，或者儀器設(shè)備需求多，在實(shí)際檢測(cè)中很少應(yīng)用。色譜法的分離原理是，各組分溶于流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)固定相時(shí)發(fā)生作用，在固定相中滯留不同的時(shí)間，流出固定相。色譜法也稱為層析法、色層法。早在1906年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特發(fā)現(xiàn)色譜法。主要是用碳酸鈣分離植物色素時(shí)研究發(fā)現(xiàn)。隨后出現(xiàn)液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等。液相色譜分析是色譜法中最古老的一種。也就是液體作為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。隨著技術(shù)的改進(jìn)，引入氣相色譜的塔板理論，使用高靈敏度的檢測(cè)器，高效固定相，高壓輸液泵，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，具有更高的分離效率及分析速度，也就是高效液相色譜法。高效液相色譜法具有高速的特點(diǎn)，流速0.1-10mL／min[9]。高效液相色譜法具有高壓的特點(diǎn)，達(dá)到150-300kg/cm2。高效液相色譜法具有高靈敏度的特點(diǎn)，消耗樣品少，靈敏度可達(dá)0.01ng。高效液相色譜法具有高效的特點(diǎn)，能夠分離測(cè)定百余種物質(zhì)。相比經(jīng)典液相色譜法，高效液相色譜法的熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg，紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，靈敏度高。對(duì)差異性很小的物質(zhì)，高效液相色譜法也可以分離分析，分辨率高。高效液相色譜法的速度快，分析檢測(cè)一個(gè)樣品，通常15-30min，甚至有的樣品只需要5min內(nèi)。應(yīng)用高效液相色譜法，樣品量少，容易回收。不同的化合物，采用一根色譜柱即可，柱子可以反復(fù)使用。經(jīng)過(guò)色譜柱后的樣品，可以收集，不會(huì)被破壞。

二十世紀(jì)六十年代，高效液相色譜法出現(xiàn)以來(lái)，在實(shí)際檢測(cè)分析中發(fā)揮重要的作用。高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高效、高速的分離檢測(cè)。其使用高靈敏度檢測(cè)器，全多孔微粒填充柱，以及高壓輸液泵。引入微處理機(jī)技術(shù)，吸收經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗(yàn)，使高效液相色譜法的分析精度、儀器的自動(dòng)化水平不斷提升。高效液相色譜儀應(yīng)用微處理機(jī)控制，具有很高的自動(dòng)化水平。不僅能夠?qū)x器的參數(shù)進(jìn)行控制，并且可以根據(jù)需要設(shè)置色譜圖?？刂苾x器的檢測(cè)器功能，包括洗脫液收集，自動(dòng)進(jìn)樣，柱溫，流動(dòng)相流量，溶劑梯度洗脫等。能收縮、放大色譜圖。并且能夠處理峰高、峰面積，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)保留記錄[10]。成為功能齊全、高效的檢測(cè)分析工具。高效液相色譜法的應(yīng)用范圍廣泛，尤其是分離分析熱穩(wěn)定性差、強(qiáng)極性、大分子、高沸點(diǎn)等化合物。在醫(yī)學(xué)、化學(xué)、環(huán)保、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、法檢、商檢等方面，高效液相色譜法都是重要的檢測(cè)技術(shù)。高效液相色譜法是解決分離分析難題的重要工具，測(cè)定藥物的含量其品種已經(jīng)達(dá)到上千種，對(duì)于質(zhì)量控制、組成分析、測(cè)定含量等都具有重要的意義。由于高效液相色譜法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于藥物阿莫西林含量的分析，高效液相色譜法具有良好的效果。

綜上所述，應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)阿莫西林含量，包括針對(duì)不同藥物濃度、稀釋溶液、阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其便捷性、可行性和適用性較高。