HPLC-ELSD指紋圖譜結(jié)合統(tǒng)計學評價不同產(chǎn)地苦楝皮藥材質(zhì)量*

童培珍，潘禮業(yè)，索彩仙，何廣銘，何嘉瑩，李國衛(wèi)

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

2020年《中華人民共和國藥典》規(guī)定苦楝皮為楝科植物川楝Melia toosendan Sied.et Zucc.或楝Melia azedarach L.的干燥樹皮和根皮，具有殺蟲、療癬等功效；臨床常用于蛔蟲病、蟯蟲病，蟲積腹痛，外治瘙癢疥癬[1]?？嚅に幉闹兄饕ㄩ?、苦楝酸、苦楝萜酸甲酯等三萜類及兒茶素類化合物[2-5]。苦楝皮的主要有效成分是川楝素，具有驅(qū)蟲、抑制神經(jīng)遞質(zhì)、抗肉毒等多種生物活性[6]。研究表明川楝素能夠成功逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性，可作為一種新型的PI3K抑制劑，用于逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥性[7]。川楝素能夠誘導肝細胞性肝癌細胞線粒體依賴性凋亡，故其在體內(nèi)外具有抗癌作用[8]。目前，已有文獻對不同部位及來源的苦楝皮藥材含量或指紋圖譜等方面進行研究，但仍缺乏綜合性評價方法，未能全面評價苦楝皮藥材質(zhì)量[9-10]。近年來，采用質(zhì)量分析結(jié)合統(tǒng)計學對中藥材質(zhì)量評價已較為成熟，該模式能全面反映中藥材內(nèi)在質(zhì)量[11-12]。本研究采用HPLC-ELSD法對不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材特征圖譜進行測定并比較，結(jié)合聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材進行質(zhì)量分析，并同時測定川楝素含量，通過對不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材進行更全面的評價，以期為苦楝皮藥材的綜合質(zhì)量控制提供參考。

1 材 料

1.1 儀器Waters ARC型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Alltech 3000型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech公司）；XP26型百萬分之一電子天平、ME204E型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 川楝素對照品（批號：111842-201804，含量：96.9%）、兒茶素（批號：110877-201604）、表兒茶素（批號：110878-200102）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為分析純；乙腈、甲酸均為色譜純；超純水為實驗室自制。

苦楝皮藥材共12批，購于廣東、廣西、湖北、安徽等地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為楝科植物楝Melia azedarach L.的干燥樹皮，信息見表1。

表1 苦楝皮藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 苦楝皮藥材特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件Thermo Acclaim C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0~15 min，8%~13%A；15~50 min，13%~55%A）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20μL；蒸發(fā)光散射檢測器：漂移管溫度：110.0℃；載氣流量：2.7 L/min。

2.1.2 對照品溶液的制備 取川楝素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100μg的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過四號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出，放冷，補質(zhì)量，4 000 r/min離心10 min，精密移取上清液25 mL至蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用70%甲醇溶解至5 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S1），按“2.1.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示各色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（S1），按“2.1.1”項下色譜條件，分別在0、2、5、10、15、24 h進樣測定，結(jié)果顯示各色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.3 重復性試驗 取同一藥材粉末（S1）約1.0 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定。結(jié)果顯示各色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.1.5 樣品測定及分析

2.1.5.1 共有峰的確定 將得到的12批苦楝皮藥材特征圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》進行匹配和共有峰標識，并生成對照圖譜，見圖1~2。以7號峰為參照峰，12批藥材各共有峰相對保留時間RSD在0.01%~0.24%范圍內(nèi)，說明出峰時間較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性，可初步定為苦楝皮的指標成分。經(jīng)對照品指認，共確定3個成分：5號峰（兒茶素），6號峰（表兒茶素），7號峰和8號峰（川楝素）。其中7號峰為其藥理藥效成分[3-4]，故選定為參照峰。12批苦楝皮相對峰面積RSD為6.80%~108.35%，其中S1~S6（廣東、廣西）6批苦楝皮藥材峰3~峰6的相對峰面積較S7~S12（安徽、湖北）低，說明不同產(chǎn)地的藥材存在一定差異，結(jié)果見表2。

表2 苦楝皮藥材指紋圖譜共有峰相對峰面積

圖1 12批苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜疊加圖

圖2 12批苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式

2.1.5.2 指紋圖譜相似度評價 以生成的共有模式為對照指紋圖譜，12批樣品的相似度在0.720~0.998范圍內(nèi)，除了S2、S3外，其余批次藥材相似度均在0.900以上，說明不同產(chǎn)地藥材整體質(zhì)量較為穩(wěn)定。（見表3）

表3 12批苦楝皮藥材相似度評價結(jié)果

2.1.5.3 聚類分析 將12批苦楝皮色譜峰峰面積導入SPSS 20.0軟件對4個產(chǎn)地藥材樣品進行聚類分析，采用組間聯(lián)接法，選用歐氏距離進行聚類分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，聚類分析可將12批苦楝皮主要分成2大類，Ⅰ類包括S1~S6、，即廣東與廣西樣品為一類；Ⅱ包括S7~S12即安徽亳州、湖北襄陽樣品為一類。總體看來，地理位置相近的樣品可聚為一類，說明質(zhì)量具有一定相似性，與相似度分析的評價結(jié)果相一致。

圖3 聚類分析結(jié)果

2.1.5.4 共有峰主成分分析 對12批苦楝皮藥材共有峰進行主成分分析，以8個共有峰峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件進行標準化處理，計算主成分的特征值、方差貢獻率及綜合得分，對各產(chǎn)地的苦楝皮藥材進行評價，見表4，碎石圖見圖4。由表4可知，前2個成分的特征值為5.120、2.106，均大于1，對總方差的累積貢獻率達90.319%，可代表苦楝皮指紋圖譜共有峰的大部分信息，故選擇成分1、成分2作為第一、第二主成分。由碎石圖可見曲線存在一個明顯的拐點，說明前2個主成分基本體現(xiàn)出不同產(chǎn)地不同批次苦楝皮藥材之間的相似度和差異性。初始因子載荷矩陣見表5，第一主成分載荷較高的有：峰3、峰4、峰5（兒茶素）、峰6（表兒茶素），第二主成分載荷較高僅有峰1（特征值大于0.8）。以第一、第二主成分為變量，得到投影圖，見圖5，前2名變量的權(quán)重值為0.966、0.947，對應峰5（兒茶素）和峰6（表兒茶素）。與上述分析結(jié)果一致，即可判定峰5、6為評價各產(chǎn)地苦楝皮藥材質(zhì)量的重要因素。

表4 主成分特征值及方差

表5 主要因子載荷矩陣表

圖4 碎石圖

圖5 旋轉(zhuǎn)空間中的成分圖

2.1.5.5 綜合評價 針對第一、第二主成分按方差貢獻率加權(quán)計算綜合得分，結(jié)果見表6。綜合得分排名前3的樣品均為安徽省亳州市；排名前6的樣品中，安徽省亳州市3批、湖北省襄陽市2批、廣東省廣州市1批；排名前9的樣品中，安徽省、湖北省、廣東省產(chǎn)地的樣品各3批。從綜合評價得分來說，安徽省的苦楝皮藥材質(zhì)量較優(yōu)，湖北省次之，廣西省的苦楝皮藥材質(zhì)量相對較劣。

表6 綜合得分排序表

2.2 苦楝皮藥材含量測定

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密稱定川楝素對照品2.156 mg，加入10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為川楝素貯備液，精密量取上述川楝素對照品貯備液，用甲醇稀釋為19.682、49.206、98.412、196.823、492.058μg/mL的 對 照 品 溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。川楝素線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=1.653x+2.496，R2=0.999，結(jié)果表明在19.682~984.116μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 加樣回收率試驗 取已知含量的苦楝皮藥材粉（S1）約0.5 g，精密稱定，平行6份，加入與含量等量的對照品，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結(jié)果川楝素的平均回收率為103.65%，RSD為3.81%。（見表7）

表7 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.2.3 含量測定結(jié)果 精密吸取對照品溶液10、20μL及苦楝皮藥材供試品溶液20μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算川楝素含量；根據(jù)2020年《中華人民共和國藥典》“苦楝皮”項下測定苦楝皮藥材川楝素含量，結(jié)果見表8。由結(jié)果可知，HPLC-ELSD法測定苦楝皮藥材川楝素含量與UPLC-MS法測定含量偏差在5.0%以內(nèi)，說明兩者測定苦楝皮中川楝素含量測定結(jié)果無明顯差異?？傮w來說，廣東和廣西的苦楝皮藥材中川楝素含量（均值為0.122%）高于安徽省及湖北省（均值為0.054%），說明不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材存在質(zhì)量差異。

表8 苦楝皮藥材含量測定結(jié)果（%）

3 討 論

川楝素為苦楝皮藥材的有效成分，其紫外特征吸收波長為210 nm左右，屬于末端吸收，紫外檢測時基線波動較大，所用流動相為乙腈和甲酸水，甲酸紫外截止波長為210 nm，故容易受到干擾。且前期研究發(fā)現(xiàn)苦楝皮藥材在210 nm波長下，HPLC指紋圖譜色譜峰的個數(shù)少，不利于分析，而采用HPLCELSD法測定能有效解決上述問題。

HPLC-ELSD法和UPLC-MS法測定苦楝皮中川楝素含量偏差在5.0%以內(nèi)，說明兩者測定苦楝皮中川楝素含量測定結(jié)果無明顯差異。UPLC-MS法測定含量準確度高，但其成本高于HPLC-ELSD法；HPLC-ELSD法不僅測定了苦楝皮中川楝素含量，也對苦楝皮藥材指紋圖譜進行測定，但HPLC-ELSD法靈敏度低于UPLC-MS法，且無法進行全波掃描，有可能存在色譜峰不純情況。

本研究建立了4個產(chǎn)地的苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式，標定了8個共有峰，通過化學指認了其中的4個成分。對不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜采用相似度、聚類和主成分進行分析。12批次苦楝皮藥材的相似度范圍為0.720~0.998，除了廣東2批（S2、S3）小于0.900以外，其他各批次藥材均在0.900以上，說明不同產(chǎn)地間的藥材具有良好的相似度。聚類分析結(jié)果將苦楝皮藥材分成兩大類，總體來看，廣東與廣西苦楝皮藥材質(zhì)量大體相近，安徽省與湖北省苦楝皮藥材質(zhì)量大體相近。廣東、廣西產(chǎn)地和安徽、湖北產(chǎn)地的苦楝皮藥材間存在較顯著差異，廣東、廣西產(chǎn)地苦楝皮藥材中川楝素整體含量高于安徽、湖北產(chǎn)地，而峰3~峰6相對峰面積遠小于安徽、湖北產(chǎn)地，初步推斷地理位置及氣候?qū)е聫V東、廣西產(chǎn)地的苦楝皮藥材中色譜峰7（川楝素）峰面積較安徽、湖北產(chǎn)地大，峰3~峰6（兒茶素類）峰面積較安徽、湖北產(chǎn)地小?？嚅ぶ饕ㄩ?、苦楝萜醇內(nèi)酯等三萜類化合物和兒茶素等多酚類化合物。由于廣東省和廣西省地處低緯度地區(qū)，主要為亞熱帶季風氣候，其特點為夏長冬短，氣溫高，降水少，霜日少，日照多，雷暴頻繁，全年水熱同期，雨量充沛；而湖北省和安徽省地處中緯度，屬于季風氣候，均具有南北過渡地帶的天氣氣候特征，氣候溫和，雨量適中，春寒多雨，秋高氣爽，四季分明，春秋多變。所以可能為地理氣候不同導致了苦楝皮藥材所含成分的差異。從綜合得分來說，安徽省的苦楝皮藥材質(zhì)量較優(yōu)，湖北省次之，但苦楝皮主要用于治療蛔、蟯蟲病，蟲積和疥癬瘙癢，其活性成分為川楝素[13-14]，因此，結(jié)合藥理臨床作用和含量測定結(jié)果，認為廣東、廣西產(chǎn)地的苦楝皮藥材質(zhì)量較優(yōu)。

本研究建立了苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜方法，并同時測定了不同產(chǎn)地苦楝皮藥材中川楝素含量，分析方法準確、可靠、專屬性強，可為苦楝皮藥材質(zhì)量控制提供可靠的分析方法與參考依據(jù)。