基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究浙貝母治療急性髓系白血病的作用機(jī)制

白鹿原，安蘭花，王 懸，王晨琳，尹 一，王祥麒

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；4.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008）

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）約占成人白血病的70%，病情發(fā)展迅速，自然病程僅數(shù)月。目前主要有支持治療、聯(lián)合化療、小分子靶向治療、新型細(xì)胞毒性藥物治療、免疫靶向治療、造血干細(xì)胞移植等治療方法[1-2]。通過上述治療手段，AML已取得一定治療效果，5年生存率達(dá)50%，但AML的高度異質(zhì)性和復(fù)雜性導(dǎo)致治療后易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，同時造血干細(xì)胞移植高昂的費(fèi)用和配型的困難性也使該療法難以推廣[3-4]。因此研發(fā)新型療效好、價格低廉的治療AML藥物成為目前藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，中藥具有價格低廉、副作用低、藥效作用明顯等多項優(yōu)勢，成為當(dāng)前藥物研發(fā)的新方向。

浙貝母為百合科植物浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗莖，又稱大貝、珠貝、元寶貝，為浙江道地藥材，是中藥處方中常用藥物。近年來，通過對浙貝母化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，浙貝母中主要含有生物堿、多糖和總皂苷等成分，藥用價值極高。藥理研究顯示，浙貝母具有鎮(zhèn)咳祛痰、鎮(zhèn)痛抗菌、抗?jié)?、抗炎止瀉、抗腫瘤等作用[5-6]。胡凱文等[7]通過90例白血病病例臨床對照試驗證實，浙貝母可明顯提高化療效果，尤其對難治、復(fù)發(fā)白血病療效顯著。浙貝母化學(xué)成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)眾多，現(xiàn)代研究對于浙貝母治療急性髓系白血病的作用機(jī)制仍不清楚。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測浙貝母治療AML的作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行富集分析，構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，通過GEO數(shù)據(jù)庫、分子對接技術(shù)初步驗證，探討作用機(jī)制，為下一步的動物體內(nèi)外藥理試驗提供了方向，同時為今后的臨床推廣應(yīng)用及新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 方 法

1.1 浙貝母化學(xué)成分的篩選 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索浙貝母的化學(xué)成分，根據(jù)毒藥物動力學(xué)（ADME）以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，對浙貝母化學(xué)成分進(jìn)行篩選，同時結(jié)合文獻(xiàn)報道，對浙貝母化學(xué)成分進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 浙貝母化學(xué)成分靶點(diǎn)的預(yù)測和篩選 使用TCMSP檢索浙貝母中化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)基因，并通過Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將預(yù)測的靶點(diǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化。同時通過有機(jī)小分子數(shù)據(jù)庫PubChem檢索浙貝母化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)，將其3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，預(yù)測化學(xué)成分靶點(diǎn)信息，剔除可能性（Probability）為0的基因后匯總剔重，可得到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測基因。將2個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶點(diǎn)基因進(jìn)行合并，剔重，即得到浙貝母化學(xué)成分靶點(diǎn)基因。

1.3 急性髓系白血病靶點(diǎn)的獲取

1.3.1 疾病數(shù)據(jù)庫中急性髓系白血病靶點(diǎn)的篩選 以“acute myelogenous leukemia”為關(guān)鍵詞，通過OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫，檢索AML的潛在靶點(diǎn)，再通過DRUGBANK數(shù)據(jù)庫尋找AML一線臨床藥物靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。將3個數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)基因通過Uniprot標(biāo)準(zhǔn)化后合并剔重，即得到AML靶點(diǎn)基因。

1.3.2 GEO數(shù)據(jù)庫急性髓系白血病差異基因的篩選 以“acute myelogenous leukemia”為關(guān)鍵詞，檢索GENE EXPRESSION OMNIBUS數(shù)據(jù)庫，查找正常人群與AML患者的骨髓高通量測序數(shù)據(jù)集。通過R軟件進(jìn)行分析篩選并進(jìn)行可視化處理。

1.4 浙貝母化學(xué)成分-急性髓系白血病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為進(jìn)一步探究浙貝母化學(xué)成分同AML的作用關(guān)系，通過Venny2.1.0取兩者交集基因并繪制韋恩圖，交集基因即為浙貝母作用AML的靶點(diǎn)基因。將其提交至STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)定為“medium confidence(0.4)”，余默認(rèn)設(shè)置不變，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入至CytoScape3.7.2軟件，使用“Network analyzer”功能，對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選浙貝母作用AML的核心靶點(diǎn)基因。

1.5 基因功能與通路富集分析 將浙貝母作用AML的靶點(diǎn)基因?qū)胫罝AVID Bioinformatics Resources 6.8，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，提交后即得到靶點(diǎn)基因的GO注釋分析和KEGG通路分析結(jié)果。后運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)的方法，設(shè)置P≤0.05，對富集分析結(jié)果進(jìn)行篩選。將篩選的結(jié)果導(dǎo)入R軟件，通過“ggplot2”包對排名靠前的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.6 浙貝母化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape3.7.2軟件構(gòu)建化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，計算浙貝母主要化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)。

1.7 GEO差異基因驗證 檢索GEO數(shù)據(jù)庫，確定相應(yīng)數(shù)據(jù)集，篩選出AML的差異基因，此為經(jīng)過臨床驗證的AML差異基因，為探求浙貝母與AML之間作用關(guān)系，分析浙貝母靶點(diǎn)基因與AML差異基因是否存在交集基因。

1.8 分子對接驗證 為驗證浙貝母化合物對AML相關(guān)基因的作用效果，采取分子對接的方法初步驗證。選取“1.4”項中所得的核心靶點(diǎn)基因，取度值排名靠前的基因，結(jié)合“1.7”項中所取得的交集基因，取兩者并集。后通過PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合蛋白種屬、分辨率、是否含有共晶配體、活性口袋是否完整等限定條件，對同種基因蛋白的不同晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，下載匹配度較高的蛋白晶體結(jié)構(gòu)文件，通過MOE軟件中dock功能與浙貝母化學(xué)成分進(jìn)行分子對接，根據(jù)其對接評分S評估浙貝母化學(xué)成分同作用靶點(diǎn)的結(jié)合穩(wěn)定性，從而評價浙貝母對AML的作用效果。

2 結(jié) 果

2.1 浙貝母化學(xué)成分的篩選 通過TCMSP檢索出浙貝母化學(xué)成分17種，經(jīng)ADME篩選后獲得浙貝母化學(xué)成分7種。再通過對相關(guān)文獻(xiàn)的挖掘[8]，補(bǔ)充一些OB、DL值較低，但經(jīng)藥理學(xué)研究，對人體仍有藥理活性的成分，如浙貝母甲素、浙貝母乙素。最終篩選出浙貝母化學(xué)成分9種。（見表1）

表1 浙貝母主要化學(xué)成分基本信息

2.2 浙貝母化學(xué)成分靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP化合物靶點(diǎn)預(yù)測功能，檢索出靶點(diǎn)72個，剔重后獲得51個潛在靶點(diǎn)。通過Swiss Target Prediction平臺靶點(diǎn)預(yù)測功能，預(yù)測出相關(guān)化學(xué)成分靶點(diǎn)信息后，剔除可能性（Probability）為0的基因后匯總剔重，獲得370個潛在靶點(diǎn)基因。將2個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶點(diǎn)基因進(jìn)行合并后再次剔重，即得到浙貝母化學(xué)成分靶點(diǎn)基因397個。

2.3 急性髓系白血病靶點(diǎn)基因的獲取

2.3.1 疾病數(shù)據(jù)庫中急性髓系白血病靶點(diǎn)的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索與AML相關(guān)靶點(diǎn)基因2 405個，為獲得與AML密切程度較高基因，根據(jù)經(jīng)驗篩取Relevance score≥10的靶點(diǎn)基因為AML潛在靶點(diǎn)，篩選后獲得785個靶點(diǎn)基因。再檢索OMIM數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫，依次將3個數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)基因通過Uniprot標(biāo)準(zhǔn)化，最后將3個數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)基因匯總剔重，即得到AML相關(guān)靶點(diǎn)基因892個。

2.3.2 GEO中急性髓系白血病差異基因的篩選 通過對GEO數(shù)據(jù)庫的檢索，確定GSE84881數(shù)據(jù)集[9]，該芯片數(shù)據(jù)集收集了4個正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞樣本和19個AML患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞樣本的基因表達(dá)譜。后使用R軟件下載并分析GSE84881原始數(shù)據(jù)，以P≤0.05且log2FC絕對值≥1為條件進(jìn)行差異分析后獲得206個差異表達(dá)基因，此為急性髓系白血病差異基因。選取log2FC絕對值≥2的基因通過TBtools[10]軟件繪制聚類熱圖，同時將原始數(shù)據(jù)繪制火山圖。（見圖1）

圖1 AML相關(guān)芯片差異基因聚類熱圖和火山圖

2.4 浙貝母化學(xué)成分-急性髓系白血病PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將浙貝母化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)基因與AML靶點(diǎn)基因通過Venny2.1.0取交集并繪制韋恩圖。（見圖2）將所得的97個交集基因提交至STRING數(shù)據(jù)庫，分析PPI網(wǎng)絡(luò)。后將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入至CytoScape3.7.2軟件，通過拓?fù)浞治?，進(jìn)而繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖3）依據(jù)相關(guān)拓?fù)鋮?shù)對浙貝母作用于AML的基因進(jìn)行篩選，取連接度值（degree）≥2倍中位數(shù)的基因為核心靶點(diǎn)基因，共15個。（見表2）

表2 浙貝母作用于AML的核心靶點(diǎn)基因及其節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

圖2 浙貝母-急性髓系白血病靶點(diǎn)基因韋恩圖

圖3 浙貝母作用于AML靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 基因功能與通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對浙貝母作用于AML的靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析，分析結(jié)果包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、KEGG等4個部分，設(shè)置P≤0.05對分析結(jié)果進(jìn)行篩選，分別得到348、84、49條生物功能信息，96條信號通路信息，并通過R軟件中“ggplot2”包對排名較前的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。（見圖4）生物過程中主要涉及細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞遷移、血小板活化、MAP激酶活性的正調(diào)控；分子功能中主要涉及酶、大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合，部分酶活性的調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、細(xì)胞表面、線粒體、蛋白質(zhì)復(fù)合物、核染色質(zhì)等，浙貝母對AML的作用可能與以上這些功能過程相關(guān)。在KEGG信號通路方面，通過對排序較前的30條信號通路研究發(fā)現(xiàn)，主要為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、代謝、免疫調(diào)節(jié)、促血管生長等通路。（見圖4）

圖4 浙貝母作用于AML靶點(diǎn)基因的富集分析

2.6 浙貝母化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 通過CytoScape3.7.2軟件構(gòu)建浙貝母化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并分析浙貝母主要化學(xué)成分的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)。此網(wǎng)絡(luò)圖包括9個浙貝母化合物節(jié)點(diǎn)，97個作用靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，15個通路節(jié)點(diǎn)及478條相互關(guān)系連線。每個化合物平均與21個靶點(diǎn)相互作用，每個信號通路平均有19.8個相關(guān)靶點(diǎn)參與調(diào)控，這說明了浙貝母可通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用于多個通路來發(fā)揮其對AML的治療作用。（見圖5、表3）

圖5 浙貝母化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表3 浙貝母主要化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.7 GEO差異基因驗證GEO數(shù)據(jù)庫是儲存芯片、二代測序及其他高通量測序數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，我們可通過該數(shù)據(jù)庫檢索到任何物種的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。GEO上有4類數(shù)據(jù)GSM、GSE、GDS、GPL。GSE數(shù)據(jù)為一個試驗項目的多個芯片試驗，通過“2.3.2”項中確定GSE84881數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括4個正常樣本，19個AML樣本，運(yùn)用R軟件篩選獲得206個AML差異基因。將AML差異基因與浙貝母化學(xué)成分靶點(diǎn)基因提交至Venny2.1.0取得交集基因，交集基因為CTSC、CYP1B1、DAPK1、LGALS3、PTGS2。該結(jié)果不但驗證了浙貝母對AML確有調(diào)節(jié)作用，也側(cè)面說明這5個基因也為浙貝母作用于AML的靶點(diǎn)基因。

2.8 分子對接驗證 分子對接是一種較為成熟的計算機(jī)輔助藥物設(shè)計方法，其原理基于鎖鑰模型，通過計算機(jī)模擬計算配體與受體在空間結(jié)構(gòu)、靜電作用、范德華力作用、氫鍵等各方面是否互補(bǔ)匹配，進(jìn)而評估配體與受體能否結(jié)合及結(jié)合效果[11]。選取5個“2.7”項中獲得的AML差異基因和度值排名靠前的6個浙貝母作用于AML核心靶點(diǎn)基因，于PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白晶體結(jié)構(gòu)PDB文件，后使用MOE軟件與浙貝母中的9個主要化學(xué)成分分別進(jìn)行對接，對接結(jié)果見圖6。根據(jù)MOE軟件打分函數(shù)London dG計算，對接評分S值越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，對接效果越好。分子對接結(jié)果顯示所有化合物平均對接評分為-5.83，所有對接結(jié)果中，6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1，4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖與CYP1B1結(jié)合效果最好，評分為-10.1，分子對接3D模式及2D模式見圖7。CYP1B1為浙貝母結(jié)合效果最好的靶點(diǎn)蛋白，平均對接評分為-8.5。

圖6 分子對接結(jié)果

圖7 分子對接模式圖

3 討 論

急性髓系白血?。ˋML）是造血祖細(xì)胞變異引起的惡性克隆性疾病，中醫(yī)典籍對此病沒有明確記載，《圣濟(jì)總錄》熱勞篇有云：“論曰熱勞之證，心神煩躁，面赤頭疼，眼澀唇焦，身體壯熱，煩渴不止，口舌生瘡，食飲無味，肢節(jié)酸疼，多臥少起，或時盜汗，日漸羸瘦者是也?！边@段癥狀描述與AML發(fā)熱、感染、出血、乏力、久病后身體消瘦等癥狀十分相似。根據(jù)AML臨床癥狀及發(fā)病特點(diǎn)，可歸為“虛勞”“血證”“瘀積”“痰核”等范疇。

在長期臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，AML進(jìn)展過程中多見痰核、瘰疬、瘀斑、瘀點(diǎn)、發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，多與痰、瘀、熱等病理因素密切相關(guān)。清代高錦庭曾言：“癌病者，非陰陽之氣郁結(jié)腫，乃五臟瘀血，濁氣痰凝而成。”正氣虧虛，以致氣血虛弱，津聚液停匯聚為痰，痰阻則氣滯，氣機(jī)阻滯以致血行不利，日久形成血瘀，痰與瘀相互交織形成痰瘀互結(jié)，此為AML發(fā)病關(guān)鍵病機(jī)，在此疾病發(fā)展過程中，痰邪為致病關(guān)鍵因素[12-13]。基于對AML致病因素的判斷，其治法當(dāng)選化痰散結(jié)，浙貝母為苦寒之藥，功擅化痰止咳，清熱散結(jié)，又可治瘰疬癭瘤、瘡癰腫毒之病，當(dāng)為首選之藥。在臨床實踐中，宋娜莎等[14]通過200例難治性急性白血病患者隨機(jī)對照試驗證實復(fù)方浙貝母顆粒能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，降低機(jī)體耐藥力，增強(qiáng)機(jī)體對化療藥物的吸收，增強(qiáng)化療效果。李冬云等[15]通過多中心隨機(jī)臨床對照試驗證實浙貝母顆粒輔助化療能夠提高難治性急性白血病圍化療期臨床療效，以上多個臨床試驗證實浙貝母治療AML具有顯著療效。

本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出浙貝母中主要化學(xué)成分，并進(jìn)行對接驗證，在度值排名靠前的幾個化合物中，6-甲氧基-2-乙?；?3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖、紫鄂貝堿、β-谷甾醇、浙貝母甲素、浙貝母乙素對接效果較好。相關(guān)基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示浙貝母甲素、浙貝母乙素為浙貝母中主要的生物堿，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥（MDR）的作用，而且能逆轉(zhuǎn)兩種不同機(jī)制的腫瘤細(xì)胞MDR耐藥性[16-17]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，是動植物細(xì)胞膜的主要組成成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[18]。紫鄂貝堿與6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷均為浙貝母中化學(xué)成分，與較多AML靶點(diǎn)基因有作用關(guān)系，分子對接驗證顯示與對接靶點(diǎn)蛋白均有較好的結(jié)合穩(wěn)定性，因此推測這兩個化合物對AML有較好的治療效果，但目前暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究，本課題組接下來將進(jìn)一步研究其治療AML的作用機(jī)制。

分子對接結(jié)果顯示，浙貝母主要化學(xué)成分與CYP1B1、GAPDH、PTGS2、CCND1靶點(diǎn)基因有較好的結(jié)合效果，這些靶點(diǎn)基因主要涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面，為浙貝母作用的核心靶點(diǎn)。CYP1B1屬于細(xì)胞色素酶基因家族，表達(dá)的酶與人體內(nèi)藥物代謝、激素代謝的調(diào)控相關(guān)。GAPDH為糖代謝過程中的關(guān)鍵酶，對ATP生成起關(guān)鍵作用，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH在能量代謝、細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生、DNA修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[19]。PTGS2（COX-2）可以促進(jìn)細(xì)胞數(shù)目增加，減緩細(xì)胞凋亡速度，加速新生血管的生成。CCND1基因編碼的cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白家族中一員，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。同時CCND1也是PI3K/AKT信號通路的重要基因，該信號通路激活后，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而使AML細(xì)胞對藥物的敏感性下降，影響治療效果[20-21]。

DAVID數(shù)據(jù)庫對浙貝母作用于AML的靶點(diǎn)基因富集分析結(jié)果顯示，涉及的通路多集中在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、代謝、免疫調(diào)節(jié)、促血管生長等方面。在細(xì)胞增殖、凋亡方面，PI3K/AKT在白血病細(xì)胞發(fā)揮著重要作用，活化可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，其作用通過調(diào)節(jié)各種生理狀態(tài)下的線粒體來實現(xiàn)。線粒體受外界刺激引發(fā)膜通透性改變，激活Caspase-9、Caspase-3引起細(xì)胞凋亡[22-24]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路是人血管發(fā)生和血管生成過程的關(guān)鍵通路，其生成物VEGF可作用于內(nèi)皮細(xì)胞的糖基化細(xì)胞的有絲分裂素，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成[25]。白血病細(xì)胞的生長必須依賴新生血管生成來提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，從而使自身不斷增殖擴(kuò)張，因此血管新生對于AML意義重大。在AML患者病變組織內(nèi)均存在VEGF過度表達(dá)情況，VEGF不斷促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，產(chǎn)生大量新生血管，對AML細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移發(fā)揮協(xié)同作用。同時研究發(fā)現(xiàn)AML細(xì)胞自分泌的VEGF因子對正常骨髓造血細(xì)胞的生長增殖會起到抑制作用，對自身生長增殖起促進(jìn)作用[26-28]。

分子對接驗證結(jié)果顯示，浙貝母中主要化合物6-甲氧基-2-乙?；?3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖與CYP1B1結(jié)合穩(wěn)定性最高。CYP1B1屬于細(xì)胞色素P450超家族中CYP1家族，參與大量外源性化學(xué)物質(zhì)和某些內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，LOPES B A[29]研究結(jié)果顯示CYP1B1基因中rs1056836位點(diǎn)的GG基因型與降低AML的風(fēng)險密切相關(guān)。CYP1B1酶為在腫瘤組織中高表達(dá)的藥物代謝酶，可以在3個不同的水平發(fā)揮作用：誘變性4-羥基雌二醇的形成；前致癌物的生物活化；腫瘤耐藥性。由于其特殊的生理功能，細(xì)胞色素CYP1B1是一種很有前途的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[30-31]。6-甲氧基-2-乙?；?3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖通過對CYP1B1靶點(diǎn)調(diào)節(jié)發(fā)揮治療AML的作用，考慮其可作為新型CYP1B1酶抑制劑，本課題組將進(jìn)一步研究其作用效果。

綜合分析，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，聯(lián)合GEO數(shù)據(jù)庫，對浙貝母作用于AML的主要化學(xué)成分、核心靶點(diǎn)、主要作用通路進(jìn)行了分析，揭示了浙貝母治療AML的作用機(jī)制，后續(xù)本課題組擬根據(jù)分子對接結(jié)果設(shè)計動物體內(nèi)外藥理試驗，對6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖通過對CYP1B1靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)治療AML的機(jī)制進(jìn)行深入研究，為臨床應(yīng)用及新藥研發(fā)提供更多參考。