血管生成、心肌重構(gòu)和心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物在心力衰竭診斷及預(yù)后評估中的臨床價值

王 琦

心力衰竭(heart failure)是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的復(fù)雜臨床綜合征，其主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、乏力(活動耐量受限)、液體潴留(肺淤血和外周水腫)。心力衰竭為各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段，發(fā)病率高，是當(dāng)今最重要的心血管病之一[1-2]。近年來，研究者試圖探尋改善急性和慢性心力衰竭的診斷和預(yù)測的生物標(biāo)志物。然而，由于心力衰竭病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，單一的生物標(biāo)志物不能詮釋這種疾病的全部特征[3-4]。心力衰竭是一種涉及代謝、神經(jīng)激素以及免疫系統(tǒng)相互作用導(dǎo)致心臟收縮功能障礙的復(fù)雜綜合征，其發(fā)生發(fā)展涉及機(jī)體的多條生理病理通路。這些生理病理通路在心力衰竭疾病進(jìn)程中并非孤立，而是相互聯(lián)系、相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)，共同導(dǎo)致疾病的惡化[5-6]。心肌受損激活神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，造成內(nèi)皮功能障礙等不良后果。因此，傳統(tǒng)研究中將單一生物標(biāo)志物或單一通路中的生物標(biāo)志物作為診斷心力衰竭這一復(fù)雜疾病的指標(biāo)有其局限性，不能全面評估疾病的發(fā)生發(fā)展。目前越來越多研究表明，不同通路中的多個生物標(biāo)志物聯(lián)合評估的準(zhǔn)確性優(yōu)于單個生物標(biāo)志物[7]。N末端腦利鈉肽前體(NT-proBNP)是一種廣泛使用的心臟疾病標(biāo)志物，其釋放與心室擴(kuò)張和壓力超負(fù)荷成正比，顯示心臟體積或壓力超負(fù)荷[8-9]，而超敏肌鈣蛋白T(hs-TnT)是心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志物[10-11]。在最近的心力衰竭相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)與心力衰竭有關(guān)的生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物包括心肌細(xì)胞應(yīng)激蛋白(GDF-15)[12-13]、細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白(半乳糖凝集素-3)[14]、骨甘氨酸[15]、金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)[16-17]、炎癥相關(guān)標(biāo)志物(galectin- 3)[14]和血管生成標(biāo)志物[內(nèi)皮抑素[18]、干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白(IBP-4)、干擾素調(diào)節(jié)因子7結(jié)合蛋白(IBP-7)、抗血管生成因子(sFlt-1)和血管生成因子(PLGF)[18]]。目前尚未查詢到IBP-4、IBP-7、骨甘氨酸和內(nèi)皮抑素與心力衰竭的相關(guān)研究。本研究旨在評估血管生成、心肌重構(gòu)和心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物在診斷與預(yù)測心力衰竭中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2013年12月我院收治的慢性心力衰竭病人130例為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲；符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》中慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性心肌梗死、肺栓塞或6個月內(nèi)出現(xiàn)腦卒中病人；非嚴(yán)重肺動脈高壓和終末期腎病病人。選取同期在我院進(jìn)行體檢的健康體檢者84名為對照組，通過心電圖和超聲心動圖檢測排除心功能異常者。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 評估和隨訪 所有病人均依據(jù)紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級標(biāo)準(zhǔn)分類，并評估藥物用量(特別是利尿劑的用量)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、血清肌酐含量、估計(jì)腎小球?yàn)V過率(eGFR)、體重和年齡。 所有病人經(jīng)常規(guī)治療心力衰竭2周后復(fù)查上述9種標(biāo)志物含量及心臟彩超。所有病人均于治療后每2個月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括心力衰竭癥狀、血壓、心率、心功能、心電圖、血生化、血尿常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、9種標(biāo)志物濃度及超聲心動圖結(jié)果。隨訪終點(diǎn)：因心力衰竭惡化而死亡或再住院治療。

1.3 樣品處理和生物化學(xué)分析

1.3.1 樣品采集 所有病人均于入院后3 d內(nèi)采集空腹靜脈血3 mL，加入含乙二胺四乙酸的試管中并加入抑肽酶2 500 U，2 h內(nèi)離心(3 000 r/min離心10 min)分離血漿，并置于-80 ℃冰箱中儲存待測。

1.3.2 標(biāo)志物濃度檢測 血漿 NT-proBNP通過瑞萊 SSJ-2 多功能免疫檢測儀采用膠體金/雙向側(cè)流免疫法檢測；hs-TnT 采用羅氏Elecsys2010電發(fā)光全自動免疫分析儀檢測(電化學(xué)發(fā)光法)；通過羅氏 Elecsys2010 電發(fā)光全自動免疫分析儀檢測評估GDF-15、sFlt-1和PLGF；通過羅氏微量滴定板原型測定骨甘氨酸、TIMP-1和IBP-7。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測半乳糖凝集素-3(聯(lián)科生物)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒檢測內(nèi)皮抑素(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)和IBP-4(Abcam)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對象臨床特征比較 慢性心力衰竭病人均接受藥物治療，89.2%的病人使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)，52.3%的病人存在低血壓左室功能紊亂[射血分?jǐn)?shù)(EF)≤35%]。與對照組相比，病例組體質(zhì)指數(shù)、NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、sFlt-1、PLGF、骨甘氨酸、TIMP-1、IBP-7、半乳糖凝集素-3、內(nèi)皮抑素、IBP-4水平均升高(P<0.001)。詳見表1。

表1 兩組研究對象臨床特征比較

2.2 單變量分析 經(jīng)相關(guān)分析，hs-TnT、sFlt-1、內(nèi)皮抑素、IBP-4、IBP-7、PLGF、TIMP-1、骨甘氨酸、半乳糖凝集素-3、GDF-15均分別與NT-proBNP、NYHA心功能分級、年齡呈正相關(guān)(P<0.001)，其中 GDF-15與NT-proBNP、NYHA心功能分級、年齡的相關(guān)性最強(qiáng)；而hs-TnT、內(nèi)皮抑素、IBP-4、IBP-7、PLGF、TIMP-1、骨甘氨酸、GDF-15與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.01或P<0.001)，sFlt-1、半乳糖凝集素-3與EF呈正相關(guān)(P<0.001)，其中NT-proBNP與LVEF的相關(guān)性最強(qiáng)(r=-0.83，P<0.001)；hs-TnT、sFlt-1、內(nèi)皮抑素、IBP-4、IBP-7、PLGF、TIMP-1、骨甘氨酸、半乳糖凝集素-3、GDF-15均與eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，其中骨甘氨酸、GDF-15與eGFR的相關(guān)性最強(qiáng)(r=-0.64，P<0.01)。詳見表2。

表2 單變量相關(guān)分析(r值)

2.3 多變量回歸分析結(jié)果 多變量回歸分析顯示，多數(shù)蛋白可被用于評估eGFR、NYHA心功能分級和LVEF，其中GDF-15、半乳糖凝集素-3、sFlt-1、IBP-7顯示出與NT-proBNP相似的特征；PLGF和骨甘氨酸是與EF或NYHA心功能分級無明顯相關(guān)的蛋白。詳見表3。

表3 多變量回歸分析(回歸系數(shù))

2.4 ROC曲線分析各生物標(biāo)志物檢測心力衰竭的價值 應(yīng)用ROC曲線分析各生物標(biāo)志物在檢測心力衰竭的曲線下面積(AUC)值，結(jié)果顯示：NT-proBNP的AUC最優(yōu)[AUC=0.98，95%CI(0.97，0.99)]，其次為hs-TnT[AUC=0.96，95%CI(0.94，0.99)]，其余依次為GDF15[AUC=0.94，95%CI(0.91，0.97)]、半乳糖凝集素-3[AUC=0.92，95%CI(0.89，0.96)]、內(nèi)皮抑素[AUC=0.90，95%CI(0.86，0.93)]、PLGF[AUC=0.80，95%CI(0.75，0.86)]、骨甘氨酸[AUC=0.77，95%CI(0.71，0.83)]、IBP-7[AUC=0.76，95%CI(0.69，0.82)]、IBP-4[AUC=0.75，95%CI(0.68，0.81)]、SFLT-1[AUC=0.74，95%CI(0.68，0.81)]和TIMP-1[AUC=0.73，95%CI(0.66，0.79)]。

將心力衰竭病人根據(jù)NYHA心功能分級和左室功能障礙嚴(yán)重程度分級分為4組。在NYHA Ⅰ級/Ⅱ級和 NYHA Ⅲ級/Ⅳ級分組中，除PLGF(P>0.05)外，其他標(biāo)志物隨著心功能嚴(yán)重程度的加重明顯增加。在左室功能障礙分組中，除PLGF(P>0.05)和骨甘氨酸(P>0.05)外，其他標(biāo)志物蛋白在輕度至中度左室功能障礙(LVEF≥35%)和嚴(yán)重左室功能障礙(LVEF<35%)分組中都顯著增加。詳見表4。

表4 標(biāo)志物水平預(yù)測心力衰竭的嚴(yán)重程度[M(P25，P75)] 單位：%

同時對照組與不同NYHA 分級心力衰竭病人標(biāo)志物蛋白相對含量顯示，NT-proBNP的相對增加幅度最大；NYHA Ⅰ級/Ⅱ級病人NT-proBNP的增加幅度是其他標(biāo)志物蛋白的11倍(GDF-15)～25倍(SFLT-1)；對于NYHA Ⅲ級/Ⅳ級病人NT-proBNP的蛋白含量是其他新興標(biāo)志物的20倍(GDF-15)～60倍(TIMP-1)。詳見圖1。

圖1 對照組與不同NYHA 分級心力衰竭病人標(biāo)志物蛋白相對含量比較

2.5 心力衰竭病人的預(yù)后 對130例心力衰竭病人進(jìn)行了隨訪，平均隨訪時間為1 053 d，隨訪終點(diǎn)為全因死亡、全因死亡或再住院治療聯(lián)合終點(diǎn)。生存分析顯示，130例病人中發(fā)生29例全因死亡，56次全因死亡率和再住院治療的聯(lián)合終點(diǎn)。所有標(biāo)志物蛋白的截點(diǎn)值為病人集合體的中位數(shù)，而對于NT-proBNP和hs-TnT的截點(diǎn)值分別為900 pg/mL和 0.014 ng/mL。結(jié)果顯示，除了內(nèi)皮抑素、PLGF和骨甘氨酸之外，其他標(biāo)志物蛋白可作為全因死亡率的預(yù)測指標(biāo)。關(guān)于全因死亡率和再住院治療聯(lián)合終點(diǎn)，除PLGF外，其他標(biāo)志物蛋白都可作為獨(dú)立的預(yù)測因子。詳見表5。

表5 各標(biāo)志物蛋白預(yù)測心力衰竭病人預(yù)后的效能

在關(guān)于全因死亡率的ROC分析中，GDF-15的AUC為 0.78[95%CI(0.69，0.87)]，hs-TnT的AUC為0.74[95%CI(0.66，0.82)]，TIMP-1的AUC為0.73[95%CI(0.62，0.85)]，NT-proBNP的AUC為0.73[95%CI(0.64，0.83)]，GDF-15、hs-TnT的AUC值高于NT-proBNP。在關(guān)于全因死亡或再住院治療聯(lián)合終點(diǎn)的ROC分析中，IBP-7顯示具有最高的AUC值，為 0.73[95%CI(0.65，0.81)]，其次是NT-proBNP、GDF-15和IBP-4(AUC均為 0.71)。

2.6 預(yù)測的多標(biāo)記模型 在多標(biāo)志物模型中具有最佳預(yù)后表現(xiàn)的標(biāo)志物包括NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、TIMP-1和IBP-4。根據(jù)標(biāo)志物種類將病人組分為6組，并通過Kaplan-Meier分析評估NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、TIMP-1、IBP-4與全因死亡率和全因死亡率及再住院治療的聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果顯示事件發(fā)生率隨著生物標(biāo)志物升高而逐步增加(見圖2、圖3)。除此之外，單一標(biāo)志物模型并不能準(zhǔn)確地展示其預(yù)后能力，尤其是在全因死亡率方面，而多標(biāo)志物組合對心力衰竭預(yù)后的測定才更為準(zhǔn)確。

圖2 NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、IBP-4、TIMP-1與全因死亡率的關(guān)系

圖3 NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、IBP-4、TIMP-1與全因死亡率及再住院治療的聯(lián)合終點(diǎn)事件的關(guān)系

3 討 論

本研究評估9種蛋白質(zhì)作為心力衰竭生物標(biāo)志的能力。除了NT-proBNP和hs-TnT之外，在這些蛋白中GDF-15、半乳糖凝集素-3、IBP-7、sFlt-1顯示出與NT-proBNP類似的標(biāo)記能力。在多標(biāo)記模型中，NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、TIMP-1和IBP-4體現(xiàn)了優(yōu)異的長期預(yù)測性能。

3.1 新型標(biāo)志物與NT-proBNP預(yù)測價值比較 心力衰竭為各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段，發(fā)病率高，是當(dāng)今最重要的心血管病之一[1-2]。該疾病不易診斷，而且疾病過程難以預(yù)測。NT-proBNP和hs-TnT是公認(rèn)的診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物。然而，由于心力衰竭病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，單一的生物標(biāo)志物不能完全詮釋疾病的全部過程[3-4]。本研究在慢性心力衰竭病人中評估了9種新興蛋白質(zhì)的預(yù)測潛質(zhì)，并逐一與NT-proBNP和hs-TnT進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，病例組NT-proBNP、hs-TnT、GDF-15、sFlt-1、PLGF、骨甘氨酸、TIMP-1、IBP-7、半乳糖凝集素-3、內(nèi)皮抑素、IBP-4含量均高于對照組(P<0.001)。值得注意的是，在心力衰竭病人中NT-proBNP比其他蛋白的漲幅更為明顯。因此，NT-proBNP可用于檢測心力衰竭，是較為可靠的生化標(biāo)志物。然而，就預(yù)后評價而言，一些新出現(xiàn)的蛋白似乎也同樣具有強(qiáng)大的優(yōu)勢，甚至比NT-proBNP更優(yōu)。

3.2 潛在生物標(biāo)志物的不同表現(xiàn) 研究發(fā)現(xiàn)，不同的蛋白質(zhì)在診斷和預(yù)后評價方面表現(xiàn)出明顯差異[12]。GDF-15是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的一員，在健康個體的心肌細(xì)胞中不表達(dá)[20]。在壓力條件下，GDF-15在心肌細(xì)胞中大量表達(dá)[21]。與其他標(biāo)志物相比，GDF-15顯示出最佳的診斷性能，但不如NT-proBNP。此外，GDF-15可獨(dú)立預(yù)測全因死亡、全因死亡或再住院治療聯(lián)合終點(diǎn)事件，并且略優(yōu)于NT-proBNP。因此，GDF-15是一種非常有潛力的心力衰竭標(biāo)志物。TIMP-1是內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)劑，在心力衰竭中，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑均失調(diào)，并對細(xì)胞外基質(zhì)的改變和心臟重塑具有一定作用[22]。在以前的研究中，血漿TIMP-1與慢性心力衰竭、左心室肥厚、心力衰竭有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1在慢性心力衰竭診斷和預(yù)后評價中具有一定的效能。因此，TIMP-1是多標(biāo)志物組的重要組成部分，可用于心力衰竭的預(yù)后。IBP-4是一種抗血管生成因子，本研究發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭病人中血漿IBP-4濃度顯著升高，并具有強(qiáng)大的長期預(yù)后評估效能。基于目前的結(jié)果， IBP-4可作為預(yù)后多標(biāo)志物的重要組分。半乳糖凝集素-3是心力衰竭的炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，引發(fā)間質(zhì)纖維化并因此重塑[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素-3是潛在的心力衰竭診斷和預(yù)后評價的標(biāo)志物。然而，半乳糖凝集素-3不可獨(dú)立地預(yù)測全因死亡、全因死亡或再住院治療聯(lián)合終點(diǎn)事件。

本研究還評估了內(nèi)皮抑素、IBP-7和骨甘氨酸在心力衰竭診斷和預(yù)后評價中的作用。骨甘氨酸是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞功能的小型富含白蛋白的蛋白多糖，在左心室質(zhì)量升高的大鼠模型中可以發(fā)現(xiàn)骨甘氨酸濃度增加[23]。雖然骨甘氨酸能夠在一定程度上診斷心力衰竭，但作用并不明顯。雖然抗血管生成因子IBP-7、內(nèi)皮抑素、sFLT-1 在心力衰竭診斷和預(yù)后評價中的作用明顯，但是在長期預(yù)后中并不能獨(dú)立預(yù)測全因死亡、全因死亡或再住院治療聯(lián)合終點(diǎn)事件，還不足以將內(nèi)皮抑素、IBP-7、sFLT-1和骨甘氨酸標(biāo)記納入心力衰竭標(biāo)志物多標(biāo)記模型。PLGF是急性心力衰竭而不是慢性心力衰竭的標(biāo)志物。

3.3 多標(biāo)記方法 在多標(biāo)記方法中，采用表現(xiàn)最好的3種潛在生物標(biāo)志物，即GDF-15、TIMP-1和IBP-4以及常見的標(biāo)志物NT-proBNP和hs-TnT。結(jié)果顯示，這5種標(biāo)志物的預(yù)測值隨著生物標(biāo)志物升高而增加，其含量的升高與死亡率相關(guān)。這5種生物標(biāo)志物的組合優(yōu)于NT-proBNP或hs-TnT單獨(dú)或聯(lián)合使用，預(yù)測3年以上事件發(fā)生率超過50%。該組合包括5種不同的心力衰竭病理學(xué)途徑，即神經(jīng)激素(NT-proBNP)、肌細(xì)胞損傷(hs-TnT)、肌細(xì)胞應(yīng)激(GDF-15)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑(TIMP-1)和抗血管生成(IBP -4)。此外，本研究也具有一定的局限性，慢性心力衰竭是眾多病因組成的一組綜合征，病因不同、發(fā)病機(jī)制也具有一定的差異性，這可能對相應(yīng)的血漿標(biāo)志物水平造成影響。綜上所述，本研究結(jié)果表明，在所有監(jiān)測的標(biāo)志物中，除PLGF和骨甘氨酸外，其他標(biāo)志物的表達(dá)量均隨癥狀嚴(yán)重程度和功能障礙逐步增加，同時也為慢性心力衰竭的診斷提供重要的預(yù)測信息。因此，對于不同病理生理學(xué)途徑的5種生物標(biāo)志物，其在心力衰竭的診斷中具有重要意義并且診斷性能優(yōu)于單一標(biāo)志物，所以臨床上可采用多標(biāo)記檢測方法進(jìn)一步提高心力衰竭的預(yù)測性能。