針刺上巨虛、曲池對不完全性腸梗阻大鼠血清中IL-18、IL-1α表達(dá)的影響*

吳 霞，譚金曲，楊茜蕓

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208）

腸梗阻按照梗阻程度可分為完全性腸梗阻和不完全性腸梗阻，不完全性腸梗阻多為慢性梗阻[1]。腸梗阻患者會在腸道局部和全身出現(xiàn)諸多變化，嚴(yán)重時(shí)可危及生命[2]。針灸具有疏通經(jīng)絡(luò)、通調(diào)臟腑等功能。臨床研究證明針刺治療腸梗阻存在優(yōu)勢[3-4]，上巨虛是治療腹痛、腹瀉等大腸腑病變的重要穴位[5]，而大腸經(jīng)本經(jīng)上的合穴曲池治療腸腑疾病亦能取得良好療效。因此，本次實(shí)驗(yàn)通過制備不完全性腸梗阻模型大鼠，分別予以針刺上巨虛穴、曲池穴3 d后，觀察大鼠回盲部腸組織形態(tài)學(xué)及血清中炎癥因子含量變化，探索針刺治療不完全性腸梗阻的作用機(jī)制，比較上巨虛、曲池在治療效應(yīng)上的差異，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物8周齡SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物管理制度和使用委員會批準(zhǔn)而進(jìn)行，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～25℃，濕度50%～70%，取血后麻醉處死全部實(shí)驗(yàn)大鼠。

1.2 藥物與試劑IL-18 ELISA試劑盒（批號：EK0592）、IL-1αELISA試劑盒（批號：EK0390）、4%多聚甲醛（貨號：AR1068）（博士德生物工程有限公司）；水合氯醛溶液（上海展云化工有限公司，批號：171110）；75%酒精（湖南廣勝源醫(yī)藥科技有限公司，批號：20180523）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：180601）。

1.3 主要儀器BD-255LT型低溫冷柜（海爾集團(tuán)）；DNM-9602型酶標(biāo)儀（北京普朗公司）；A0.820H型切片機(jī)（美國永生公司）；AE260型電子天平（梅特勒-托利多公司）；FS-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司）；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙湘一離心機(jī)廠）；華佗牌無菌針灸針（0.25 mm×25 mm，華佗醫(yī)療用品有限公司）。

1.4 造模與分組50只SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后分組。用黑色記號筆在大鼠尾部進(jìn)行編號，麻醉稱重后根據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行分層，再按隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠分為空白組、假手術(shù)組、模型組、上巨虛組和曲池組，每組10只。模型組、上巨虛組和曲池組大鼠參照絲線結(jié)扎法[6]制備不完全性腸梗阻模型。具體操作如下：術(shù)前大鼠禁食12 h，稱重后用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉（3 mL/kg），麻醉后將大鼠固定在鼠板上，腹部剪毛備皮后用75%酒精消毒，在腹中線下1/3處開1～2 cm長切口，暴露回盲部，并用無菌絲線在回盲部約1cm處將腸管與直徑3 mm的中心靜脈管一并結(jié)扎（見圖1），后將中心靜脈管取出（見圖2），回盲部腸管放回腹腔內(nèi)，將腹壁逐層縫合。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素（0.2 mL/只）、手術(shù)位置涂抹青霉素抗感染，注意大鼠的保暖和傷口護(hù)理，保持籠內(nèi)墊料的干爽舒適，避免引起傷口感染。假手術(shù)組只用針線穿透腸系膜而不結(jié)扎，空白組僅稱重麻醉。定期測量所有動物體質(zhì)量、飼料質(zhì)量、大便量。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠造模后存活，出現(xiàn)懶動、弓背、萎靡，且進(jìn)食量、大便量明顯減少，甚至基本無大便，認(rèn)為造模成功。造模及治療期間出現(xiàn)死亡情況及時(shí)補(bǔ)齊大鼠數(shù)量。

圖1 絲線結(jié)扎

圖2 取出靜脈管

1.5 干預(yù)方法 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]的定位方法，上巨虛位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約10 mm處；曲池穴位于橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中。具體操作：上巨虛組針刺大鼠雙側(cè)上巨虛，曲池組針刺大鼠雙側(cè)曲池。兩組均行平補(bǔ)平瀉手法，捻轉(zhuǎn)的角度為90°～180°，頻率為60～90次/min；提插幅度為0.2～0.3 cm，頻率為60～90次/min，提插捻轉(zhuǎn)后手下有緊滯感視為得氣。得氣后留針15 min，每隔5 min行針1次，每日治療2次，持續(xù)3 d。空白組、假手術(shù)組、模型組僅捆綁15 min，不進(jìn)行治療。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠血清中的IL-18、IL-1α含量 各組大鼠10%水合氯醛麻醉，沿手術(shù)位置打開腹腔，找到腹主動脈，將采血針針頭送入動脈內(nèi)，針尾置入抗凝真空采血管中進(jìn)行采血，然后放入離心機(jī)以3 000 r/min進(jìn)行離心，離心15 min后，使用移液槍取上清液至凍存管內(nèi)，最后置于液氮罐中保存。采用ELISA法檢測各組大鼠血清中的IL-18、IL-1α含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.2 回盲部腸黏膜損傷評分 采血后處死動物，剪取3～5 cm回盲部腸管，用4℃生理鹽水沖洗腸管，無菌濾紙吸干表面水分，肉眼觀察回盲部腸組織形態(tài)后，立即浸泡于4%多聚甲醛中固定，24 h后進(jìn)行石蠟包埋。鏡下觀察回盲部腸黏膜組織損傷情況，并參照結(jié)腸損傷評分方法[8-9]，對各組大鼠回盲部腸黏膜損傷情況進(jìn)行評分。（見表1）

表1 病理學(xué)判斷回盲部腸黏膜損傷的評分標(biāo)準(zhǔn)（分）

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組比較采用單因素方差分析，方差齊者用LSD，方差不齊者用Tamhane’s T2法。不滿足正態(tài)性者，使用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠回盲部腸組織形態(tài)學(xué)改變 空白組和假手術(shù)組大鼠腸管形態(tài)正常，黏膜無損傷；模型組大鼠出現(xiàn)腹腔粘連，梗阻部位以上的腸管明顯膨大，腸壁變薄、充血，梗阻部位以下的腸管癟陷萎縮；上巨虛組和曲池組大鼠梗阻部位以上腸管也出現(xiàn)擴(kuò)張、膨脹，腸壁充血水腫等現(xiàn)象，但其程度均低于模型組。（見圖3）

圖3 肉眼觀察各組大鼠腸管形態(tài)

2.2 各組大鼠回盲部腸黏膜損傷程度評分比較 空白組、假手術(shù)組大鼠回盲部腸黏膜損傷評分為0分；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠回盲部腸黏膜損傷評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，上巨虛組、曲池組大鼠回盲部腸黏膜損傷評分均明顯降低（P＜0.01）；與曲池組比較，上巨虛組大鼠回盲部腸黏膜損傷評分明顯降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠回盲部腸黏膜損傷評分比較s，分）

表2 各組大鼠回盲部腸黏膜損傷評分比較s，分）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與曲池組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 損傷評分空白組 10 0.00±0.00假手術(shù)組 10 0.00±0.00模型組 10 12.67±0.58a上巨虛組 10 6.67±1.15b c曲池組 10 9.00±1.00b

2.3 各組大鼠血清中IL-18、IL-1α表達(dá)比較 假手術(shù)組大鼠血清中IL-18、IL-1α含量與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-18、IL-1α含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，上巨虛組、曲池組大鼠血清中IL-18、IL-1α含量明顯降低（P＜0.01）；與曲池組比較，上巨虛組大鼠血清中IL-18、IL-1α含量明顯降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清中IL-18、IL-1α含量比較（x±s，pg/mL）

3 討 論

腸梗阻不僅會導(dǎo)致腸管本身的病理反應(yīng)，還會引起全身性的病理變化，導(dǎo)致重度感染、休克、多臟器衰竭等嚴(yán)重后果[10]。腸屏障功能變化是引起上述病理的機(jī)制之一。當(dāng)腸屏障功能受損時(shí)，腸道黏膜通透性增加，腸道細(xì)菌移動，促發(fā)細(xì)菌性炎癥反應(yīng)[11]，形成炎癥性腸梗阻。炎癥介質(zhì)是術(shù)后腸梗阻發(fā)生的關(guān)鍵因素，且術(shù)后腸梗阻的損傷程度及疾病持續(xù)時(shí)間與腸內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度密切相關(guān)[12]，所以積極抗炎治療，在腸梗阻的治療中發(fā)揮著重要作用。

白細(xì)胞介素-18（inereluekin-18，IL-18）作為機(jī)體重要的炎癥前細(xì)胞因子之一，參與多種免疫性疾病的發(fā)生。IL-18能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的分化成熟和促進(jìn)Th1細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)，并且增強(qiáng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、FASL的表達(dá)，從而促進(jìn)Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，在炎癥反應(yīng)中具有雙刃劍的作用[13]。唐月華等[14]研究表明活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-18含量顯著升高，認(rèn)為其可作為病情活動性、嚴(yán)重性及療效評價(jià)的參考指標(biāo)。白細(xì)胞介素-1（interleukin-1,IL-1）同樣作為一種重要的前炎癥細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要作用。IL-1可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，使白細(xì)胞易于與血管內(nèi)皮黏附，并直接刺激中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，參與炎癥的發(fā)生過程[15]。IL-1α能介導(dǎo)天然免疫，是啟動固有性免疫應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵，作為IL-1家族中一員，同樣能促進(jìn)其他炎癥因子的表達(dá)。有研究表明，單核細(xì)胞上存在的IL-1α，通過細(xì)胞接觸反應(yīng)，在單核細(xì)胞腫瘤發(fā)生機(jī)制方面發(fā)揮重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刺上巨虛、曲池能通過降低血清IL-18、IL-1α的表達(dá)，減輕腸黏膜的炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)腸黏膜的作用，可能為針刺治療不完全性腸梗阻的機(jī)制之一。

本次實(shí)驗(yàn)選取大腸合穴上巨虛與大腸經(jīng)合穴曲池進(jìn)行對比，探究它們在不完全性腸梗阻中治療作用的差異性。范鴻穎等[17]基于現(xiàn)代臨床文獻(xiàn)探討了上巨虛、曲池與大腸腑的聯(lián)系，結(jié)果表明上巨虛治療便秘及術(shù)后胃腸諸證最具優(yōu)勢，而曲池主治除了外經(jīng)病證也涉及部分消化系統(tǒng)病證，但與大腸腑的聯(lián)系不如上巨虛。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，雖然針刺上巨虛或曲池均能改善不完全性腸梗阻大鼠回盲部病理組織形態(tài)，降低大鼠血清中IL-18、IL-1α的表達(dá)，但上巨虛組療效優(yōu)于曲池組，存在穴位相對特異性。

不完全性腸梗阻是一個(gè)多因素、多機(jī)制共同參與和誘發(fā)的連續(xù)而復(fù)雜病理過程。針刺治療不完全性腸梗阻的作用機(jī)制與多種蛋白及炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。有研究表明中頻電腧穴刺激能增加腹部腫瘤所致不完全性腸梗阻患者血清中PLB、PBA、RBP的表達(dá)，改善患者的營養(yǎng)狀態(tài)[18]。梁芝國等[19]認(rèn)為針灸能通過調(diào)整5-羥色胺、去甲腎上腺素、乙酰膽堿代謝過程，通過乙酰膽堿的平滑肌收縮作用，有效治療麻痹型腸梗阻。本研究結(jié)果表明，針刺上巨虛、曲池能夠有效降低不完全性腸梗阻大鼠回盲部腸黏膜損傷評分及血清中IL-18、IL-1α含量，改善大鼠腸道炎癥反應(yīng)，且上巨虛穴優(yōu)于曲池穴，為不完全性腸梗阻非手術(shù)治療的有效選擇。