miR-138調(diào)控Akt/PI3K信號通路對缺氧缺糖誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響

李 敏，王紅艷，邵明陽

腦血管疾病是全球范圍內(nèi)的常見疾病，缺血性腦損傷是誘導(dǎo)組織神經(jīng)功能異常的重要原因。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，有研究發(fā)現(xiàn)，缺血能夠誘導(dǎo)大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，以神經(jīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性降低等為主要特點[1]。缺氧缺糖神經(jīng)細(xì)胞損傷模型是常見的體外研究模擬缺血損傷的經(jīng)典模型，在神經(jīng)科學(xué)的研究中廣泛應(yīng)用[2]。缺血神經(jīng)損傷的發(fā)生機制復(fù)雜，目前還不能完全闡明，已知其發(fā)生與基因的表達(dá)改變有關(guān)。microRNA(miRNA)是一個在人體內(nèi)具有多種生物學(xué)作用的調(diào)控因子，參與細(xì)胞生長、代謝、胚胎發(fā)育、細(xì)胞衰老等過程。很多研究表明，miRNA與疾病的進展有關(guān)，miRNA可能是疾病診斷以及治療的生物標(biāo)志物[3]。腦缺血神經(jīng)損傷的發(fā)生與多個miRNA的表達(dá)改變有關(guān)，這些miRNA可能成為缺血性腦損傷治療的分子靶標(biāo)[4]。miR-138具有多種功能，與人類腫瘤、糖尿病腎病等有關(guān)，其在不同的病理過程中的作用機制不同[5-6]。在大鼠腦缺血損傷中發(fā)現(xiàn)miR-138表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-138可以減輕腦組織損傷[7]。在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞損傷中發(fā)現(xiàn)，miR-138可以降低缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[8]。目前對miR-138在缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中的作用還不明確。本研究體外構(gòu)建缺氧缺糖神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，探討miR-138的作用和機制，以期為分子靶向治療缺血性腦損傷提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料 受孕16 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠購自山東省實驗動物中心。mimics control、miR-138 mimics購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miRNA 第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)含量測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax抗體、Bcl-2抗體均購自上?？道噬锟萍加邢薰荆涣姿峄鞍准っ窧(p-Akt)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)抗體購自上海鑫樂生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng) 細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[9]，取受孕16 d的SD大鼠，乙醚麻醉以后，用75%的乙醇消毒，將胎鼠取出并放在預(yù)冷后的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中洗滌，將血管、腦膜組織去除，取出大腦皮層組織，用PBS洗滌2次，用眼科剪將組織剪碎成1 mm3的碎塊，添加0.25%的胰蛋白酶消化10 min，添加細(xì)胞培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，1 000×g離心10 min，棄掉上清，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，接種到多聚賴氨酸包被以后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h以后，用含有10 mg/L 5-氟尿嘧啶的培養(yǎng)液培養(yǎng)，抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長。培養(yǎng)6 d后，經(jīng)烯醇化酶免疫熒光檢測鑒定為神經(jīng)細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞分組及缺氧缺糖處理 將大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞分成Control組、Model組、Model+miR-NC組、Model+miR-138組，Control組為空白對照細(xì)胞，Model組為缺氧缺糖模型細(xì)胞，Model+miR-NC組、Model+miR-138組分別為轉(zhuǎn)染mimics control、miR-138 mimics后的細(xì)胞經(jīng)缺氧缺糖處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進行。缺氧缺糖處理方法如下：用不含糖的PBS溶液將細(xì)胞洗滌2次，然后加入不含糖的DMEM培養(yǎng)液，放在37 ℃、95% N2和5%CO2培養(yǎng)箱中混合培養(yǎng)90 min，即為缺氧缺糖處理，然后用PBS將細(xì)胞洗滌2次，加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)檢測。

1.2.3 qRT-PCR方法測定miR-138表達(dá) 用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，將RNA溶解在50 μL的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，-80 ℃保存。用miRNA 第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 2 μg、2×miRNA RT Solution mix 10 μL、miRNA RT Enzyme mix 2 μL，添加RNase-free water至20 μL，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min。用miRNA qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系：正向和反向引物各0.5 μL，2×miRNA qPCR master mix 10 μL，cDNA 2 μL，添加RNase-free water至20 μL，PCR反應(yīng)條件為：37 ℃孵育1 min，95 ℃孵育5 s，56 ℃孵育30 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束以后，按照2-△△Ct法計算miR-138表達(dá)變化，內(nèi)參為U6。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定細(xì)胞活性 取出各組細(xì)胞，在每個孔中添加10 μL的MTT溶液，放在37 ℃條件下孵育4 h。取出培養(yǎng)板，將孔中的上清液棄掉，添加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，反應(yīng)10 min以后，用酶標(biāo)儀測定每個孔在波長570 nm的A值，A值越大代表細(xì)胞活性越高。

1.2.5 LDH釋放水平檢測 收集細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用LDH含量測定試劑盒檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液上清中LDH水平，計算LDH釋放率。LDH釋放率=100%×上清LDH水平/(上清液LDH水平+細(xì)胞內(nèi)LDH水平)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷以后的PBS溶液洗滌2次，添加結(jié)合緩沖液200 μL將細(xì)胞懸浮，繼續(xù)添加Annexin V-FITC溶液5 μL，然后添加聚酰亞胺(PI)溶液5 μL，放在室溫避光條件下孵育15 min。在用流式細(xì)胞儀檢測前再添加300 μL的結(jié)合緩沖液。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Bax、Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá) 將細(xì)胞孔內(nèi)的上清液洗掉，然后加入PBS洗滌細(xì)胞2次，添加細(xì)胞裂解溶液，在冰上裂解30 min，4 ℃，10 000×g離心10 min，將上清液吸取至EP管內(nèi)保存。配制并灌注10%的分離膠以及5%的濃縮膠。在蛋白上清液中添加2×上樣緩沖液，放在100 ℃環(huán)境中孵育5 min。吸取30 μg的蛋白樣品添加到SDS-PAGE上樣孔內(nèi)，設(shè)置在濃縮膠中電泳電壓為80 V，在分離膠中電泳電壓為100 V。用濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流設(shè)置為250 mA。轉(zhuǎn)膜結(jié)束以后，將硝酸纖維素膜(NC)取出，放在含有5%牛血清白蛋白的封閉液中孵育結(jié)合2 h。硝酸纖維素膜置于含有一抗稀釋液的平皿中，在4 ℃條件過夜培養(yǎng)。硝酸纖維素膜放在含有二抗稀釋液的平皿內(nèi)，在室溫結(jié)合2 h。按照增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色試劑盒顯色，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白的表達(dá)變化，內(nèi)參設(shè)置為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.2.8 蛋白激酶B(Akt)/PI3K信號通路抑制劑對miR-138水平及神經(jīng)細(xì)胞活性影響檢測 轉(zhuǎn)染miR-138 mimics后的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞在缺氧缺糖處理及繼續(xù)培養(yǎng)的24 h內(nèi)，均在細(xì)胞中添加終濃度為1 μmol/L的Akt/PI3K信號通路抑制劑LY294002，記為Model+miR-138+LY294002組，以Model+miR-138組作為參照。

2 結(jié) 果

2.1 上調(diào)miR-138對缺氧、缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞活性和LDH釋放率影響 與Control組比較，Model組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中miR-138水平降低，神經(jīng)細(xì)胞活性下降，細(xì)胞LDH釋放率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Model+miR-NC組比較，Model+miR-138組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中miR-138水平升高，神經(jīng)細(xì)胞活性升高，LDH釋放率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示miR-138 mimics上調(diào)缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中miR-138表達(dá)水平，提高神經(jīng)細(xì)胞活性并減少LDH釋放。詳見表1。

表1 4組大鼠miR-138水平、神經(jīng)細(xì)胞活性和LDH釋放率比較(±s)

2.2 上調(diào)miR-138對缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Bax、Bcl-2蛋白的影響 與Control組比較，Model組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Model+miR-NC組比較，Model+miR-138組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示上調(diào)miR-138可減少缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡。詳見圖1、圖2及表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測定大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化

圖2 Western Blot檢測大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 上調(diào)miR-138對缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞Akt/PI3K信號通路的影響 與Control組比較，Model組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Model+miR-NC組比較，Model+miR-138組細(xì)胞p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示上調(diào)miR-138可促進缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞Akt/PI3K信號激活。詳見圖3及表3。

圖3 Western Blot檢測大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)

表3 4組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.4 Akt/PI3K信號抑制劑對上調(diào)miR-138缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中Akt/PI3K信號通路的影響 與Model+miR-138組比較，Model+miR-138+LY294002組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。提示Akt/PI3K信號抑制劑可降低上調(diào)miR-138的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞在缺氧缺糖條件下細(xì)胞中Akt/PI3K信號通路激活水平。詳見圖4及表4。

圖4 Western Blot檢測大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)

表4 Model+miR-138組、Model+miR-138+LY294002組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.5 Akt/PI3K信號通路抑制劑對上調(diào)miR-138缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用 與Model+miR-138組比較，Model+miR-138+LY294002組神經(jīng)細(xì)胞活性降低，LDH釋放率、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示Akt/PI3K信號抑制劑可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-138對缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞活性、LDH釋放和細(xì)胞凋亡的影響。詳見圖5、圖6及表5。

表5 Model+miR-138組、Model+miR-138+LY294002組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞活性(A值)、LDH水平、細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較(±s)

圖6 Western Blot檢測Model+miR-138組、Model+miR-138+LY294002組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)測定Model+miR-138組、Model+miR-138+LY294002組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率

3 討 論

缺血誘導(dǎo)的腦組織損傷是致死和致殘的重要原因之一，缺血條件下，神經(jīng)細(xì)胞活性異常降低，細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致神經(jīng)組織完整結(jié)構(gòu)破壞，進而影響正常神經(jīng)功能，缺氧缺糖神經(jīng)細(xì)胞損傷模型是常見的研究缺血神經(jīng)損傷的體外實驗?zāi)Ｐ蚚2]。正常情況下，LDH多存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到外界有害刺激以后，存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH進入細(xì)胞外，因此，檢測細(xì)胞釋放的LDH水平可以間接反映細(xì)胞損傷程度[10]。Bax、Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族成員，二者在細(xì)胞凋亡過程中分別發(fā)揮促進或抑制作用，Bax、Bcl-2的表達(dá)改變也被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡變化的標(biāo)志[11]。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺糖的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞活性降低，LDH釋放率、細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，提示缺氧缺糖可誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與之前的研究結(jié)果一致。

miRNA是一種內(nèi)源性的小分子RNA，因不具備開放閱讀框而不能編碼蛋白質(zhì)。miRNA功能廣泛，其可以通過多種調(diào)控機制或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響細(xì)胞生命進程，miRNA在不同的組織或細(xì)胞中的作用機制不同[12]。miRNA參與疾病發(fā)生，在腫瘤、心腦血管系統(tǒng)疾病等多種疾病中已經(jīng)證實了有多個miRNA的調(diào)控作用，這些miRNA影響著疾病相關(guān)細(xì)胞的生物學(xué)特性，miRNA是疾病治療的潛在分子標(biāo)志物[13-14]。miR-138在人體內(nèi)的多個組織中表達(dá)，并且具有多種生物學(xué)作用[15]。miR-138參與腫瘤細(xì)胞的惡性生長和轉(zhuǎn)移，在骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中發(fā)揮作用[5，16-17]。研究表明，miR-138能夠減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[18]。miR-138在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可以減輕腦組織損傷[7]。miR-138還具有保護神經(jīng)干細(xì)胞缺氧損傷的作用[8]。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中miR-138表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-138可以提高缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞活性，減少LDH釋放，抑制細(xì)胞凋亡，提示上調(diào)miR-138具有改善缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。

Akt/PI3K信號通路存在于人體內(nèi)的各組織和不同類型的細(xì)胞中，參與細(xì)胞的生長、衰老、分化、運動、凋亡等過程[19]。Akt、PI3K的磷酸化水平升高后可以促進Akt/PI3K信號的激活[20]。研究認(rèn)為，Akt/PI3K信號在不同的病理或生理進程中的作用不同，這可能與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控作用有關(guān)[21]。以往的研究表明，Akt/PI3K信號在缺氧誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元損傷中激活水平下降，而激活A(yù)kt/PI3K信號通路具有保護神經(jīng)元損傷的作用[22]。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺糖條件下大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞中Akt/PI3K信號通路激活水平下降，上調(diào)miR-138能夠促進細(xì)胞中Akt/PI3K信號通路激活，并且Akt/PI3K信號通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)miR-138對缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞保護作用，提示上調(diào)miR-138可以通過激活A(yù)kt/PI3K信號通路改善缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，miR-138在缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護作用，其作用機制與激活A(yù)kt/PI3K信號通路有關(guān)。本實驗不僅為研究缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷機制提供了參考，而且為靶向基因治療缺血腦神經(jīng)細(xì)胞損傷提供了思路。