逐瘀止痛遠紅外灸貼體外透皮實驗研究*

畢建云，趙東升，武雪靜，張 靜

（1.山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；3.中國藥科大學，江蘇 南京 211198）

血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，該方劑作為理血劑具有化瘀止痛的功效。血府逐瘀湯由桃仁、紅花、當歸等11味藥材組成，其功用涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、婦科、骨科等多個系統(tǒng)[1-2]。逐瘀止痛遠紅外灸貼是在原方的基礎上，采用一種方便實用，效果顯著的外用貼膏劑作為載體，輔助物理加熱，穴位灸貼的方式，治療原發(fā)性痛經(jīng)[2]。體外透皮性能是評價經(jīng)皮給藥制劑生物利用度高低的重要指標，也是控制制劑質量的重要途徑。藥物經(jīng)皮擴散過程復雜，影響因素很多[3]。為了解逐瘀止痛遠紅外灸貼的透皮吸收情況，本實驗進行了體外透皮試驗研究，對組方中有效成分芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的透皮吸收特性進行了考察。

1 材 料

1.1 藥物與試劑 氮酮（鄭州津北化工有限公司）；芍藥苷（批號：FY1265VX53J，供含量測定用，南通飛宇生物科技有限公司）；阿魏酸（批號：110773-201915，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；藁本內(nèi)酯（批號：181216，供含量測定用，中國藥品生物制品鑒定所）。甲醇、乙腈為色譜純，娃哈哈純凈水。

1.2 主要儀器LC-20A型液相儀（含SPD-20A紫外可見檢測器、LC-20AT泵和LC-Solution工作站，日本島津）；FA2004B電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠）；ZNCL-BS型恒溫磁力攪拌器（上海越眾儀器設備有限公司）；FA2004B電子分析天平（上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司）；改良型Franz擴散池（自制）。

1.3 實驗動物 正常健康7周齡SPF級健康小鼠70只，雌雄各半，體質量18~22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：魯動質syxk（魯）20190003號。適應性飼養(yǎng)條件：室溫保持21~24℃，濕度保持45%左右，明暗周期12 h，予以普通飼料飼養(yǎng)，自由進食、飲水。實驗中所涉及的小鼠實驗均經(jīng)實驗動物管理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 供試皮膚的制備 將小鼠背部毛用剃須刀剃毛后，脫頸椎處死，剝離整個皮膚并除去皮下脂肪組織、血管及內(nèi)膜等，用蒸餾水沖洗，再用生理鹽水反復沖洗后使用。

2.2 體外透皮實驗研究 采用改良型Franz擴散裝置（接受室體積為18.0 mL，接受室有效接觸面積為2.54 cm2），固定裝置。將新鮮制備好的離體鼠皮用生理鹽水洗凈，用脫脂棉吸干表面水分，將逐瘀止痛遠紅外灸貼貼于皮膚表面，然后將其固定在Franz擴散池中間，使角質層朝向供給池。接受室加滿預溫37℃的50%乙醇生理鹽水，磁力攪拌器保持恒溫恒速。分別于2、6、8、12、16、24 h將接受液全部取出，平行4份，每次合并接受液，蒸干，用甲醇溶解并定容至1 mL，以0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，進樣測定，并計算累積滲透量[4-5]。

2.3 芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯透皮滲透量測定

2.3.1 色譜條件 芍藥苷與阿魏酸的色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85）；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；進樣量：20μL；柱溫：30℃。芍藥苷的相對保留時間為18.0 min，阿魏酸的相對保留時間為33.6 min[6-8]。

藁本內(nèi)酯的色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：325 nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。藁本內(nèi)酯的相對保留時間為8.4 min[9]。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯對照品，配成濃度分別為1.045 0、0.486 5、2.002 0μg/mL的對照品溶液。

2.3.3 線性關系考察 精密移取不同濃度的芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯對照品10μL，芍藥苷進樣量分別為0.002 77、0.005 66、0.011 00、0.020 00、0.031 20、0.040 00μg；阿魏酸進樣量分別為0.006 40、0.001 34、0.002 45、0.004 96、0.009 60、0.020 10μg；藁本內(nèi)酯進樣量分別為0.000 56、0.001 06、0.002 58、0.004 97、0.009 56、0.040 00μg，以進樣量為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，分別繪制標準曲線。得線性回歸方程分別為Y=2 323 363X+5.61，r=0.999 9；Y=37 624 211X-300.4，r=0.999 9；Y=804 264.8X+330.8，r=0.9999。結果芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯分別在0.002 77～0.040 00、0.006 40～0.020 01、0.000 56～0.040 00μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.4 專屬性考察 取去除赤芍、川芎、當歸以外的其他藥材，按逐瘀止痛遠紅外灸貼的制法制成缺赤芍、川芎、當歸空白樣品，按“2.2”透皮實驗方法操作，制成透皮24 h空白溶液。精密吸取透皮吸收供試品溶液、空白溶液、對照品溶液各10μL，按上述色譜條件測定，結果對照品溶液與供試品溶液在相同的保留時間有相應的峰，空白對照無干擾峰。說明該測定方法的專屬性好、無干擾。（見圖1~2）

圖1 芍藥苷和阿魏酸的HPLC圖

2.3.5 精密度試驗 精密吸取同一透皮吸收供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，測得峰面積，結果芍藥苷RSD為1.64%，阿魏酸RSD為1.16%，藁本內(nèi)酯RSD為0.96%。表明儀器精密度良好。

圖2 藁本內(nèi)酯的HPLC圖

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一透皮吸收供試品溶液，按0、2、4、8、12、24 h分別進樣，測定色譜峰面積，結果芍藥苷RSD為1.66%，阿魏酸RSD為1.61%，藁本內(nèi)酯RSD為0.91%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗 采用“2.2”項下體外透皮實驗方法，制備6份24 h透皮吸收液分別進樣，測定色譜峰面積，計算24 h芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯的透過量，結果芍藥苷RSD為1.78%，阿魏酸RSD為1.61%，藁本內(nèi)酯RSD為1.02%。表明該體外透皮實驗方法可行。

2.3.8 加樣回收率試驗 取芍藥苷16.110 mg、阿魏酸7.988 mg、藁本內(nèi)酯3.530 mg，精密稱定，分別置于20 mL容量瓶中，用50%乙醇生理鹽水溶解并定容，搖勻，制備對照品儲備液，精密量取適量上述對照品儲備液制成每毫升含芍藥苷16.79、33.57、40.30μg；阿魏酸8.32、16.64、19.9μg；藁本內(nèi)酯3.678、7.355、8.825μg的對照品溶液。精密量取上述3種對照品溶液2.0 mL，各3份，精密加入空白基質，按照“2.2”項下的實驗方法制備透皮24 h的樣品，按照“2.3.1”項下的測定方法記錄色譜圖，計算含量，測定回收率。結果可知芍藥苷的平均回收率為97.15%，RSD為1.05%；阿魏酸的平均回收率為96.83%，RSD為0.86%；藁本內(nèi)酯的平均回收率為96.60%，RSD為0.58%。說明方法回收率良好，符合要求。（見表1）

表1 3種成分回收率試驗結果

續(xù)表1：

2.4 氮酮用量和接收介質的考察

2.4.1 氮酮用量的考察 逐瘀止痛遠紅外灸貼制備過程中，選擇加入0、1%、3%、5%的氮酮溶液，以芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯Q24及增滲倍數(shù)為考察指標，篩選氮酮的加入量[10]。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知，氮酮對芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯均有一定的促透作用，3%氮酮對三者的促透作用均優(yōu)于5%的氮酮，綜合促透效果及經(jīng)濟效益最終選擇3%氮酮為宜。（見表2）

表2 氮酮用量的考察（μg/cm2）

2.4.2 接受介質的選擇 選擇以生理鹽水30%、50%、70%的生理鹽水乙醇溶液為透皮接受液，以芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的Q24為考察指標，篩選最適宜的接受介質。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知，選擇50%生理鹽水乙醇溶液為宜。（見表3）

表3 接收介質的考察（μg/cm2）

2.5 透皮吸收滲透動力學模型擬合 按照“2.2”項下的方法進行實驗，分別在1、2、6、8、12、16、24 h將接受液全部取出，平行4份，每次合并接受液，接受液蒸干，用甲醇溶解并定容至1 mL，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，測定接收液中芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的濃度，計算各個時間點的累積透過量，并進行方程擬合[11-12]。

累積透過量Q對t1/2進行回歸，得線性方程分別為芍藥苷：Q=1.258t1/2-3.392，r=0.990 9；阿魏酸：Q=0.605t1/2-1.627，r=0.996 1；藁本內(nèi)酯：Q=0.252t1/2-0.401，r=0.996 6。即三者的Q與t1/2均具有相關性。說明三者從逐瘀止痛遠紅外灸貼中向離體小鼠皮膚滲透符合Higuich方程，均具有較好的體外透皮性能。芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的Q24分別為26.429、13.103、5.790μg/cm2。以時間t為橫坐標，各時刻芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯Q24為縱坐標，繪制逐瘀止痛遠紅外灸貼的經(jīng)皮滲透曲線，由圖可以看出，3種成分的透皮量藁本內(nèi)酯<阿魏酸<芍藥苷，這也與各成分的提取量有關。（見圖3）

圖3 芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯經(jīng)皮滲透曲線圖

3 討 論

影響藥物透皮吸收的因素主要來自藥物、給藥系統(tǒng)和皮膚3個方面。藥物本身的性質是決定藥物透皮透過速率的主要因素，但同時藥物透皮吸收也受藥物在給藥系統(tǒng)中的分散狀態(tài)、系統(tǒng)中介質對藥物的親和力及皮膚差異等條件的制約。藥物相對分子質量＜400、油水分配系數(shù)（以正丁醇-水為分配體系測得）的對數(shù)值（lgP）1～4為宜，一般認為藥物的油/水分配系數(shù)大，脂溶性大的藥物易溶解在角質層，并易擴散通過。芍藥苷（分子量：480）、阿魏酸（分子量：194）及藁本內(nèi)酯（分子量：190，lgP=2.64±0.06）中后兩者具有較好的透皮性能，但是研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷也具有較好的皮膚透過性。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷在慢性壓迫性損傷大鼠中，可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路緩解神經(jīng)性疼痛；阿魏酸可以抑制磷脂酶A2（PLA2），從而阻止花生四烯酸的游離，阻斷生成血栓素A2（TXA2），從而抑制血小板聚集與釋放，具明顯的抗血栓作用。藁本內(nèi)酯對縮宮素所致正常雌性小鼠子宮平滑肌劇烈收縮具有明顯的拮抗作用，可使小鼠扭體反應的潛伏期縮短，次數(shù)減少，顯示其對實驗性痛經(jīng)模型小鼠具有鎮(zhèn)痛作用[13-14]。

在促滲劑的選擇中，氮酮安全價廉易得，并且不與貼膏中的其他藥用成分產(chǎn)生反應，所以成型中作為首選。研究過程中也考察過桉葉油，但是無論是成型還是對芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的促透方面都不及氮酮，因此最終確定氮酮作為促透劑。按成型工藝確定的方法，在逐瘀止痛遠紅外灸貼混合稠膏中加入設計量的氮酮，使氮酮占總膏體的量分別為0、1%、3%、5%制得不同氮酮含量的貼膏，發(fā)現(xiàn)氮酮含量為3%時芍藥苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯的Q24較大，加入5%氮酮三者的Q24反而下降，這就表明氮酮的促透作用與其濃度有一定關系，但又不完全為劑量依賴性，對于不同的藥物要選擇其最佳的促透濃度。這也符合文獻中氮酮的促透規(guī)律。同時處方中的揮發(fā)油也有較好的促滲作用，并且可能與氮酮促滲作用機制相似，都是作用于角質層的脂質雙分子層，干擾脂質分子的有序排列，增加脂質的流動性，有助于藥物分子的擴散[15]。