干擾miR-148a-5p對腫瘤壞死因子-α誘導血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響

陳 愿，趙子明，宋 爽，崔留義，李傳榮，楊曉航，沈 蕾，劉乾坤

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，是多種心血管疾病的主要病理基礎[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是構成血管壁結構的主要細胞成分，同時還參與維持血管張力。VSMC具有低增殖和低遷移的特征，在受到外界刺激后分化為高增殖和遷移特性的分泌型細胞，引發(fā)管腔重塑和狹窄，導致AS的發(fā)生[2]。因此，降低VSMC向內膜的遷移和增殖是預防和治療AS的關鍵。微小RNA(microRNA，miRNA)長度為18～25個核苷酸，參與調控細胞的增殖、凋亡、遷移等生命學過程，在人類心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-5]。研究已表明，miR-96-5p[6]、miR-3646[7]等多種miRNA在AS疾病中異常表達，參與調控VSMC的增殖和遷移。有報道稱，動脈粥樣硬化病人血清中miR-148a-5p的表達明顯升高[8]，但目前，miR-148a-5p對VSMC增殖和遷移的影響還未見相關報道。本研究通過體外培養(yǎng)人主動脈VSMC，探討干擾miR-148a-5p對腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)誘導VSMC增殖和遷移的影響，以期為AS的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人主動脈VSMC購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基、細胞周期檢測試劑盒、膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，miR-148a-5p 模擬物(mimcs)及模擬陰性序列(miR-NC)、miR-148a-5p抑制劑(anti-miR-148a-5p)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司，Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，細胞核增殖抗原Ki67、上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏附蛋白(N-cadherin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 復蘇VSMC，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、二氧化碳(CO2)體積分數5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。待細胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。取對數生長期的VSMC，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換無血清培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明，將anti-miR-148a-5p、anti-miR-NC分別轉染至VSMC。轉染6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組 以每孔2.5×104個細胞接種于24孔板中。未進行轉染的VSMC分為對照組和TNF-α組，對照組細胞正常培養(yǎng)，TNF-α組細胞用含TNF-α終濃度為100 μg/L[9]的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉染anti-miR-NC、anti-miR-148a-5p的細胞用含TNF-α終濃度為100 μg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別作為TNF-α+anti-miR-NC組和TNF-α+anti-miR-148a-5p組。每組設置3個復孔。各組細胞培養(yǎng)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，進行相應檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細胞中miR-148a-5p表達 采用Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，微量核算儀對RNA的純度和濃度進行檢測。參照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，行PCR擴增。PCR擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。miR-148a-5p正向引物5′-GCTGGCCGAACGTGCGTAGCT-3′，反向引物5′-CGTGAAGCTGCTGTACCCTGC-3′；U6正向引物5′-CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-AATATGGAAC-GCTTCACGA-3′。以U6為內參，2-△△Ct法計算miR-148a-5p相對表達水平。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 收集各組培養(yǎng)后的細胞，調整細胞濃度為每孔1.0×106個/mL。取1 mL細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清。細胞中加入500 μL預冷的70%乙醇，4 ℃固定過夜，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清。加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗細胞，1 000 r/min離心5 min，吸棄PBS。加入100 μL RNase A溶液，重懸細胞，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL碘化丙啶，混合均勻，4 ℃避光孵育30 min，上機檢測。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組培養(yǎng)后的細胞，調整細胞濃度為每孔1.0×106個/mL。取1 mL細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清。細胞中加入1.0 mL預冷的PBS，輕輕振蕩式細胞懸浮，1 000 r/min離心5 min，吸棄PBS。加入200 μL 結合緩沖液(binding buffer)，重懸細胞。加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL 碘化丙啶，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。再加入300 μL binding buffer，1 h內使用流式細胞儀檢測。

1.2.6 Transwell檢測細胞遷移 細胞用不含FBS的DMEM培養(yǎng)基調整濃度為5×104個/mL。Transwell小室置于24孔板中，上室加入100 μL細胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。按照1.2.2中分組方法處理。培養(yǎng)結束后，吸棄培養(yǎng)基，取出小室。4%多聚甲醛固定30 min，棉簽擦去上室上層細胞，0.4%結晶紫染色15 min。倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，對遷移細胞進行計數。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測細胞中Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達 收集各組培養(yǎng)后的細胞，加入預冷的PBS清洗細胞，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清。細胞中加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液，置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清即為提取蛋白。采用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度后進行定量，取適量蛋白溶液，加入1×上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，將分離的蛋白質濕轉至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，于5%脫脂奶粉中封閉1 h。分別加入Ki67(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 500)、N-cadherin(1∶1 500)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。Tris緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗 生物信息學軟件預測顯示，蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)與miR-148a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)的結合位點。使用PCR技術擴增含miR-148a-5p結合位點PTEN的3′UTR序列，構建PTEN野生型熒光素酶報告載體(WT-PTEN)。利用基因突變技術突變結合位點，構建PTEN突變型熒光素酶報告載體(MUT-PTEN)。取對數生長期的VSMC，分別作為miR-148a-5p組、miR-NC組，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換無血清培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明，分別將WT-PTEN、MUT-PTEN與miR-148a-5p mimic或miR-NC共轉染至VSMC。轉染6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測兩組的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 TNF-α對VSMC中miR-148a-5p表達的影響 與對照組比較，TNF-α組細胞中miR-148a-5p的表達水平明顯升高(P<0.05)。與TNF-α+anti-miR-NC組比較，TNF-α+anti-miR-148a-5p組細胞中miR-148a-5p的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組VSMC中miR-148a-5p表達比較(±s)

2.2 干擾miR-148a-5p對TNF-α誘導的VSMC增殖的影響 與對照組比較，TNF-α組細胞G0/G1期明顯降低(P<0.05)，S期明顯升高(P<0.05)，G2/M期無明顯變化(P>0.05)。與TNF-α+anti-miR-NC組比較，TNF-α+anti-miR-148a-5p組細胞G0/G1期明顯升高(P<0.05)，S期明顯降低(P<0.05)，G2/M期無明顯變化(P>0.05)。詳見表2。

表2 4組細胞周期比較(±s) 單位：%

2.3 干擾miR-148a-5p對TNF-α誘導的VSMC遷移的影響 與對照組比較，TNF-α組細胞遷移數明顯增加(P<0.05)。與TNF-α+anti-miR-NC組比較，TNF-α+anti-miR-148a-5p組細胞遷移數明顯減少(P<0.05)。詳見表3。

表3 4組細胞遷移情況比較(±s) 單位：個

2.4 干擾miR-148a-5p對TNF-α誘導的VSMC中Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響 與對照組比較，TNF-α組細胞中Ki67和N-cadherin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與TNF-α+anti-miR-NC組比較，TNF-α+anti-miR-148a-5p組細胞中Ki67和N-cadherin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。詳見圖1及表4。

圖1 4組VSMC中Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達條帶圖

表4 4組VSMC中Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達比較(±s)

2.5 miR-148a-5p靶向PTEN 生物信息學軟件預測顯示，PTEN的3′UTR與miR-148a-5p含有連續(xù)互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告基因結果顯示，與共轉染WT-PTEN的miR-NC組比較，共轉染WT-PTEN的miR-148a-5p組熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與共轉染MUT-PTEN的miR-NC組比較，共轉染MUT-PTEN的miR-148a-5p組熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。詳見圖2及表5。

圖2 PTEN的3′UTR區(qū)含有miR-148a-5p的互補序列

表5 兩組雙熒光素酶報告實驗結果比較(±s)

3 討 論

隨著社會老齡化的加劇，AS的發(fā)病率逐年升高[10]。正常情況下，VSMC位于血管壁中層，維持血管壁張力及通過改變血管腔的大小調節(jié)機體或器官的血流量。血管受損時，內皮細胞首先發(fā)生改變，繼而單核細胞、巨噬細胞堆積，產生各種生長因子、炎性因子和細胞因子，這些因子可刺激VSMC發(fā)生表型轉化。隨著病變過程的發(fā)展，VSMC發(fā)生增殖并向血管內膜遷移，最終導致動脈粥樣硬化斑塊的形成[11]。因此，VSMC的異常增殖和遷移是AS發(fā)生發(fā)展的重要因素。TNF-α是一種炎性細胞因子，可通過與腫瘤壞死因子受體(TNFR)結合，激活核轉錄因子(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、應激活化蛋白激酶(JNK)等多條信號通路，調節(jié)細胞的增殖和遷移等過程[12]。本研究結果顯示，TNF-α誘導VSMC后，VSMC增殖和遷移能力增加，與相關報道結果[9]一致，表明TNF-α可誘導VSMC增殖和遷移。

miRNA在真核生物中廣泛存在，研究表明，多種miRNA參與調控VSMC增殖和遷移，是預防和治療AS等心血管疾病的分子靶點。miR-145可通過下調基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抑制TNF-α誘導的大鼠腦動脈VSMC增殖和遷移[13]。miR-126在氧化型低密度脂蛋白處理的人主動脈VSMC表達降低，上調其表達可通過調控MAPK信號通路抑制細胞增殖和遷移[14]。miR-155在AS病人中表達升高，干擾其表達可有效抑制TNF-α誘導的VSMC增殖和遷移，為AS的治療提供新的靶點[15]。但目前miR-148a-5p對VSMC增殖和遷移的影響還未知。

本研究首先采用RT-qPCR技術檢測了TNF-α對VSMC中miR-148a-5p表達的影響，結果顯示，TNF-α可促進VSMC中miR-148a-5p的表達，提示miR-148a-5p可能參與TNF-α誘導的VSMC增殖和遷移。通過轉染miR-148a-5p抑制劑干擾miR-148a-5p表達后，TNF-α誘導的VSMC細胞周期G1/S期阻滯，遷移細胞數降低，與相關報道結果[15]一致，表明干擾miR-148a-5p表達可有效抑制TNF-α誘導的VSMC增殖和凋亡。Ki67與有絲分裂密切相關，是細胞增殖的標志性蛋白。本研究結果顯示，干擾miR-148a-5p表達可降低TNF-α誘導的VSMC中Ki67蛋白表達，提示干擾miR-148a-5p表達通過抑制Ki67蛋白表達降低TNF-α誘導的VSMC增殖。E-cadherin是維持細胞與細胞間連接的重要蛋白，其表達缺失或降低可促進細胞遷移[16]。而N-cadherin與E-cadherin作用相反，其表達增加使細胞間黏附作用減弱，易于細胞遷移[17]。本研究結果顯示，干擾miR-148a-5p表達后，TNF-α誘導的VSMC中E-cadherin蛋白表達升高，而N-cadherin蛋白表達降低，說明干擾miR-148a-5p可能通過促進E-cadherin蛋白表達和抑制N-cadherin蛋白表達來降低TNF-α誘導的VSMC遷移能力。

miRNA常與靶基因mRNA的3′UTR通過堿基互補配對結合，抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，參與調控從而參與細胞增殖、凋亡和遷移等多種生理或病理過程[18]。生物信息學軟件預測顯示，PTEN的3′UTR與miR-148a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)的結合位點，且雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-148a-5p模擬物可降低PTEN野生型的熒光素酶活性，表明PTEN是miR-148a-5p的靶基因。PTEN基因位于染色體10q23.3，具有編碼雙重特異性磷酸酶產物的特性，參與調控細胞增殖、分化和遷移等生物學行為，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[19]。研究顯示，抑制PTEN可促進氧化低密度脂蛋白誘導的主動脈VSMC增殖和遷移[20]；PTEN在冠心病小鼠VSMC中表達降低，上調PTEN表達可抑制VSMC增殖，并促進VSMC凋亡[21]。miR-148a-5p是否是通過靶向調控PTEN表達影響TNF-α誘導的VSMC增殖和遷移還有待進一步探究。

綜上所述，TNF-α可促進VSMC增殖和遷移，且促進細胞中miR-148a-5p表達。干擾miR-148a-5p表達可有效降低TNF-α誘導的VSMC增殖和遷移，但其具體的作用機制還需要進一步探究，miR-148a-5p可能是AS治療的潛在分子靶點。