替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死大鼠心肌復(fù)極時(shí)間、心肌細(xì)胞凋亡的影響

潘治峰，蘇長(zhǎng)海，郭 敏

心肌梗死疾病的發(fā)生主要與冠狀動(dòng)脈持續(xù)性缺血缺氧存在一定的關(guān)系，從而引起機(jī)體心肌組織出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象[1]。有研究認(rèn)為，心肌梗死疾病早期階段，心肌細(xì)胞凋亡在其中發(fā)揮著主要的作用，初步表明在心肌梗死疾病早期，通過(guò)予以相關(guān)干預(yù)手段阻止心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)于改善心肌梗死疾病的發(fā)展具有極其重要的作用[2-3]。替羅非班常被用于預(yù)防或者治療因冠狀動(dòng)脈閉塞而導(dǎo)致的心肌梗死[4]。黃芪注射液的主要成分為黃芪，黃芪具有活血化瘀之功效，主要通過(guò)改善微循環(huán)、抑制血小板聚集，從而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用[5-7]。前期研究證實(shí)，心肌細(xì)胞復(fù)極障礙為心肌梗死疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的病理機(jī)制之一[8]。但是替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死病人心肌細(xì)胞復(fù)極障礙的作用尚且不明確。本研究主要探討替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死大鼠心肌復(fù)極時(shí)間、心肌凋亡的改善作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 替羅非班、黃芪注射液、利多卡因均購(gòu)自北京和豐堂醫(yī)藥，青霉素、肝素、水合氯醛均購(gòu)自蘇州啟航生物科技有限公司，一抗(1∶100 Bcl-2、Bax)購(gòu)自Santa公司，細(xì)胞裂解液、10×封閉-洗滌緩沖液(TBST)均購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司。彩色多普勒超聲診斷儀(邁瑞醫(yī)療器械公司)、EGG TUNNEL心電儀(北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司)、負(fù)壓抽吸器(天津市同業(yè)科技發(fā)展有限公司)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及分組 選取SD(Sprague Dawley)大鼠30只，均為雌性，體質(zhì)量200～250 g，許可證號(hào)：scxk(京)2002-0003，環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度50%～60%。所有大鼠均采用自由飲水和進(jìn)食的方式。隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、藥物治療組，各組10只。假手術(shù)組大鼠在進(jìn)行手術(shù)的過(guò)程中不進(jìn)行其他任何處理；對(duì)照組大鼠在模型制作成功后，予以適量的生理鹽水；藥物治療組大鼠在模型制作成功后，予以替羅非班聯(lián)合黃芪注射液進(jìn)行干預(yù)，黃芪注射液劑量為1.2 g/(kg·d)，替羅非班劑量為5 mg/(kg·d)。

1.3 動(dòng)物模型的制作[9]對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉處理，同時(shí)予以消毒。在大鼠軟骨環(huán)間進(jìn)行切開(kāi)操作，鈍性分離，再將大鼠的氣管完全暴露處理，并予以氣管插管。在小鼠胸部肋下做切口，分離筋膜，暴露胸骨，同時(shí)暴露心臟組織，分離心包，采用棉簽分離胸腺組織，準(zhǔn)確尋找左冠狀靜脈，再以左冠狀靜脈作為標(biāo)志，采用7-0縫線進(jìn)行結(jié)扎處理，同時(shí)觀察心肌組織變化情況，手術(shù)結(jié)扎成功的標(biāo)志是大鼠存在兩個(gè)肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高0.2 mV。觀察心臟是否出現(xiàn)出血，如果無(wú)出血，清洗胸腔，并進(jìn)行縫合處理，關(guān)胸前行負(fù)壓抽吸。術(shù)后如果出現(xiàn)心肌梗死、心律失常癥狀，需要予以適量的利多卡因注射液。約30 min后，觀察大鼠情況，如果出現(xiàn)吞咽動(dòng)作，立即拔除氣管，逐層縫合組織。同時(shí)術(shù)后予以抗菌藥物青霉素預(yù)防感染。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 心功能檢測(cè) 造模結(jié)束后，于6周末，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。同時(shí)經(jīng)主動(dòng)脈取血，靜置30 min后分離血漿。

1.4.2 心電圖檢測(cè) 各組大鼠進(jìn)行干預(yù)以后，再將各組大鼠置于EGG TUNNEL心電儀上檢測(cè)，及時(shí)記錄大鼠6導(dǎo)聯(lián)體表心電圖，采用ECG Auto分析數(shù)據(jù)，主要指標(biāo)包括PR、QRS、QT、QTc間期。

1.4.3 心臟標(biāo)本的獲取并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察 脫臼處死大鼠，取各組大鼠心肌組織，進(jìn)行HE染色，觀察各組心肌組織的病理學(xué)變化情況。

1.4.4 心肌細(xì)胞動(dòng)作電位 模型制作成功并進(jìn)行藥物干預(yù)后，開(kāi)始檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位，首先腹腔注射適量的肝素溶液，20 min后再予以適量的水合氯醛溶液，獲取各組大鼠心臟、主動(dòng)脈，清洗，灌流，再灌注適量的消化溶液，10 min后使其達(dá)到心室松軟。再取左室心肌組織，剪碎，吹打，過(guò)濾，分離心肌細(xì)胞，采用電流鉗模式檢測(cè)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位，設(shè)置參數(shù)：電阻為2～3 MΩ，灌流液濃度為1.8 mmol/L，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在室溫的環(huán)境下進(jìn)行。電阻>2.0 GΩ以后，采用負(fù)壓抽吸器進(jìn)行抽吸，-80 mV時(shí)，同樣采用電流鉗模式給予電流，并誘發(fā)相關(guān)電位的發(fā)生，記錄以下指標(biāo)，即靜息電位(RP)、動(dòng)作電位幅值(APA)、動(dòng)作電位復(fù)極至50%的時(shí)程(APD50)及動(dòng)作電位復(fù)極至90%的時(shí)程(APD90)。

1.4.5 脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(C-PARP) 取上述心肌組織，并進(jìn)行固定，脫水，石蠟包埋，切片，于烤箱烤10 min，再予以適量的二甲苯、乙醇溶液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行清洗，此后步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，結(jié)束后，隨機(jī)取梗死區(qū)域10個(gè)視野，計(jì)算C-PARP。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取上述心肌組織，胰酶溶液消化，離心，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞接種以后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，貼壁到90%左右開(kāi)始檢測(cè)其蛋白表達(dá)。先通過(guò)適量的PBS清洗，再通過(guò)適量的細(xì)胞裂解液進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間，開(kāi)始進(jìn)行離心操作，將下層沉淀清理干凈，取上層溶液。開(kāi)始進(jìn)行蛋白定量操作，結(jié)束以后，將蛋白樣本放置在-20 ℃冰箱內(nèi)，取出蛋白樣本，進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移，過(guò)夜，分別加入適量的一抗(1∶100 Bcl-2、Bax)、二抗進(jìn)行孵育，再通過(guò)適量的10×封閉-洗滌緩沖液清洗，曝光、顯影、成像。調(diào)整曝光時(shí)間，確定最佳的條帶。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)心肌組織中Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA水平表達(dá) 從上述各組細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增。95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算2-△△Ct。詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心功能和心電圖指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，藥物治療組和假手術(shù)組EF、FS升高(P<0.05)，LVESD、LVEDD降低(P<0.05)，藥物治療組EF、FS、LVESD、LVEDD與假手術(shù)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，藥物治療組和假手術(shù)組QRS、QT、QTc明顯縮短(P<0.05)，藥物治療組QRS、QT、QTc與假手術(shù)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組PR比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2、表3。

表2 3組大鼠心功能比較(±s)

表3 3組大鼠心電圖指標(biāo)比較(±s) 單位：ms

2.2 3組大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位比較 3組APD50、RP、APA比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與對(duì)照組比較，藥物治療組和假手術(shù)組APD90縮短(P<0.05)，藥物治療組APD90與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1、表4。

圖1 3組大鼠動(dòng)作電位曲線圖

表4 3組大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位比較(±s)

2.3 3組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列比較有規(guī)則，并且細(xì)胞核明顯，核大小比較均勻；對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，其細(xì)胞核附近具有明顯的空泡性病變，細(xì)胞具有明顯的壞死現(xiàn)象，并伴有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；藥物治療組大鼠心肌細(xì)胞與對(duì)照組比較，改善效果顯著。詳見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果(a為假手術(shù)組；b為對(duì)照組；c為藥物治療組)

2.4 3組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax蛋白、C-PARP比較 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)最高，藥物治療組次之，對(duì)照組最低，藥物治療組、假手術(shù)組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，藥物治療組、假手術(shù)組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TUNEL染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組C-PARP最低，藥物治療組次之，對(duì)照組最高，藥物治療組、假手術(shù)組C-PARP低于對(duì)照組(P<0.05)，藥物治療組C-PARP高于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4及表5。

圖3 Western Blot檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(a為假手術(shù)組；b為對(duì)照組；c為藥物治療組)

圖4 Western Blot檢測(cè)C-PARP(a為假手術(shù)組；b為對(duì)照組；c為藥物治療組)

0.05。

2.5 3組大鼠心肌組織Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達(dá)比較 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物治療組和假手術(shù)組心肌組織中Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，藥物治療組和假手術(shù)組心肌組織中Fas mRNA、Fas-L mRNA表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，藥物治療組心肌組織中p53 mRNA表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 3組大鼠心肌組織Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

本研究主要探討替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死大鼠心肌復(fù)極時(shí)間、心肌凋亡的改善作用及可能存在的作用機(jī)制。制作心肌梗死動(dòng)物模型，從動(dòng)物水平進(jìn)行研究，首先觀察了各組大鼠心功能和心電圖的改善情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，藥物治療組大鼠心功能和心電圖均具有明顯的改善效果，且與假手術(shù)組大鼠比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芪注射液發(fā)揮作用的途徑主要通過(guò)清除氧自由基，進(jìn)一步減少相關(guān)脂質(zhì)過(guò)氧化物，改善大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而對(duì)其心肌發(fā)揮保護(hù)作用，以及對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)和超氧化物歧化酶(SOD)活性發(fā)揮保護(hù)作用，縮小心肌梗死面積，最終發(fā)揮改善心功能的效果；另外結(jié)合替羅非班藥物，效果更加明顯，因?yàn)樘媪_非班可通過(guò)控制心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平發(fā)揮對(duì)心功能的改善作用，另外還可以通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步分泌一氧化氮，從而改善局部灌注，減少心肌灌注損傷，最終發(fā)揮對(duì)心功能的改善作用[10-12]。

有研究表明，存在多種因素均能夠?qū)е滦募?fù)極障礙的產(chǎn)生，如蛋白酶的激活、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)障礙等，從而進(jìn)一步參與心肌梗死病理過(guò)程[13]。本研究主要通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位預(yù)測(cè)心肌復(fù)極障礙的產(chǎn)生，結(jié)果顯示，3組APD50、RP、APA比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較，藥物治療組和假手術(shù)組APD90明顯縮短，藥物治療組和假手術(shù)組APD90比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明替羅非班聯(lián)合黃芪注射液能夠在一定程度上縮短心肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)間，從而進(jìn)一步改善心肌細(xì)胞復(fù)極障礙。分析其原因：替羅非班聯(lián)合黃芪注射液可能通過(guò)抑制L型鈣通道蛋白磷酸化過(guò)程，進(jìn)一步抑制L型鈣電流發(fā)生重構(gòu)；也可能通過(guò)抑制肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白磷酸化過(guò)程，進(jìn)一步對(duì)心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程產(chǎn)生影響，抑制復(fù)極期心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，最終減少鈉鈣交換體的電流；也可能通過(guò)抑制晚鈉通道磷酸化過(guò)程，從而進(jìn)一步降低復(fù)極3期的電流[14-16]。另外也有研究認(rèn)為，心肌梗死模型中鉀通道蛋白水平異常下降，其密度減小，引起外向電流明顯減小[17]，從側(cè)面進(jìn)一步論證上述猜測(cè)。

Bcl-2/Bax比值主要參與心肌細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2主要發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用，Bax主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比值一定程度上決定了細(xì)胞區(qū)域是否是凋亡或者存活狀態(tài)[19]。有研究認(rèn)為，心肌梗死過(guò)程中心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值明顯下降[20]。Fas、Fas-L之間可相互作用，進(jìn)一步激活Caspases-8、Caspases-3信號(hào)通路的活性程度，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[21]。本研究進(jìn)一步探討替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的改善作用，結(jié)果顯示，假手術(shù)組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)最高，藥物治療組次之，對(duì)照組最低；假手術(shù)組C-PARP最低，藥物治療組次之，對(duì)照組最高；藥物治療組和假手術(shù)組心肌組織Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組。分析其原因：替羅非班聯(lián)合黃芪注射液可能通過(guò)介導(dǎo)p53通路途徑，抑制心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，也可能通過(guò)抑制Caspases-8、Caspases-3信號(hào)通路的活性程度，抑制心肌細(xì)胞凋亡[22-24]。與Vasudevan等[25]的研究結(jié)果具有一致性。

綜上所述，替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死大鼠心肌復(fù)極時(shí)間、心肌凋亡具有明顯的改善作用，其中心肌凋亡的改善作用與下調(diào)心肌細(xì)胞凋亡蛋白Fas、Fas-L、p53、Bcl-2/Bax表達(dá)有關(guān)，心肌復(fù)極時(shí)間的改善作用與晚鈉通道磷酸化抑制作用有關(guān)。替羅非班聯(lián)合黃芪注射液能夠?qū)е滦募〖?xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)間縮短，抑制異常觸發(fā)活動(dòng)的產(chǎn)生，但是具體可能存在的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。