葛根總黃酮聯(lián)合三氧化二砷體外誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

陳 婷，蔡亞云，沈 群

（1.如皋市人民醫(yī)院，江蘇 如皋 226500；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓細(xì)胞性白血病的特殊亞型。全反式維甲酸和/或砷劑[特別是三氧化二砷（As2O3）]成功誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化或凋亡是白血病治療領(lǐng)域靶向治療的成功典范，使高危白血病成為真正意義上可以治愈的一種白血病，然而維甲酸綜合征和維甲酸耐藥是部分誘導(dǎo)治療失敗的根源。近年來(lái)，從傳統(tǒng)中藥中尋找開發(fā)新型抗腫瘤藥物已成為研究熱點(diǎn)。目前針對(duì)抑制早幼粒細(xì)胞耐藥細(xì)胞株NB4-R1增殖、誘導(dǎo)凋亡的特異性靶點(diǎn)的高效低毒的天然新藥，報(bào)道鮮少。葛根總黃酮是從葛根提取出的黃酮類化合物，近年來(lái)通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮可以不同程度誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞株凋亡，已經(jīng)證實(shí)了其抗白血病效應(yīng)與凋亡通路密切相關(guān)[1-3]。本研究以低劑量葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）和/或聯(lián)合As2O3（1μmol/L）體外誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞凋亡，探討低劑量葛根總黃酮聯(lián)合As2O3對(duì)NB4-R1細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材 料

1.1 細(xì)胞系NB4-R1細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院惠贈(zèng)，將NB4-R1細(xì)胞接種于約每瓶10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基[含青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）]中，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)。

1.2 試劑 葛根總黃酮（南京澤朗生物有限公司，純度約為80%，貨號(hào)：FY1238）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，貨號(hào)：D5879）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Sigma公司，貨號(hào)：RNBH5043）；胎牛血清（GIBCO公司，貨號(hào)：10099-141）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（Sigma公司，貨號(hào)：M2128）；Annexin VFITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：KGA512）；As2O3溶液（哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg，10 mL，貨號(hào)：2010-05-04）。葛根總黃酮溶于二甲基亞砜，-20℃保存，使用前用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。As2O3溶液原液稀釋成1 mg/mL貯備液，-20℃下保存?zhèn)溆?，使用前稀釋成所需濃度?/p>

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（BioTek公司，型號(hào)：FLX800）；恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆吞?hào)：HB-T1）；旋渦混合器（北京海天友誠(chéng)科技有限公司，型號(hào)：QL-901）；電子分析天平（賽多利斯有限公司，型號(hào)：BSA224S）；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號(hào)：MCO175M）；超凈工作臺(tái)（Thermo Fisher公司，型號(hào)：51029704）；臺(tái)式超聲細(xì)胞破碎儀（無(wú)錫沃信儀器有限公司，型號(hào)：VOSHIN-250W）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司，型號(hào)：Milli-RO Plus）；超低溫冰箱（日本三洋公司，型號(hào)：MDF-382E）；電泳儀（BIO-RAD公司，型號(hào)：CHEF-DR）；半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD公司，型號(hào)：1703940）；高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf股份有限公司，型號(hào)：5415D）；倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)：DMIL-PH1）。

2 方 法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，100μL/孔，加入葛根總黃酮，按照藥物終濃度分為空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組，90μL/孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入MTT溶液50μL，37℃孵育4 h，離心后去上清，加入100μL DMSO，室溫震蕩搖勻，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A490），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組A490-空白組A490）/（對(duì)照組A490-空白組A490）]×100%。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組的NB4-R1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，1×PBS洗滌后調(diào)整密度為1×106/mL。加入500μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC 5μL混勻后，加入PI 5μL，混勻，室溫、避光反應(yīng)5～15 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 瑞氏染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期空白組、葛根總黃酮10 g/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組的NB4-R1細(xì)胞，1×PBS洗滌后調(diào)整密度為1×106/mL，棄上清，加入適量血漿，混勻后推片，晾干。瑞氏染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并采集圖像。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組處理48 h的細(xì)胞，1×PBS洗滌，調(diào)整密度為1×106/mL，75%的冰乙醇（-20℃預(yù)冷）固定過(guò)夜，染色前用1×PBS洗去固定液，加入PIRnase A染液1 mL，渦旋混勻，室溫孵化30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并分析細(xì)胞周期，sub-G1為細(xì)胞凋亡群。

2.5 Western blottimg法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化 收集空白組、葛根總黃酮10 g/mL組、葛根總黃酮30 g/mL組、葛根總黃酮50 g/mL組處理48 h的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，嚴(yán)格依照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明，完成樣品的制作與準(zhǔn)備，進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)。取40μg待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，行SDS PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗，4℃過(guò)夜，以TBST漂洗后，加入二抗，常溫孵育1 h，再經(jīng)TBST漂洗，最后用顯色劑ECL試劑盒顯色、曝光、Photoshop6.0軟件分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組NB4-R1細(xì)胞增殖抑制率比較 各組NB4-R1細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，與空白組比較，發(fā)現(xiàn)其余各組具有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，并隨著濃度增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸升高，與葛根總黃酮單用組比較，葛根總黃酮+As2O3組NB-R1細(xì)胞活力下降，凋亡更明顯，說(shuō)明葛根總黃酮可呈濃度及時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞的增殖，并與As2O3具有協(xié)同作用。（見圖1）

圖1 各組NB4-R1細(xì)胞增殖抑制率比較（±s，n=3）

3.2 各組NB4-R1細(xì)胞早期凋亡率比較 葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組NB4-R1細(xì)胞處理48 h后細(xì)胞早期凋亡率隨著濃度增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；As2O3組和葛根總黃酮+As2O3組早期凋亡率呈劑量依賴性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（見表1、圖2）

表1 各組NB4-R1細(xì)胞處理48 h后細(xì)胞早期凋亡率比較（±s，n=3）

表1 各組NB4-R1細(xì)胞處理48 h后細(xì)胞早期凋亡率比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組比較，bP＜0.05；與葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組比較，cP＜0.05

組別 NB4-R1細(xì)胞早期凋亡率（%）空白組 1.40±0.20葛根總黃酮10μg/mL組 1.80±0.40葛根總黃酮30μg/mL組 6.70±0.50a葛根總黃酮50μg/mL組 8.30±0.70a As2O3組（1μmol/L） 1.90±0.30葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組 4.40±0.46a葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組 7.50±0.65a b葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組 10.90±1.98a b c

圖2 各組NB4-R1細(xì)胞處理48 h的細(xì)胞早期凋亡率

3.3 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 處理48 h后，在油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)藥物處理的NB4-R1細(xì)胞為圓形或橢圓形，細(xì)胞膜完整，核漿比高，呈圓形或者橢圓形，邊緣多有凹陷或折疊，染色質(zhì)為紫紅色；隨著葛根總黃酮濃度增加，細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡表現(xiàn)，其中葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組和葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組最為顯著，多數(shù)細(xì)胞可觀察到典型的細(xì)胞凋亡改變，可見細(xì)胞形態(tài)大小不一，細(xì)胞膜破裂，染色質(zhì)變粗糙，濃縮，部分核仁消失，核漿比變小，染色質(zhì)固縮、碎裂，并可見凋亡小體形成。（見圖3）

圖3 各組NB4-R1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（瑞氏染色，×1000）

3.4 各組NB4-R1細(xì)胞的細(xì)胞周期比較 葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）作用后NB4-R1細(xì)胞周期發(fā)生變化，與空白組比較，葛根總黃酮30μg/mL組S期細(xì)胞增多，葛根總黃酮50μg/mL組G1期和S期細(xì)胞減少，提示葛根總黃酮能夠影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯于S期；葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）+As2O3聯(lián)合作用后，G1期細(xì)胞比例更少，S期細(xì)胞比例增加更明顯，細(xì)胞凋亡比例更大，葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組出現(xiàn)明顯亞二倍體細(xì)胞，且葛根總黃酮+As2O3聯(lián)用組較單用葛根總黃酮組凋亡峰更明顯。（見圖4）

圖4 各組NB4-R1細(xì)胞的細(xì)胞周期比較

3.5 各組NB4-R1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比 較 葛根總黃酮50μg/mL組NB4-R1細(xì)胞JNK1及JNK2/3蛋白表達(dá)高于空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組（P＜0.05）；葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組NB4-R1細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)均低于空白組（P＜0.05），呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖5、表2）

圖5 各組NB4-R1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 各組NB4-R1凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）

表2 各組NB4-R1凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與葛根總黃酮10μg/mL組比較，bP＜0.05，與葛根總黃酮30μg/mL組比較，cP＜0.05

組別 JNK1/β-actin JNK2/3/β-actin ERK1/2/β-actin空白組 0.22±0.52 0.16±0.06 0.38±0.13葛根總黃酮10μg/mL組 0.23±0.21 0.25±0.04 0.19±0.57a葛根總黃酮30μg/mL組 0.42±0.16 0.34±0.18 0.10±0.47a葛根總黃酮50μg/mL組 0.40±0.05abc 0.41±0.43abc 0.04±0.08abc F 18.099 24.220 59.785 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

4 討 論

急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）是一種特殊類型白血病，具有特征性的t（15、17）染色體和PML/RARa融合基因，出血傾向嚴(yán)重，易并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），故早期死亡率高[4]。全反式維甲酸（ATRA）與化療合理組合可以使得完全緩解率明顯提高，可是維甲酸耐藥成為ATRA治療APL的一大缺憾，部分患者對(duì)ATRA不敏感，還有部分患者發(fā)生高白細(xì)胞癥和維甲酸綜合征，應(yīng)用As2O3治療可使對(duì)維甲酸耐藥或復(fù)發(fā)患者獲得高的完全緩解率，還可以獲得分子生物學(xué)緩解[5-6]。近幾年隨著砷劑、苦參堿、冬凌草甲素抗白血病治療成功的運(yùn)用，尋找對(duì)人體無(wú)毒副作用而對(duì)腫瘤細(xì)胞有高度特異性作用的天然藥物研究成為熱點(diǎn)。

近年來(lái)很多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮可以不同程度誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞株凋亡，已經(jīng)證實(shí)了其抗白血病效應(yīng)與凋亡通路密切相關(guān)，葛根總黃酮處理NB4細(xì)胞后，細(xì)胞中外源性凋亡通路相關(guān)的FasL、Caspases-8蛋白，以及凋亡共同通路Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，能活化該通路上游調(diào)控蛋白JNK、PARP，抑制抗凋亡蛋白激酶p38MAPK。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)低劑量葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）和/或聯(lián)合1μmol/L As2O3能體外誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，觀察到隨著藥物濃度的增加，NB4細(xì)胞JNK表達(dá)逐漸增強(qiáng)。證明兩者有協(xié)同作用，推測(cè)葛根總黃酮可能是通過(guò)激活凋亡上游蛋白JNK，進(jìn)一步激活促凋亡基因表達(dá)，激活凋亡信號(hào)。

本研究選用葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）+1μmol/L As2O3處理NB4-R1細(xì)胞，光鏡、流式細(xì)胞儀均觀察到明顯的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期顯示葛根總黃酮50μg/mL組G1期細(xì)胞比例下降，S期比例增加，尤其是葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組細(xì)胞亞二倍體比例增加，顯示了誘導(dǎo)凋亡作用較強(qiáng)。早期凋亡檢測(cè)也顯示了相近的結(jié)果，即葛根總黃酮聯(lián)合或不聯(lián)合As2O3對(duì)NB4-R1細(xì)胞抑制作用呈濃度依賴性，單藥組早期凋亡率分別為（1.80±0.40）%、（6.70±0.50）%、（8.30±0.70）%；葛根總黃酮+As2O3聯(lián)合組早期凋亡率分別為（4.40±0.46）%、（7.50±0.65）%、（10.90±1.98）%，說(shuō)明了低濃度葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）+1μmol/L As2O3可以在一定程度上誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞的凋亡，并且兩者具有協(xié)同作用。

細(xì)胞凋亡是區(qū)別于細(xì)胞壞死的、主動(dòng)的、受多基因調(diào)控的程序化的死亡。在此過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生一系列生化改變，合成某些蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的出現(xiàn)，使細(xì)胞某些基因開始表達(dá)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步闡明葛根總黃酮誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞凋亡的上游分子機(jī)制，我們選擇了與凋亡緊密相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen actived protein kinase，MAPK）調(diào)控系統(tǒng)中的相關(guān)分子做了更細(xì)致的研究。MAPK系統(tǒng)可以將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)，引起諸如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等生物學(xué)事件，目前已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆和鑒定了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38等3個(gè)家族成員。其與細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[7]。蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮可上調(diào)NB4-R1細(xì)胞中JNK表達(dá)，下調(diào)ERK1/2及p38表達(dá)。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)傳遞途徑之一，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖分化、生存、死亡和轉(zhuǎn)化[8-9]。

JNK信號(hào)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及DNA損傷修復(fù)等多個(gè)細(xì)胞生命過(guò)程，通過(guò)蛋白激酶間的酶促磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)JNK信號(hào)通路在多個(gè)層面上精密調(diào)控細(xì)胞間的聯(lián)系和凋亡[10-11]。研究表明JNK可通過(guò)磷酸化c-Jun和活化轉(zhuǎn)錄因子2，激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]，研究發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，NB4-R1細(xì)胞JNK表達(dá)逐漸增強(qiáng)。故推測(cè)葛根總黃酮可能是首先通過(guò)激活凋亡上游蛋白JNK，進(jìn)一步激活促凋亡基因表達(dá)，激活凋亡信號(hào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

ERK1/2為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，又稱p44/42絲裂原活化蛋白激酶，為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子[12]，在惡性腫瘤細(xì)胞中，由于各種機(jī)制導(dǎo)致ERK過(guò)度活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲，影響細(xì)胞分化[13]。ERK能夠調(diào)控細(xì)胞增殖：細(xì)胞周期素D1是細(xì)胞周期G1/S調(diào)控點(diǎn)關(guān)鍵分子，其轉(zhuǎn)錄依賴于ERK的持續(xù)激活和核內(nèi)滯留[14]。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中ERK表達(dá)的下調(diào)可能引起NB4-R1細(xì)胞周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，使NB4-R1細(xì)胞不能通過(guò)限制點(diǎn)，停滯于細(xì)胞周期進(jìn)程，停止惡性增殖。

研究發(fā)現(xiàn)ERK的表達(dá)隨著藥物濃度增加，表達(dá)逐漸減弱，說(shuō)明ERK并不是c-Jun的激酶，也不是死亡介導(dǎo)的蛋白，反而作為一個(gè)存活相關(guān)因子存在。有研究探討了番荔枝內(nèi)酯化合物squamocin誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)藥物作用后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，磷酸化P44/42MAPK的蛋白量明顯減少[15]。研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。ERK1/2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制非常復(fù)雜，一方面可誘導(dǎo)編碼凋亡抑制蛋白基因的表達(dá)，誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)，還可以通過(guò)降低促凋亡蛋白Bad磷酸化，以及促進(jìn)Bad、Bim降解，發(fā)揮抗凋亡作用。活化的ERK可在不同的微環(huán)境中發(fā)揮不同的作用，這可能是與其他通路共同作用、相互影響的結(jié)果[16-17]。

細(xì)胞的凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，具有多樣性，細(xì)胞生存的微環(huán)境與細(xì)胞通路作用密切相關(guān)，即使同一信號(hào)通路對(duì)不同物種的細(xì)胞微環(huán)境及敏感度亦非完全相同，不同應(yīng)激、不同細(xì)胞存在不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且和其他通路可能相互串聯(lián)，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中葛根總黃酮能夠同時(shí)調(diào)控凋亡相關(guān)通路MAPKs家族中的多個(gè)成員，推測(cè)葛根總黃酮誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞凋亡可能存在多個(gè)靶點(diǎn)，可能激活細(xì)胞凋亡途徑中多個(gè)分子，或者此過(guò)程存在JNK、ERK兩個(gè)通路之間的交叉串聯(lián)，研究這一過(guò)程中相關(guān)分子信號(hào)的變化對(duì)細(xì)胞的惡化及藥物作用靶點(diǎn)具有重要意義，但機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究。