中藥復(fù)方合劑抗甲型H1N1流感病毒活性的實(shí)驗(yàn)研究

楊 敬，徐 勇，林傳友

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430030）

1918—1919年西班牙爆發(fā)了人類歷史上最為嚴(yán)重的流感疫癥，造成約5億人感染，5千多萬人死亡，直到1933年，英國科學(xué)家Smith Andenwes才第一次從人身上分離出了該病毒，并命名為H1N1。時至今日，一百多年過去了，人類與病毒的搏斗從未停止，隨著醫(yī)學(xué)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類對流感病毒有了更深的認(rèn)知。甲型H1N1流感病毒屬正黏液病毒科，由于其RNA片段由8條獨(dú)立的RNA單鏈組成，所以表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)酰胺酶（NA）極易發(fā)生變異，導(dǎo)致新的病毒株和亞型不斷形成，造成流感大流行乃至爆發(fā)[1-2]。西藥因其成分的單一性、不良反應(yīng)和長期使用的耐藥性，限制了其臨床使用范圍，預(yù)防性接種疫苗效果也不夠理想[3]，而中藥來源豐富，作用范圍廣，毒副作用小，表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。

中藥復(fù)方合劑由板藍(lán)根、黃芩、柴胡、知母、甘草、黃芪、金銀花、魚腥草等十二味中藥組成，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，較之單方具有多組分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因而具有更廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)通過雞胚法觀察了中藥復(fù)方合劑3種給藥方式對甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）的抑制作用和對雞胚的保護(hù)作用，以期為臨床用藥和中藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物9日齡SPF級健康雞胚193枚，質(zhì)量（52±2）g，武漢中博生物股份有限公司提供，動物許可證號：SYXK（鄂）2016-0086，實(shí)驗(yàn)符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會的要求。

1.2 藥物與試劑 中藥復(fù)方合劑：由板藍(lán)根、黃芩、柴胡、知母、甘草、黃芪、金銀花、魚腥草等十二味中藥組成，按傳統(tǒng)方法蒸餾水浸泡、煎煮、合并、濃縮至100 mL，每毫升相當(dāng)于1 g生藥（1 g/mL），由佛山康力泰有限公司提供，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?；利巴韋林注射液（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20003176）；枸櫞酸鈉（上海試劑一廠，批號：2004-07-17）；生理鹽水（武漢福星生物藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H42022223）；1%雞紅細(xì)胞懸液：采集健康公雞血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，生理鹽水洗滌3遍后配制。

1.3 病毒株 甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所提供，在雞胚中傳代恢復(fù)活力。將保存的病毒液10-3～10-5倍稀釋后，接種于9日齡雞胚數(shù)枚，每胚0.2 mL，封孔后置35℃，每12 h照蛋觀察一次，棄去24 h內(nèi)死亡胚，24～96 h未死雞胚放4℃過夜，收集尿囊液，測血凝滴度，選1∶640以上的病毒液，備用。

1.4 主要儀器SW-TFG-18型超凈工作臺（江蘇凈化設(shè)備廠）；PYX-DHS-40X50-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；TDZ5-WS型低速臺式離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

2 方 法

2.1 中藥復(fù)方合劑對雞胚毒性的測定 中藥復(fù)方合劑用無菌生理鹽水連續(xù)對倍稀釋成7個稀釋度，分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，備用。常規(guī)選擇生長良好的9日齡SPF雞胚，檢卵燈下觀察并標(biāo)記氣室與胚胎的位置，2.5%碘酒及75%酒精消毒，用無菌錐子在氣室旁無大血管處錐一個直徑2 mm小孔，再次消毒，1 mL注射器吸取待接種的藥物0.2 mL，注入尿囊腔，每個稀釋度作5枚雞胚，同步設(shè)生理鹽水對照，消毒后石蠟封口，置35℃孵化箱孵育96 h，連續(xù)觀察雞胚生長發(fā)育情況，棄去24 h內(nèi)死胚，以雞胚可存活96 h的最大濃度作為藥物的最大無毒限量。

2.2 雞胚半數(shù)感染量EID50的測定 用無菌生理鹽水10倍稀釋A/PR/8/34（H1N1）病毒株，依次10-1～10-7各稀釋度病毒，每稀釋度接種5枚，0.2 mL/枚，石蠟封口，置35℃恒溫箱孵育，逐日照蛋觀察至96 h，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，死亡雞胚放4℃冷卻或過夜，收獲的尿囊液作血球凝集試驗(yàn)，出現(xiàn)血凝者判陽性，依據(jù)Reed-Muench法進(jìn)行計算[4]。

EID50=高于50%的稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)

2.3 中藥復(fù)方合劑對甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制作用

2.3.1 中藥復(fù)方合劑對雞胚的保護(hù)作用SPF級健康雞胚隨機(jī)分為正常對照組、病毒對照組、利巴韋林組和中藥復(fù)方合劑低、中、高劑量組，每組6枚。在藥物對雞胚安全濃度范圍內(nèi)，采取3種給藥方式，（1）同時給藥（中藥和病毒液胚外混合后接種）：先將中藥復(fù)方合劑0.1 mL與100EID50H1N1病毒液0.1 mL充分混合后，置35℃恒溫箱孵育2 h，再接種于9日齡雞胚尿囊腔。（2）預(yù)防給藥（先接種中藥后接種病毒）：先將中藥復(fù)方合劑0.1 mL接種于9日齡雞胚尿囊腔，置35℃恒溫箱孵育2 h，再接種0.1 mL 100EID50的H1N1病毒液。（3）治療給藥（先接種病毒后接種中藥）：先將0.1 mL 100EID50的H1N1病毒液接種于9日齡雞胚尿囊腔，置35℃恒溫箱孵育2 h，再接種0.1 mL中藥復(fù)方合劑。每組接種完后，置35℃恒溫箱繼續(xù)孵育至96 h，記錄雞胚的存活率和測定尿囊液血凝效價，計算血凝滴度[5]。

2.3.2 尿囊液血凝效價的測定 收集96 h后的各組雞胚尿囊液，生理鹽水稀釋至1∶20～1∶64，于96孔V型板上，取稀釋好的尿囊液50μL/孔，再加入1%雞紅細(xì)胞50μL/孔，漩渦器上震蕩1 min，使雞紅細(xì)胞與病毒充分混合，置37℃30 min，待對照孔紅細(xì)胞沉淀，即可觀察結(jié)果，以“+”為終點(diǎn)，即能夠使50%紅細(xì)胞凝集的血凝素的最高稀釋度作為該血凝素效價。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法Reed-Muench法計算藥物對雞胚半數(shù)感染量（EID50），數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 中藥復(fù)方合劑對雞胚最大安全濃度 中藥復(fù)方合劑原液96 h接種后存活率為60%，1∶2倍比稀釋濃度96 h接種后無死亡雞胚，且數(shù)日后有健康雛雞孵出，說明500 mg/mL的濃度對雞胚無毒性，可作為最大安全濃度。（見表1）

表1 中藥復(fù)方合劑對雞胚的毒性作用

3.2 雞胚EID50值Reed-Muench法計算得雞胚EID50為10-3.83，故實(shí)驗(yàn)采用100EID50病毒攻擊量。（見表2）

表2 甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）EID50的測定

3.3中藥復(fù)方合劑對甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制作用 與正常對照組比較，病毒對照組雞胚均出現(xiàn)全身充血、出血，雞胚死亡率100%；在安全濃度范圍內(nèi)，中藥復(fù)方合劑高、中、低劑量組對雞胚均有保護(hù)作用，其中3種給藥方式的中藥復(fù)方合劑高劑量組雞胚存活率為100%，與病毒對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；同時給藥和預(yù)防給藥方式的中藥復(fù)方合劑中劑量組雞胚存活率為100%，高于治療給藥方式的中藥復(fù)方合劑中劑量組（83%），中藥復(fù)方合劑低劑量組對雞胚也有一定程度的保護(hù)作用，同時給藥、預(yù)防給藥和治療給藥雞胚存活率分別為83%、67%、67%，說明不同的給藥方式對雞胚的保護(hù)程度不同，同時給藥效果最好。在血凝滴度試驗(yàn)中，如果藥物組血凝滴度低于病毒對照組的1/4，說明藥物對病毒增殖有抑制作用[6]，結(jié)果顯示，同時給藥方式的中藥復(fù)方合劑高、中劑量組，以及預(yù)防給藥和治療給藥方式的中藥復(fù)方合劑高劑量組血凝滴度均低于病毒對照組的1/4（P<0.01），具有明顯抑制流感病毒的作用，而且同時給藥強(qiáng)于預(yù)防給藥和治療給藥，預(yù)防給藥略強(qiáng)于治療給藥。（見表3~5）

表3 同時給藥方式對雞胚的保護(hù)作用

表4 預(yù)防給藥方式對雞胚的保護(hù)作用

表5 治療給藥方式對雞胚的保護(hù)作用

4 討 論

傳染性疾病在中醫(yī)學(xué)上屬“時疫”“溫病”的范疇[7]，在臨床實(shí)踐中，主要采取清熱、解毒的治療原則[8-9]。中藥復(fù)方合劑為傳統(tǒng)中藥材，以解表藥、清熱藥和補(bǔ)益藥為主藥，通過直接殺滅病毒、抑制病毒唾液酶活性、阻斷病毒吸附等途徑發(fā)揮抗病毒作用[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，板藍(lán)根、黃芩、柴胡、甘草、金銀花、魚腥草等具有明顯的抗流感病毒作用[11]，從這些中藥中提取分離得到抗流感病毒的活性成分包含黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、生物堿等不同類別。板藍(lán)根具有清熱解毒、涼血利咽之功效，成分中的生物堿、苯丙素、有機(jī)酸等能通過抑制病毒增殖，預(yù)防和阻斷病毒附著而發(fā)揮其抗流感活性，由醇提部位制取的總有機(jī)酸部位抗A/PR/8/34（H1N1）藥效最強(qiáng)[12]；黃芩中富含四十多種黃酮類物質(zhì)，主要有效成分黃芩苷、黃芩素均有抗H1N1活性，機(jī)制包括直接抗病毒作用和調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)兩方面[13]；柴胡中多種柴胡皂苷對于Na+，K+-ATP酶有很強(qiáng)的抑制作用，能引起能量和水鹽代謝的變化，從而起到抗病毒作用[14]。此外，柴胡多糖有促進(jìn)免疫的作用，可增加Kupffer細(xì)胞的吞噬功能和NK細(xì)胞的功能；甘草粗提物、甘草甜素均具有抗流感病毒作用，甘草多糖能增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫作用[15]；黃芪具有補(bǔ)氣升陽、調(diào)節(jié)免疫功能的作用，化學(xué)成分包括皂苷類、多糖、黃酮類等[10]；金銀花作為清熱解毒的代表藥，含以上多種成分，其水煎液能明顯降低甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小鼠的肺指數(shù)，使小鼠肺部病變程度明顯減輕[16]。金銀花有抗炎、解熱、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。因此，中藥復(fù)方合劑對H1N1的抑制作用并不是單純的抗病毒，而是多方面、多角度、多途徑發(fā)揮作用，體現(xiàn)出中醫(yī)療法的整體特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用雞胚法3種給藥方式觀察中藥復(fù)方合劑的抗病毒效果，方式一（同時給藥）是驗(yàn)證藥物對病毒的直接滅活作用；方式二（預(yù)防給藥）是驗(yàn)證藥物對病毒入侵的阻斷作用；方式三（治療給藥）是驗(yàn)證藥物對病毒增殖的抑制作用；結(jié)果表明，中藥復(fù)方合劑3種給藥方式對雞胚均有一定的保護(hù)作用，但是程度有所不同，250 mg/mL時雞胚存活率為100%，與病毒對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；流感病毒抑制結(jié)果顯示，同時給藥、預(yù)防給藥和治療給藥方式的藥物濃度在62.5、125.0、250.0 mg/mL時表現(xiàn)有抗病毒活性，對甲型H1N1流感病毒均有抑制作用，并在安全濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，且同時給藥方式抗病毒作用強(qiáng)于其他兩組。由此可見，中藥復(fù)方合劑對H1N1流感病毒的防治雖以非特異性為主，但因通過機(jī)體免疫保護(hù)宿主，強(qiáng)調(diào)辨證，因而具有廣泛的適應(yīng)性，為臨床抗病毒用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。