基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合GEO芯片分析百合烏藥湯治療胃癌的分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制*

任雪童，狄紫蕊，付冰倩，張 哲，杜艷茹

（1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生院，河北 石家莊 050091；2.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

胃癌現(xiàn)今仍然是全世界的一種重要癌癥，已成為第五位最常診斷的癌癥和第三大癌癥的死亡原因[1]。目前我國各年齡組的胃癌發(fā)病率已呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，全人群的發(fā)病率增長(zhǎng)趨勢(shì)也有所緩解，但仍高于世界平均水平[2]。中醫(yī)藥治療胃癌效果越發(fā)顯著且副作用較小，采用中醫(yī)藥對(duì)胃癌防治成為一大研究熱點(diǎn)，深入探索中醫(yī)藥治療胃癌的分子機(jī)制，對(duì)于胃癌患者的精準(zhǔn)治療具有重要臨床意義。

胃癌在中醫(yī)屬“胃脘痛”“噎膈”“反胃”“心腹痞”等范疇[3]。對(duì)胃癌的病機(jī)諸家學(xué)者認(rèn)為其正氣虧虛為根本，痰、瘀、毒、邪相互搏結(jié)為基本病機(jī)[4]。百合烏藥湯首載于陳修園《時(shí)方妙用》[5]，現(xiàn)代臨床中用于胃癌患者經(jīng)放療、化療后出現(xiàn)的胃陰虧虛、虛火上炎等證頗有療效[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)百合甲醇提取物、百合總生物堿能阻滯SGC-7901細(xì)胞于G2/M期，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡是抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一[7]。

目前對(duì)于中藥復(fù)方治療胃癌的藥效基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確，加之研究手段存在檢測(cè)靈敏度低等局限性，難以全面闡述藥物作用機(jī)制[8]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO，獲取有關(guān)正常胃黏膜與胃癌標(biāo)本的芯片，分析兩者中存在的差異表達(dá)基因，力求為胃癌腫瘤標(biāo)記物的進(jìn)一步研究提供參考。并對(duì)百合烏藥湯的主要活性成分進(jìn)行篩選，分析活性成分的作用靶點(diǎn)及生物通路，從而闡明百合烏藥湯治療胃癌可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中以“百合”“烏藥”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，按照口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，限定物種為“Homo sapiens”為篩選條件，以得到活性成分[9]。

1.2 藥物靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行藥物靶點(diǎn)的收集，將所得靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niPort（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中，校正所涉及的靶點(diǎn)信息和基因名稱。

1.3 胃癌GEO芯片差異分析 在GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢 索“gastric cancer”，篩 選 并 下 載GSE118916芯片和平臺(tái)數(shù)據(jù)，使用R軟件設(shè)定差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）絕對(duì)值＞1，矯正后P值（adjPvalue）＜0.05作為明顯差異基因的篩選條件，得出差異分析結(jié)果并導(dǎo)入到Excel表格中。熱圖繪制：安裝插件“packages”“pheatmap”及“Limma”包對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，并結(jié)合P值（adjPvalue）和FC的相關(guān)數(shù)值進(jìn)行篩選，選取上調(diào)、下調(diào)最明顯的前20個(gè)基因，并定義分組（C.正常對(duì)照組，T.腫瘤組）顏色、高度等繪制熱圖?；鹕綀D繪制：設(shè)置x軸與y軸最大值，先將基因統(tǒng)一設(shè)置為無差異基因，用“黑色”表示。再通過P、logFC進(jìn)行篩選。當(dāng)P＜0.05，logFC＞1，表示該基因上調(diào)，用“紅色”表示。當(dāng)P＜0.05，logFC＜1，表示該基因下調(diào)，用“綠色”表示。

1.4 治療胃癌活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的繪制“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”主要通過網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape3.2.1進(jìn)行構(gòu)建和分析。本研究將從上述“1.2”獲得的活性成分及靶點(diǎn)關(guān)系進(jìn)行導(dǎo)入以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中用“節(jié)點(diǎn)”（node）表示分子、靶蛋白，用“邊”（edge）表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。然后采用Network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確百合烏藥湯中較為重要的成分和靶點(diǎn)，尋找重要候選基因。

1.5 治療胃癌基因的蛋白互作和拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)主要借助BisoGenet和CytoNCA插件，其中Biso－Genet軟件主要從以下數(shù)據(jù)庫檢索：Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP）等。設(shè)置計(jì)算度中心性（DC）＞61，介度中心性（BC）＞600，篩選重要基因（標(biāo)紅的基因?yàn)楹蜻x基因）。獲得的相關(guān)活性成分及靶點(diǎn)則有可能直接或間接調(diào)控這些節(jié)點(diǎn)發(fā)揮重要作用。

1.6 治療胃癌基因GO富集分析 使用R軟件對(duì)百合烏藥湯治療胃癌的基因進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)富集的數(shù)目和顯著程度（p value閾值＜0.05，q value閾值＜0.05），取前20條富集過程，分別進(jìn)行生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、基因過程（molecular function，MF）的富集，繪制柱狀圖。

1.7 治療胃癌基因KEGG富集分析及通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制 使用R軟件，并安裝插件DOSE、clusterProfiler、enrichplot、colorspace、stringi、ggplot2進(jìn)行分析。根據(jù)基因富集的數(shù)目和顯著程度（p value閾值＜0.05，q value閾值＜0.05）進(jìn)行富集分析，取前20條KEGG通路，將得到的KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，根據(jù)degree值大小，繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 百合烏藥湯活性成分與靶點(diǎn) 按照口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，得到與胃癌相關(guān)的百合烏藥湯活性成分16個(gè)，其中百合7個(gè)，烏藥9個(gè)。Drugbank顯示成分基因373個(gè)。（見表1）

表1 百合-烏藥主要成分

2.2 胃癌GEO芯片差異分析GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE118916芯片與平臺(tái)文件，獲取有關(guān)正常胃黏膜與胃癌標(biāo)本的芯片，分析兩者中存在的差異表達(dá)基因。樣本中正常對(duì)照組15個(gè)樣本，腫瘤組15個(gè)樣本。利用R軟件及相關(guān)軟件包對(duì)GSE118916表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：使用R軟件設(shè)定logFC絕對(duì)值＞1，矯正后P＜0.05，得出正常對(duì)照組與腫瘤組差異基因1 143個(gè)，分別取上調(diào)和下調(diào)最明顯的前20個(gè)基因，分析并繪制熱圖與火山圖。熱圖中橫坐標(biāo)為樣本名稱（正常對(duì)照組在前，腫瘤組在后），縱坐標(biāo)為基因名稱。綠色：低表達(dá)，黑色：中表達(dá)，紅色：高表達(dá)。如差異基因FNDC1在腫瘤組高表達(dá)，在正常對(duì)照組低表達(dá)。（見圖1）火山圖中，橫坐標(biāo)中l(wèi)ogFC＞0時(shí)，表示在腫瘤組上調(diào)。logFC＜0時(shí)，表示在腫瘤組下調(diào)。用顏色表示為，黑色：在正常對(duì)照組與腫瘤組無差異基因；綠色：在正常對(duì)照組上調(diào)，在腫瘤組下調(diào)；紅色：在正常對(duì)照組下調(diào)，在腫瘤組上調(diào)。（見圖2）

圖1 正常對(duì)照組與胃癌患者差異基因熱圖

圖2 正常對(duì)照組與胃癌患者差異基因火山圖

2.3 百合烏藥湯治療胃癌的活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將百合烏藥湯與胃癌差異基因取交集后，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，繪制分子基因網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)不同靶點(diǎn)與有效成分對(duì)應(yīng)關(guān)系的數(shù)目，進(jìn)行分類展示。共得到潛在基因靶點(diǎn)31個(gè)，對(duì)應(yīng)的有效成分10個(gè)。色原酮（Nubigenol、6,7-dimethoxy-2-(2-phenylethyl)、chromone）、豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPEC）、波爾定堿（Boldine）、去甲波爾定（Norboldine）、槲皮素（quercetin）、異松脂酸（Isopimaric acid）、去甲秋水仙堿（3-Demethylcolchicine）、谷固醇（beta-sitosterol），其中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較多的烏藥的活性成分槲皮素（對(duì)應(yīng)27個(gè)靶點(diǎn)）及對(duì)應(yīng)活性成分較多的PTGS2（對(duì)應(yīng)8個(gè)活性成分）、ADRB2（對(duì)應(yīng)8個(gè)活性成分）可能為百合烏藥湯治療胃癌關(guān)鍵活性成分。（見圖3）

圖3 百合烏藥湯治療胃癌分子基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 百合烏藥湯治療胃癌基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控往往是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，多見于直接調(diào)控靶點(diǎn)或間接調(diào)控相結(jié)合的調(diào)控方式，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)則是為尋找直接或間接關(guān)系提供了可能[10]。將百合烏藥湯與胃癌差異基因取交集后，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖4）在分子基因網(wǎng)絡(luò)圖的基礎(chǔ)上，使用Bisogenet和CytoNCA插件，設(shè)置計(jì)算度中心性（DC）＞61，介度中心性（BC）＞600，構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，共篩選出3個(gè)候選基因VCM1、HSPB1、MYC。可見VCM1、HSPB1、MYC靶點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。（見圖5）

圖4 百合烏藥湯靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 百合烏藥湯治療胃癌基因拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

2.5 百合烏藥湯治療胃癌基因GO富集分析 使用R軟件，根據(jù)百合烏藥湯治療胃癌的基因進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)富集條目和顯著程度，取前20條GO富集過程，分別繪制BP、CC、MF柱狀圖。GO富集分析可見，在生物過程方面，這些靶點(diǎn)涉及對(duì)脂多糖（response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、白細(xì)胞游走（leukocyte migration）、細(xì)胞外基質(zhì)組織（extracellular matrix organization）、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織（extracellular structure organization）、對(duì)氧水平的反應(yīng)（response to oxygen levels）等生物過程，在分子功能方面，靶點(diǎn)涉及細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、整合素結(jié)合（integrin binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性（protein kinase regulator activity）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）等分子功能。在細(xì)胞組分方面，靶點(diǎn)涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）、膜筏（membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）、膜區(qū)域（membrane region）、細(xì)胞的頂端部分（apical part of cell）、膠原蛋白-包含細(xì)胞外基質(zhì)（collagen-containing extracellular matrix）等組分。（見圖6~8）

圖6 百合烏藥湯治療胃癌基因生物過程（BP）圖

圖7 百合烏藥湯治療胃癌基因細(xì)胞成分（CC）圖

圖8 百合烏藥湯治療胃癌基因分子功能（MF）圖

2.6 百合烏藥湯治療胃癌基因KEGG富集分析及基因-通路網(wǎng)絡(luò)圖 使用R軟件，根據(jù)基因富集的數(shù)目和顯著程度（p value閾值＜0.05，q value閾值＜0.05）進(jìn)行富集分析，共富集到34條通路關(guān)系。將KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，取前20條通路。根據(jù)degree值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖9）其中AGE-RAGE信號(hào)通路（9個(gè)靶點(diǎn)29%），腫瘤壞死因子信號(hào)通路（9個(gè)靶點(diǎn)，29%），液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（7個(gè)靶點(diǎn)，22%），IL-17信號(hào)通路（6個(gè)靶點(diǎn)，19%），NF-κB信號(hào)通路（6個(gè)靶點(diǎn)，19%），癌癥中miRNA（7個(gè)靶點(diǎn)，22%），人類巨細(xì)胞病毒感染（6個(gè)靶點(diǎn)，19%），阿米巴?。?個(gè)，19%），EB病毒感染（5個(gè)，16%）等信號(hào)通路，對(duì)應(yīng)的IL6、ICAM1、PRKCB、CCL2基因數(shù)目較多。

圖9 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

中國作為胃癌的高發(fā)國家，在臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)常是中晚期，發(fā)病年齡以中老年居多[10]。隨著病程的延長(zhǎng)，胃癌多在寒邪凝滯的基礎(chǔ)上有“癌毒”積熱的臨床表現(xiàn)[5]。一方面脾胃虛弱，氣血虧虛，使正氣虛損加重，另一方面陰虛化熱，“癌毒”更熾，形成寒熱錯(cuò)雜之證。百合烏藥湯其辨證關(guān)鍵為寒熱錯(cuò)雜，氣機(jī)失調(diào)，在臨床中常加減應(yīng)用于胃癌的辨證用藥，收效甚佳[11-12]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從分子機(jī)制角度，闡述百合烏藥湯治療胃癌的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供理論參考。

本研究篩選得到百合烏藥湯活性成分16個(gè)，10個(gè)成分具有潛在的治療胃癌的作用。作用靶點(diǎn)較多的2個(gè)活性成分為槲皮素（27個(gè)靶點(diǎn)）和豆甾醇（5個(gè)靶點(diǎn)）[13-15]，其中關(guān)于槲皮素、豆甾醇作用于胃癌的相關(guān)機(jī)制分析的文獻(xiàn)，也證實(shí)本研究的可行性。

構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，共篩選出3個(gè)候選基因VCM1、HSPB1、MYC。其中關(guān)于熱休克蛋白（HSP）的研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白濃度升高與大多數(shù)癌癥類型的生存前景不佳有關(guān)[16]。HSP升高的意義在于其在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)特性方面的重要作用。MYC是胃癌的一種癌基因，負(fù)責(zé)細(xì)胞過度生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控、代謝和凋亡等基因的轉(zhuǎn)錄激活，并在胃癌中過度表達(dá)[17]。在一項(xiàng)胃癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，MYC-調(diào)控基因的表達(dá)譜呈現(xiàn)出不同組織學(xué)亞型的胃癌細(xì)胞，在MYC調(diào)控的基因表達(dá)譜中，其共同特點(diǎn)為基因的改變，這一發(fā)現(xiàn)可能使MYC在胃癌的治療中成為一新藥靶點(diǎn)。

GO富集分析顯示，百合烏藥湯主要涉及脂多糖、氧化應(yīng)激、血紅素結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)等方面。脂多糖（LPS）為革蘭氏陰性桿菌外膜的組成部分，具有雙重生物學(xué)作用，作為免疫分子可以刺激機(jī)體的天然免疫反應(yīng)，激發(fā)機(jī)體免疫功能，在胃癌的發(fā)展中發(fā)揮巨大作用。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖可通過NF-κB激活促進(jìn)胃癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[18]。槲皮素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡而抑制腫瘤的增殖。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NO生成和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（INOS）的表達(dá)[19]。并通過抑制LPS來抑制NF-κB的激活。在氧化應(yīng)激方面[20]，槲皮素可增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位水平，增加AGS細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)，并通過凋亡細(xì)胞死亡降低細(xì)胞總活力。在血紅素結(jié)合方面，研究表明斛皮素可引起血紅素氧化酶-1（HO-1）mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著升高[19]。豆甾醇則可通過抑制細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期阻滯、線粒體介導(dǎo)凋亡和抑制JAK/STAT信號(hào)通路達(dá)到對(duì)人胃癌細(xì)胞的抗腫瘤作用[21]。

KEGG富集通路顯示，百合烏藥湯治療胃癌主要涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、NF-κB等信號(hào)通路，以及癌癥中miRNA、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、人類巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染等。其相對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因以IL-6、ICAM1、PRKCB、CCL2為主。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6是化療耐藥的關(guān)鍵因素。這些發(fā)現(xiàn)提示IL-6抑制劑的潛在治療可應(yīng)用于提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療的反應(yīng)[22]。最新研究表明，在試圖找出調(diào)控早期胃癌（EGC）的樞紐基因的研究中發(fā)現(xiàn)，ICAM1與胃癌的預(yù)后不良有關(guān)，因此ICAM1可能是ECG的一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后和診斷生物標(biāo)志物[23]。研究發(fā)現(xiàn)HSACIRC 0092306（一種新的環(huán)狀RNA）能抑制MKN-45細(xì)胞miR-197-3p表達(dá)，促進(jìn)腫瘤啟動(dòng)子蛋白激酶Cβ（PRKCB）的表達(dá)，從而加速胃癌的發(fā)展[24]。研究發(fā)現(xiàn)CCL2既能維持耐藥癌細(xì)胞的耐藥，又能使敏感的癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，CCL2的敲除或自噬誘導(dǎo)成功地逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性，在化療耐藥的生物標(biāo)志物和干預(yù)靶標(biāo)上具有潛在價(jià)值[25]。在TNF-α信號(hào)通路在胃癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞存活基因可上調(diào)TNF、TNFR2、Tradd、TRAF2、CFLIP和NFKB2，而細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)因子如TNFR1和CASP3被下調(diào)[26]。其結(jié)果表明，TNF/TNFR2結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞存活基因在GC中表達(dá)上調(diào)，有利于其促腫瘤作用，而CASP3和TNFR1等促凋亡基因表達(dá)下調(diào)，提示腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖過程不平衡。這個(gè)過程也可能受到復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響。EBV相關(guān)性胃癌（EBVaGC）約占胃癌全部病例的9%，EB病毒在胃癌的進(jìn)展中具有重大作用[27]。在槲皮素治療EB病毒相關(guān)性胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素可誘導(dǎo)SNU719細(xì)胞的凋亡，對(duì)DNMT1和DNMT3A表達(dá)的完全抑制作用明顯，提高了F啟動(dòng)子的使用頻率，降低EB病毒的潛伏期，槲皮素有可能成為抗EBV和胃癌的抗病毒和抗腫瘤藥物[28]。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討百合烏藥湯治療胃癌靶點(diǎn)的相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，可有效顯示其有效成分與疾病靶點(diǎn)的作用機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供更合理具體的指導(dǎo)。但是本研究也存在一定的局限性，藥物有效成分篩選不全面，以及部分有效成分和信號(hào)通路有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考證。