非洲豬瘟檢測中的常見問題與分析

孫華偉

（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)診斷檢測重點實驗室，江蘇 南京 210014）

國內豬病實驗室從2010年的“懵懂”，2015年的“發(fā)展”到2018年的“普及”，給我國豬病診斷及防控工作帶來了巨大幫助。尤其是在2018年8月非洲豬瘟（ASF）暴發(fā)后，實驗室檢測在ASF精準剔除（拔牙）、后ASF時代豬瘟、豬藍耳病等重大疫病的監(jiān)測評估、診斷防控及凈化中必將發(fā)揮重大作用。

1 熒光PCR檢測的原理

熒光PCR（Q-PCR）是利用熒光信號的變化，實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化[1]。在Q-PCR反應過程中，每經(jīng)過一個循環(huán)，PCR產(chǎn)物量增加，相應的熒光信號強度也跟著增加，此時收集一個熒光強度信號。經(jīng)過若干個循環(huán)后，可以得到一條以循環(huán)數(shù)（CT）為橫坐標和熒光強度變化為縱坐標的“S”形熒光擴增曲線。理論上講經(jīng)過n個循環(huán)之后，模板量就會達到2的n次方。見圖1。

2 常見問題分析

2.1 檢測結果出現(xiàn)“翹尾”，怎么處理？

首先按照要求進行復查，復查建議重新采樣。如果不方便重新采樣建議對原有樣本重新進行提取核酸驗證，如果復查為陰性則判讀陰性；如果復查還是出現(xiàn)“翹尾”，就要對結果仔細審核。一是要排除實驗室污染，二是要對病豬信息了解清楚，從臨床癥狀排查，如果仍沒法確認，建議必須重新采樣復查，如有必要可以采用另一種試劑來驗證。如果出現(xiàn)大量的弱陽性擴增翹尾，首要原因是考慮實驗室被污染，可以通過做環(huán)境樣本和陰性對照做驗證排除。見圖2。

圖2 檢測結果出現(xiàn)大量的弱陽性擴增翹尾

2.2 非洲豬瘟檢測結果和臨床診斷不符合，怎么解讀？

首先要明白“檢驗結果與臨床不符”并非一個客觀的評價，而是一種主觀感覺，來源于個人的經(jīng)驗判斷。因此并不一定就是結果有誤，可能有其他方面的原因。之所以會這樣，主要是由于對“不符”的來源認識不夠全面，不知道除了熟悉的實驗室環(huán)節(jié)以外，還有哪些方面要去分析？只有對造成不符的原因有一個比較系統(tǒng)的認識，才能做到有的放矢。下面簡要介紹可能出現(xiàn)的原因：

2.2.1時間因素

非洲豬瘟病毒的感染有一個發(fā)生發(fā)展的過程，如果檢測時正好處于“窗口期”，就有可能出現(xiàn)漏檢的情況?！按翱谄凇辈⒉皇枪潭ǖ?，會隨著檢測方法敏感性的提高而縮短，但始終會存在。

2.2.2空間因素

取樣部位是否合格決定了結果的可靠性。不當?shù)娜涌梢詫е陆Y果假陰性的情況發(fā)生。如對活豬盡量采集喉部棉拭子及抗凝血，病死豬采集脾臟和淋巴結。

2.2.3送檢因素

檢驗誤差絕大多數(shù)來源于分析前階段，標本質量決定結果是否可靠，樣本的現(xiàn)場選擇、采集、運輸、處理等環(huán)節(jié)將直接影響檢測結果。

2.3 采集環(huán)境樣本，為什么大部分樣本內標不出，偶爾個別樣本檢測出內標？

因為非洲豬瘟試劑檢測的是豬內源性內標，環(huán)境樣本有時不含有豬源細胞，所以檢測不出內標；偶爾檢出內標，可能該環(huán)境樣本上有豬源性細胞黏附，故而檢出內標。

3 小結

制定科學合理的日常監(jiān)測及異常檢測方案，避免過度、盲目檢測；檢測人員要專人專事，執(zhí)行標準化、流程化、固態(tài)化的“simple and good”檢測。

3.1 謹防移液器污染

核酸提取、試劑加樣等不同操作做到移液器專用，檢測過程，所有試劑要放置正前方，不可從敞口的試劑上方經(jīng)過；提倡空白/陰性對照要從核酸提取開始。對于污染：移液器的污染最為常見，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內或粘上吸頭是重要的污染源，因而加樣吸取時要十分小心，慢吸，不要多次抽吸，避免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

3.2 噴灑專用核酸祛除劑

實驗完畢，工作臺面、超凈臺、生物安全柜、移液器、離心機、熒光PCR儀等要使用專用的核酸祛除劑（84消毒液對儀器會有腐蝕作用）進行消毒處理；實驗室一旦污染，務必暫停使用，待有效處理，認真評估后再復用。