非洲豬瘟疫苗研究的困境和展望

陳芳洲，楊華威，趙祖凱

（武漢天種畜牧有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430344）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）于1921年首次被報(bào)道，是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬只急性、熱性、出血性、高度接觸性傳染病，臨床感染豬只的死亡率可以高達(dá)100%[1]。臨床上，ASF主要被分為3種類型：強(qiáng)毒力、中等毒力和低毒力類型[2]。強(qiáng)毒力類型的豬只主要引起發(fā)燒、食欲不振、精神萎靡、呼吸困難、皮膚充血、甚至死亡；低毒力毒株的ASFV可引起豬只間歇或者持續(xù)的病毒血癥，引起皮膚壞死和關(guān)節(jié)炎等[3]。根據(jù)ASFV的P72蛋白的B646L基因的序列，最少有24種基因型的ASFV毒株已經(jīng)被鑒定。

1921年，ASF首先在非洲肯尼亞被報(bào)道，這也是其名字的由來。1921年，在東非肯尼亞首次確認(rèn)ASF疫情。之后在非洲呈現(xiàn)地方流行，1957年首次傳入歐洲葡萄牙，1971年傳入美洲古巴，1978年傳播到意大利。2007年，首次傳播至歐亞接壤的格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯，并在高加索地區(qū)呈現(xiàn)地方流行。2012年傳入烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯。2014年傳入歐盟的立陶宛、波蘭、拉脫維亞、愛沙尼亞，2016年傳入摩爾多瓦，2017年傳入捷克，羅馬尼亞。2018年8月我國遼寧首次確診ASF疫情。我國流行的主要是基因II型的ASFV毒株，據(jù)文獻(xiàn)和行業(yè)的報(bào)道，我國豬場存在其他類型的ASFV毒株的流行。

針對(duì)ASF的滅活疫苗研制道路似乎走不通。從免疫保護(hù)的角度來說，減毒活疫苗的研制似乎是一條可行的道路，但是其潛在的散毒和在臨床中持續(xù)感染的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重地影響其商品化進(jìn)程。亞單位疫苗，特別是聯(lián)合多種亞單位進(jìn)行聯(lián)合使用，重組活載體疫苗，DNA疫苗都顯示了一定的可行性，但是目前仍然都存在非常多的問題。復(fù)制缺陷單周期病毒這條道路解決了減毒活疫苗安全性的疑慮，是一條值得嘗試的ASF疫苗研發(fā)道路。

1 ASF疫苗研究的困難點(diǎn)

從1921年首次被報(bào)道，一百年以來，各國科學(xué)家不懈地探索ASF的疫苗研制。盡管很多不同類型的候選疫苗展示了一定的可行性。截至目前，還沒有任何一種商業(yè)化的ASF疫苗。

哪些因素限制了ASF疫苗的研制呢？

病原本身的特性：1）ASFV的基因組非常大，為170～193 kb，病毒粒子直徑約200 nm，編碼150～167個(gè)基因；2）這些基因與毒力及免疫相關(guān)的功能，以及多個(gè)基因之間協(xié)同互作的復(fù)雜情況還不太清楚；3）ASFV毒株變異性大，目前對(duì)其中和抗體的了解還不清晰，依據(jù)其VP72蛋白基因B646L，將其分為24個(gè)基因型；4）ASFV難以在體外培養(yǎng)系統(tǒng)穩(wěn)定快速生長。

病原和宿主的互作：1）強(qiáng)毒ASFV常導(dǎo)致易感動(dòng)物的快速死亡，因此很難研究病原和宿主相互作用關(guān)系；2）臨床常見緊急使用的滅活疫苗失效，導(dǎo)致疫情進(jìn)一步的擴(kuò)大；3）目前對(duì)ASFV感染后是否產(chǎn)生中和抗體還存在爭議；4）宿主的免疫保護(hù)機(jī)制還不明確，難以針對(duì)性地設(shè)計(jì)疫苗；5）不同毒株之間的交叉保護(hù)性差，ASFV基因型也多，候選疫苗的應(yīng)用譜有限；6）缺乏良好的體外疫苗免疫效果評(píng)估動(dòng)物模型；7）常見的減毒活疫苗免疫攻毒實(shí)驗(yàn)的持續(xù)期較短，對(duì)候選減毒活疫苗的持續(xù)感染排毒，以及對(duì)豬只的副作用研究較少；8）疫苗的毒株匹配性、使用劑量、接種途徑、接種動(dòng)物的特點(diǎn)等還未明確；9）未注冊(cè)非法減毒活疫苗的使用，在臨床容易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥?，?dǎo)致臨床豬群副反應(yīng)，嚴(yán)重危害行業(yè)，增加了大家對(duì)ASF疫苗安全性的擔(dān)憂。

2 ASF理想疫苗的標(biāo)準(zhǔn)

被報(bào)道一百年以來，尚未研制出合格的商業(yè)化疫苗；一些歐洲國家，例如西班牙，歷經(jīng)了使用實(shí)驗(yàn)性疫苗導(dǎo)致疫情進(jìn)一步惡化，之后通過不使用疫苗，成功凈化了ASF，這也是目前OIE所提倡的方式；我國通過創(chuàng)造性的定點(diǎn)清除策略成功處置ASFV強(qiáng)毒株的案例；未注冊(cè)非法弱毒疫苗給臨床造成了巨大的損失，都讓我們思考：理想的ASF疫苗的關(guān)鍵點(diǎn)是什么？

1）安全性是第一位的 疫苗的安全包括對(duì)免疫豬只的個(gè)體，和通過垂直和水平傳播等對(duì)豬群的安全性；同時(shí)不僅是疫苗對(duì)豬只的健康的影響（持續(xù)感染和副作用等），也需要考慮疫苗對(duì)豬只種用質(zhì)量、銷售價(jià)格、生產(chǎn)性能等方面的綜合影響；

2）有效性 包含對(duì)整個(gè)免疫豬群不同豬只的免疫保護(hù)性，同時(shí)需要考慮免疫譜，特別是針對(duì)異源毒株的免疫保護(hù)性；最好能具有同時(shí)激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力；

3）可區(qū)分免疫和感染狀態(tài) 區(qū)分豬群免疫還是感染狀態(tài)非常重要，可通過特異性的病原PCR或者抗體ELISA等方法對(duì)豬群感染情況進(jìn)行區(qū)分；

4）在滿足GMP要求的高質(zhì)量的疫苗制品廠生產(chǎn) 一方面能保證疫苗質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)，且能避免疫苗外排毒風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，需要穩(wěn)定的病毒體外培養(yǎng)系統(tǒng)，能低價(jià)穩(wěn)定生產(chǎn)；

5）跨動(dòng)物物種的疫苗適用性不僅要能用于家豬，如果能同時(shí)用于野豬等，有助于ASF防控的簡化。

3 不同類型ASF疫苗的研究現(xiàn)狀

3.1 滅活疫苗路線基本走不通

20世紀(jì)30年代，人們就開展了ASF滅活疫苗的研制。

20世紀(jì)里，豬只器官、器官分泌物、戊二醛固定的感染細(xì)胞等通過加熱和/或化學(xué)試劑滅活的方式，開展了ASF滅活疫苗的研制，結(jié)果是沒有保護(hù)、部分保護(hù)、不能保護(hù)異源毒株攻毒等情況。

2014年，Blome等人[4]，2021年，Cadenas-Fernández等人[5]，開展了類似的以BEI（二乙烯亞胺）滅活病毒之后加入不同佐劑的滅活疫苗的研制，這些實(shí)驗(yàn)表明這些候選滅活疫苗甚至不能保護(hù)同源毒株對(duì)豬只的攻毒。因此，對(duì)ASF滅活疫苗的研制似乎走入了死胡同。

3.2 減毒活疫苗似乎是最有希望的，但其安全隱患引起了巨大的爭議

20世紀(jì)30年代人們就開展減毒活疫苗的研究。減毒活疫苗的種類主要分為3種：通過人工體外傳代的方式獲得的減毒活疫苗、臨床中發(fā)現(xiàn)的自然減毒活疫苗以及通過基因工程技術(shù)人工制備的減毒活疫苗。

3.2.1自然缺失弱毒疫苗的研究

2001年開始，很多科學(xué)研究中報(bào)道了能對(duì)同源強(qiáng)毒攻毒起到100%保護(hù)力的自然缺失減毒活疫苗，能引起免疫動(dòng)物高水平的細(xì)胞免疫，同時(shí)副作用是體溫升高、皮膚潰爛、關(guān)節(jié)腫等。

2004年Boinas等報(bào)道了來源于蜱蟲的NH/P68毒株能對(duì)同源毒株的攻毒起到良好的保護(hù)作用或者延遲疾病的發(fā)生[6]。

2017年Gallardo等人報(bào)道了從拉脫維亞野豬中分離的自然缺失弱毒株Lv17/WB/Rie1能有效地保護(hù)家豬[7]。Barasona等人的后續(xù)報(bào)道中，該毒株經(jīng)口服途徑能保護(hù)野豬，但是該研究中還有很多地方需要進(jìn)一步的評(píng)估，比如安全性、給藥劑量、遺傳穩(wěn)定性以及動(dòng)物長期排毒的特征等[8]。

歐盟的VACDIVA （H2020 Gran ID：862874）項(xiàng)目中也正在評(píng)估第3種自然缺失減毒毒株的免疫保護(hù)力，同時(shí)配套了檢測免疫和感染狀態(tài)的試劑盒，這一項(xiàng)目呈現(xiàn)出一些希望，但還在繼續(xù)評(píng)估中。

3.2.2傳代減毒疫苗的研究

1957年第一次報(bào)道免疫了細(xì)胞傳代減毒的ASF疫苗可以部分保護(hù)經(jīng)受同源毒株攻毒的豬只，但是因?yàn)樾掖尕i只少，使后續(xù)對(duì)抗體的特點(diǎn)研究和研制很困難[9]。

1963年，葡萄牙和西班牙的科學(xué)家使用不同傳代方式的減毒活疫苗進(jìn)行免疫攻毒實(shí)驗(yàn)，2個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都表明，只能起到部分保護(hù)作用，死亡率是變化的，而且會(huì)引起一定的副反應(yīng)，比如皮膚潰爛、神經(jīng)或者肺部系統(tǒng)的損傷等。同時(shí)一些免疫動(dòng)物持續(xù)帶毒，變成了這些弱毒株病毒的載體，并進(jìn)行散毒。

細(xì)胞傳代減毒弱毒苗的研制在持續(xù)進(jìn)行中，盡管這些疫苗也展現(xiàn)出一定的保護(hù)力，但是，2017年，Titov等也報(bào)道了這些毒株會(huì)引起康復(fù)豬只血液和器官中持續(xù)數(shù)周的排毒情況[10]。同時(shí)，即使抵御住攻毒的豬只，28 d后仍然可能表現(xiàn)出臨床癥狀，其安全穩(wěn)定性值得持續(xù)關(guān)注。

3.2.3基因工程缺失疫苗的研究

伴隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，針對(duì)ASF的基因缺失疫苗的研究非常多，成為21世紀(jì)以來主要的ASF疫苗研究方向。因?yàn)閷?duì)于ASFV不同基因的毒力和免疫保護(hù)特性的研究還不太清晰，因此這些研究中嘗試了不同的缺失形式：不同基因的單缺失疫苗研制、雙基因或者多基因的聯(lián)合缺失等形式，這些疫苗候選毒株的保護(hù)力差異巨大，從17%到100%不同?；蛉笔Ф局瓯憩F(xiàn)出非常好的保護(hù)力潛質(zhì)，我國的哈爾濱獸醫(yī)所研究團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了7基因缺失ASFV毒株在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的良好免疫保護(hù)作用[11]。

但是伴隨著各種減毒活疫苗的應(yīng)用，都有一個(gè)非常重要的安全性問題，就是減毒活疫苗可能會(huì)造成持續(xù)的感染情況，以及引起豬只的副作用，比如皮膚潰爛、關(guān)節(jié)炎，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的損傷等問題。

近來FAO和路透社也報(bào)道了未注冊(cè)非法弱毒苗引起臨床慢性感染情況，甚至導(dǎo)致急性感染，對(duì)生豬行業(yè)造成巨大的損失，為ASF疫苗的研制，特別是減毒活疫苗的研制蒙上了巨大的陰影。

3.3 亞單位疫苗的研制還有較長的路需要走

20世紀(jì)90年代，人們開展了不同類型的亞單位疫苗的研制，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為常用的表達(dá)系統(tǒng)。1995年，VP12蛋白，1998年VP54和VP30分別被用于表達(dá)亞單位疫苗的研制，不幸的是，這些實(shí)驗(yàn)中候選的亞單位疫苗免疫豬只后，無法抵御致死劑量ASFV的攻毒。2001年開始，常見的VP30、VP54、VP72和CD2v等蛋白被單獨(dú)或者混合用于ASF的免疫；除了常見的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，哺乳細(xì)胞，病毒載體也用于ASFV的亞單位蛋白的表達(dá)。

ASF的免疫攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整體來說，目前亞單位疫苗不能保護(hù)豬只或者只能部分保護(hù)豬只，還有較長的道路需要走。

3.4 其他類型的疫苗研究還需要不斷探索

其他類型的ASF疫苗主要包含DNA疫苗和/或載體疫苗、復(fù)制缺陷單周期病毒等。

載體疫苗主要依托腺病毒系統(tǒng)和桿狀病毒系統(tǒng)，這些疫苗中都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但是只有少部分的候選疫苗表現(xiàn)出攻毒保護(hù)力，保護(hù)力從20%到100%不等。不同載體疫苗的混合使用可能是未來DNA疫苗和/或載體疫苗的一個(gè)重大研究方向。2020年，Goatley等報(bào)道了8種載體抗原混合候選疫苗能對(duì)于中等毒力ASF的攻毒提供100%的保護(hù)力[12]。

復(fù)制缺陷單周期病毒借助輔助細(xì)胞表達(dá)缺失的蛋白，相較于ASF減毒活疫苗解決了安全性問題或降低安全性風(fēng)險(xiǎn)。單周期病毒原位復(fù)制，但是不進(jìn)行病毒組裝。該技術(shù)已經(jīng)被用于裂谷熱病毒、流感病毒、藍(lán)舌病毒、腺病毒等病毒復(fù)制缺陷單周期病毒的研究，且被證明有一定的免疫原性和保護(hù)原性，不僅能引起體液免疫，也能引起細(xì)胞免疫。因?yàn)橄鄬?duì)于減毒活疫苗的安全性，該疫苗研制策略可作為一種ASF疫苗研制的方向。同時(shí)復(fù)制缺陷基因的確定，能穩(wěn)定生產(chǎn)的輔助表達(dá)細(xì)胞體系的構(gòu)建，都是構(gòu)建復(fù)制缺陷單基因病毒需要解決的關(guān)鍵問題。

4 我國非洲豬瘟的防控

目前看來，我國ASF防控是一場持久戰(zhàn)，且處于戰(zhàn)略相持階段。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的報(bào)告和行業(yè)信息，目前ASF在我國呈現(xiàn)地方流行性。全國各地也都在推進(jìn)ASF“無疫小區(qū)”的建設(shè)和申報(bào)。

ASF給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來了極大的損失。同時(shí)，ASF疫情也深刻地促進(jìn)了我國生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，特別是對(duì)人員團(tuán)隊(duì)的建設(shè)，生物安全制度的深入人心，新的養(yǎng)殖防疫制度的升級(jí)，甚至是行業(yè)結(jié)構(gòu)的深遠(yuǎn)變革。

1）ASFV基因II型野毒株的臨床感染的防控 我國智慧的養(yǎng)豬人創(chuàng)造性地提出了精準(zhǔn)剔除的豬場ASFV基因II型野毒株凈化方案，不僅在臨床中得到了廣泛有效的應(yīng)用，而且得到了國際同行的認(rèn)可和尊敬，我國養(yǎng)豬人已經(jīng)從最開始的向國外學(xué)習(xí)ASF防控技術(shù)的“小學(xué)生”到現(xiàn)在有了非常大的提升，而且有很多的技術(shù)突破。

2）臨床弱毒株感染的防控 我國臨床中已經(jīng)鑒定了不同類型的ASFV弱毒株，F(xiàn)AO和路透社也報(bào)道了臨床未注冊(cè)非法疫苗的使用。因?yàn)榕R床假弱毒苗的復(fù)雜多樣性，無法早期發(fā)現(xiàn)假疫苗毒的感染，以及目前尚無有效的假疫苗毒感染的剔除方案。盡管，目前臨床上假疫苗毒案例占比不高（10%左右），但是對(duì)于因假疫苗毒感染的豬場可能是致命的，會(huì)導(dǎo)致整個(gè)豬場，甚至其關(guān)聯(lián)豬場的清場。行業(yè)中針對(duì)假疫苗毒株的防控也有一些好消息，就是部分假疫苗毒株感染的案例通過部分清群方法成功凈化，盡管群體損失也非常大，但這可能是養(yǎng)豬人能否成功防控住弱毒株的分水嶺。

5 非洲豬瘟疫苗研制的展望

ASF是當(dāng)前危害世界養(yǎng)豬業(yè)最重要的豬病。其病原ASFV也幾乎是我們面對(duì)的最復(fù)雜的豬病病原。歷經(jīng)一百年，其疫苗研制的道路仍十分艱巨。

第一，還需要加強(qiáng)對(duì)其病原，病原和宿主相互作用的研究，弄清楚其感染、繁殖、致病、免疫等方面的特點(diǎn)；

第二，需要加強(qiáng)對(duì)其疫苗的研制，盡管目前尚無商品化疫苗，但是一些疫苗已經(jīng)展示了較好的免疫保護(hù)能力，盡管還存在一些安全隱患，因此，對(duì)于理想ASF疫苗的研制和追求還是非常有必要的；

第三，在當(dāng)前尚無商品化疫苗，非洲豬瘟疫苗商品化時(shí)間表還不明確的情況下，我國創(chuàng)造性地開創(chuàng)了ASF野毒的定點(diǎn)清除技術(shù)的基礎(chǔ)上，未注冊(cè)非法疫苗造成了臨床嚴(yán)重?fù)p失，以及西班牙等國家通過OIE認(rèn)可的無疫苗凈化策略的基礎(chǔ)上，我國更應(yīng)堅(jiān)定地執(zhí)行ASF疫苗研究科學(xué)家說了算，先推進(jìn)國家的ASF“無疫小區(qū)”的建設(shè)，再實(shí)現(xiàn)區(qū)域的ASF凈化，最終希望我國生豬產(chǎn)業(yè)能徹底地凈化ASF，盡管目前來看，還是任重道遠(yuǎn)；

第四，非洲豬瘟對(duì)生豬產(chǎn)業(yè)帶來了“危”和“機(jī)”，伴隨生豬行情的急劇下降，目前生豬產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展也該降降溫了。此時(shí)正是潛心修煉內(nèi)功，讓管理能力、生產(chǎn)能力、生產(chǎn)質(zhì)量等追上生豬產(chǎn)業(yè)規(guī)模發(fā)展的步伐，盡快回歸到生豬產(chǎn)業(yè)本身的高質(zhì)量穩(wěn)步發(fā)展的道路上。