抗壞血酸處理對(duì)鮮榨蓮藕汁酶促褐變和品質(zhì)特征的影響

李彩云，李 潔，2，3*，嚴(yán)守雷，2，3，王清章，2

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 武漢 430070 2 湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心 武漢 430070 3 教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶常規(guī)水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心 武漢 430070）

果蔬汁在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中因褐變反應(yīng)而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量下降，感官發(fā)生變化，使消費(fèi)者對(duì)食品的接受度降低[1-2]。果汁的褐變分為酶促褐變和非酶褐變，酶促褐變主要發(fā)生在榨汁加工過(guò)程中，非酶褐變主要發(fā)生在貯藏期間[3-4]。酶促褐變?cè)诠庸ぶ杏葹閲?yán)重，果蔬組織被徹底破壞后，加速了多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和酚類化合物的自由接觸。在氧氣充足的情況下，酚類化合物在PPO 的催化下氧化成醌，再進(jìn)一步發(fā)生氧化聚合等非酶促反應(yīng)，最終導(dǎo)致褐色色素的形成[5]?？箟难幔ˋscorbic acid，AA）是一種很強(qiáng)的抗氧化劑和抗褐變劑，因具有良好的還原性，能夠降低體系的pH 值，對(duì)金屬無(wú)腐蝕作用，且具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)，而在果蔬加工中廣泛應(yīng)用[6-8]?？箟难嵩诿复俸肿冎械淖饔檬且种芇PO 的活性，降低氧氣含量，褐變中間產(chǎn)物醌在進(jìn)一步反應(yīng)形成褐色色素前被還原為原始酚類化合物，對(duì)抑制果蔬酶促褐變有很好的效果[9]。

近年來(lái)，湖北省蓮藕產(chǎn)量迅速增加，開發(fā)蓮藕深加工產(chǎn)品，提升蓮藕產(chǎn)品價(jià)值是科研工作者要面對(duì)的問(wèn)題[10-11]。目前市場(chǎng)上有保鮮藕片、藕粉、藕汁等蓮藕產(chǎn)品，其中蓮藕汁飲料四季皆宜，有生津清熱、養(yǎng)胃滋陰、健脾益氣等功效，受到廣大消費(fèi)者喜愛[12]。然而，蓮藕中含有豐富的酚類物質(zhì)，在榨汁加工過(guò)程中極易發(fā)生酶促褐變，從而影響產(chǎn)品的感官和品質(zhì)。本研究比較不同濃度的AA 對(duì)鮮榨蓮藕汁的護(hù)色效果，探究AA 對(duì)蓮藕汁酶促褐變的影響，同時(shí)考察添加AA 對(duì)蓮藕汁品質(zhì)特征的影響，分析蓮藕汁酶促褐變與品質(zhì)間的關(guān)系，為AA 對(duì)蓮藕汁的護(hù)色和品質(zhì)控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用蓮藕品種為鄂蓮五號(hào)，購(gòu)買于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)?？箟难帷⑧彵蕉印⒂鷦?chuàng)木酚、沒食子酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、2，6-二氯酚靛酚等（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-754N 紫外-可見分光光度計(jì)，上海奧普勒儀器有限公司；UltraScan PRO 全自動(dòng)色差儀，美國(guó)Hunter Lab 公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher 公司；PAL-1 型手持式糖度計(jì)，ATAGO （愛拓）中國(guó)分公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮藕汁的制備 取冷藏于冰箱中的白色蓮藕，無(wú)腐爛變質(zhì)，洗去泥土，去節(jié)、削皮，消毒，切塊。配制不同濃度（2，4，6，8 mmol/L）的AA，蓮藕和AA 溶液按體積比1∶1 混合，在打漿機(jī)中打漿約5 min，得蓮藕粗液，用800 目篩過(guò)濾，放入干凈玻璃瓶中4 ℃儲(chǔ)藏12 h，以蒸餾水代替AA 溶液為對(duì)照組。

1.3.2 酶促褐變指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 蓮藕汁褐變度的測(cè)定 取蓮藕汁5 mL，按體積比1∶1 加入95%的乙醇溶液，混合振蕩10 min 后在8 000 r/min 條件下離心10 min，去除樣品中的粗纖維和顆粒。取10 mL 上層清液，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)420 nm 處的吸光度，以A420nm表示蓮藕汁的褐變指數(shù)，以V蒸餾水∶V95%乙醇=1∶1 的混合液做空白對(duì)照[13]。

1.3.2.2 蓮藕汁總酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定藕汁中總酚含量[14]。試驗(yàn)算得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0014x+0.0181，R2=0.9953。量取蓮藕汁5 mL，加入10 mL 40%乙醇均質(zhì)，用5 mL 40%乙醇轉(zhuǎn)移到100 mL 三角瓶中，保鮮膜封口超聲5 min，50 mL 離心管在5 000 r/min 條件下離心15 min，收集上清液，殘?jiān)? mL 40%乙醇轉(zhuǎn)移，5 000 r/min 條件下離心15 min，合并上清液。取0.5 mL 上清液，加入福林酚試劑3 mL，再加10%Na2CO3，定容至10 mL，以蒸餾水作參比，在波長(zhǎng)765 nm 下測(cè)吸光值，每組平行3 次。

1.3.2.3 可溶性醌含量的測(cè)定 取1.3.2.2 節(jié)離心后的上清液于波長(zhǎng)437 nm 測(cè)其吸光度[15]。

1.3.2.4 蓮藕汁多酚氧化酶活性的測(cè)定 取藕汁10 mL，加入0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液【內(nèi)含3%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）】30 mL，用高速組織搗碎機(jī)勻漿12 s，然后10 000 r/min 離心10 min，取上清液作為蓮藕汁PPO 粗酶液。上述操作在4 ℃下進(jìn)行[16]。

開展全域土地綜合整治工作是放大土地資源優(yōu)勢(shì)，推動(dòng)高質(zhì)量發(fā)展的難得機(jī)遇。金華市作為低丘緩坡資源大市，發(fā)展空間拓展?jié)摿薮?。六大工具是該市?jiān)持以問(wèn)題為導(dǎo)向，因地制宜總結(jié)提煉大調(diào)研活動(dòng)成果的具體體現(xiàn)。下一步，金華市將全域聯(lián)動(dòng)抓推進(jìn)，為實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略、助推高質(zhì)量發(fā)展作出應(yīng)有貢獻(xiàn)。

向0.1 mL 酶液中加入1.9 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.0），25 ℃保溫5 min，加入1.0 mL 鄰苯二酚（20 mmol/L PBS 配制）啟動(dòng)反應(yīng)。在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光值，每10 s 記錄1 次，共2 min。每毫升酶液每分鐘引起吸光值變化0.001 為1 個(gè)酶活單位[17]。

1.3.2.5 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定 過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD） 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[18]。總反應(yīng)體積為400 μL，反應(yīng)體系為30 μL 粗酶液，290 μL 0.3%愈創(chuàng)木酚 （用50 mmol/L PBS 配制，pH 7.0）和80 μL 0.3% H2O2（用50 mmol/L PBS配制，pH.0），加入H2O2后開始準(zhǔn)確記時(shí)，連續(xù)測(cè)定A470nm的變化值，每毫升酶液每分鐘引起吸光值變化0.01 為1 個(gè)酶活單位。

1.3.3 蓮藕汁品質(zhì)特征的測(cè)定

1.3.3.1 白度、可溶性固形物、黏度和酸堿度的測(cè)定 利用色差儀反射原理，測(cè)定蓮藕汁白度（L值）變化[19]?？扇苄怨绦挝?、黏度和酸堿度分別采用數(shù)字阿貝折光儀、黏度計(jì)和pH 計(jì)測(cè)定[20]。

1.3.3.2 蓮藕汁中總蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法進(jìn)行測(cè)定[21]。試驗(yàn)得到牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.2629x+0.0699，R2=0.999。蓮藕汁在6 000 r/min 條件下離心10 min，取離心后的蓮藕汁0.5 mL，加入0.5 mL 蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍(lán)，充分混勻，在室溫下反應(yīng)10 min，以空白調(diào)零，在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)吸光值，根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中總蛋白含量。

1.3.3.3 蓮藕汁中VC 含量的測(cè)定 采用2，6-二氯靛酚滴定法進(jìn)行測(cè)定[22]。取離心后的蓮藕汁5 mL，置于錐形瓶中，加入1%草酸溶液10 mL，3%H2O2溶液2 滴，搖勻，立即用2，6-二氯靛酚溶液滴定至由溶液變?yōu)槊倒寮t色，15 s 內(nèi)不褪色即為終點(diǎn)。蓮藕汁中VC 含量按下式計(jì)算：

式中，T——2，6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL；V——2，6-二氯靛酚用量，mL；W——蓮藕汁樣品用量，mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25 進(jìn)行顯著性分析，Origin 2018 和Excel 2010 等圖表制作軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度抗壞血酸處理對(duì)蓮藕汁酶促褐變的影響

圖1 不同濃度的抗壞血酸處理對(duì)蓮藕汁褐變度、總酚及可溶性醌類含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of AA treatment on the browning degree，total phenol and soluble quinone content of lotus rhizome juice

2.1.2 不同濃度抗壞血酸處理對(duì)蓮藕汁PPO、POD 酶活性的影響 在果汁加工過(guò)程中，PPO 和POD 是褐變反應(yīng)中的主要酶類[26]。AA 處理的蓮藕汁中PPO 和POD 活性見圖2a 和2b，隨著AA 濃度的增加，兩種酶的活性逐漸降低。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨AA 濃度增大，PPO 酶活較勻速下降，而POD 酶活在AA 濃度低于2 mmol/L 時(shí)幾乎無(wú)變化，在AA 濃度繼續(xù)增大時(shí)降幅顯著加快。當(dāng)AA濃度達(dá)到8 mmol/L 時(shí)，對(duì)PPO 和POD 的抑制率分別為77.78%和88.24%。研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸對(duì)薄荷PPO[27]、洋薊PPO[28]和萵苣PPO[29]也有明顯的抑制作用。隨后的研究證實(shí)了抗壞血酸對(duì)PPO 活性具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[30-31]，這表明多酚的再生并不是抗壞血酸作為抗褐變劑的唯一機(jī)制。當(dāng)然，pH值在酶促反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。蓮藕PPO 和POD酶活的最適pH 值都為6.0[32]，隨著抗壞血酸添加量增加，體系pH 值不斷降低，這對(duì)PPO 和POD活性也有一定影響。

圖2 不同濃度的抗壞血酸處理對(duì)蓮藕汁PPO 和POD 酶活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ascorbic acid treatment on the activity of PPO and POD enzymes in lotus rhizome juice

如表1所示，AA 濃度與總酚含量呈顯著正相關(guān)，與可溶性醌含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與PPO 和POD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明AA 的添加影響了酶促褐變的主要指標(biāo)，AA 濃度增加與各褐變指標(biāo)間存在良好的相關(guān)性。AA 處理后的蓮藕汁總酚含量與可溶性醌含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.980），可能是因?yàn)榭偡优c可溶性醌是相互轉(zhuǎn)化的，總酚含量提高，醌含量就會(huì)降低；AA 處理后的蓮藕汁總酚含量與PPO 酶活呈極顯著負(fù)相關(guān) （r=-0.992），PPO 酶活越高，總酚含量越低。PPO 酶活與可溶性醌含量、POD 酶呈顯著正相關(guān)（r=0.987，r=0.961），說(shuō)明PPO 與POD 在酶促褐變反應(yīng)中起協(xié)同作用，可能是因?yàn)镻PO 酶活越高，生成的可溶性醌含量越多。

表1 AA 處理蓮藕汁酶促褐變指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of enzymatic browning of lotus rhizome juice treated with AA

2.2 不同濃度抗壞血酸處理對(duì)蓮藕汁品質(zhì)指標(biāo)的影響

AA 處理對(duì)蓮藕汁品質(zhì)的影響如表2所示。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，處理組白度顯著增加（P＜0.05）。隨AA 濃度的增加，蓮藕汁白度呈上升趨勢(shì)，當(dāng)AA 添加濃度為8 mmol/L 時(shí)，與對(duì)照組相比，白度增加了6.30%。添加AA 不會(huì)引起藕汁可溶性固形物含量發(fā)生顯著變化 （P＞0.05），始終維持在6%左右，說(shuō)明AA 的添加基本不影響藕汁中可溶性糖的含量。隨著AA 濃度升高，蓮藕汁黏度上升，pH 值下降。

AA 處理后蓮藕汁中蛋白質(zhì)含量有較大幅度的下降，可能有2 種原因：一方面可能是因?yàn)锳A屬于酸性化合物，隨著濃度升高，酸性越強(qiáng)，越接近蓮藕汁中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子相互間的作用力減弱，極易發(fā)生碰撞、凝聚而生成沉淀，因此含量下降，另一方面可能隨著總酚含量的升高，酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)有更大機(jī)會(huì)發(fā)生相互作用而沉淀下來(lái)。蛋白質(zhì)含量降低有利于減小后期藕汁貯藏過(guò)程中美拉德反應(yīng)發(fā)生的可能性。

VC 是維持機(jī)體正常生理功能不可缺少的一類有機(jī)物[33]，是果蔬及其加工制品重要的品質(zhì)特征。蓮藕汁在加工過(guò)程中，不可避免會(huì)發(fā)生VC 氧化降解[34]，在加工過(guò)程中加入VC，不僅可以增加其含量，還可以抑制褐變。從表2可以看出，隨著AA 添加量的增加，蓮藕汁中VC 含量也在不斷上升。當(dāng)AA 添加量為8 mmol/L 時(shí)，蓮藕汁的VC 含量達(dá)到0.439 mg/mL，比對(duì)照組提高了128.65%。

表2 蓮藕汁品質(zhì)指標(biāo)Table 2 Quality indexes of lotus rhizome juice

不同濃度AA 處理的蓮藕汁品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性如表3所示。由表可知，各指標(biāo)之間存在良好的相關(guān)關(guān)系。AA 的濃度與藕汁白度呈極顯著正相關(guān)（r=0.992），與pH 值呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.995），與總蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.961），說(shuō)明AA 濃度與藕汁白度、pH 值、蛋白質(zhì)含量之間密切相關(guān)。AA 處理后的蓮藕汁白度與可溶性固形物含量呈顯著正相關(guān)（r=0.975），與pH 值、總蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān) （r=-0.975，r=-0.979）；可溶性固形物含量與總蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.976）；pH 值與VC 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.952）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，添加AA 改善了藕汁的理化性質(zhì)及特征營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，其中AA 濃度和白度、pH 值的相關(guān)性最強(qiáng)，在研究范圍內(nèi)AA的添加顯著改變了藕汁酸度，提高了藕汁白度（P＜0.01）。

表3 不同AA 處理蓮藕汁品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of quality indexes of lotus rhizome juice treated by AA

為了探究添加AA 引起的品質(zhì)特征改變是否與褐變指標(biāo)的改變有關(guān)，本研究進(jìn)一步探討了褐變指標(biāo)和品質(zhì)指標(biāo)間的相互關(guān)系，結(jié)果如表4所示。AA 處理的蓮藕汁褐變度與黏度呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.999），說(shuō)明褐變度和黏度之間有密切關(guān)系，具體原因需要進(jìn)一步探究。白度與總酚含量呈顯著正相關(guān)，與可溶性醌含量、PPO 酶活、POD 酶活呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明酶促褐變與藕汁的顏色密切相關(guān)?？扇苄怨绦挝锱c總酚含量呈顯著正相關(guān)，與PPO 酶活呈顯著負(fù)相關(guān)；pH 值與總酚含量呈顯著正相關(guān)，與可溶性醌含量、PPO 酶活呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明pH 值在酶促褐變過(guò)程中起重要作用，pH 值降低會(huì)抑制酶促褐變的發(fā)生?？偟鞍缀颗c可溶性醌含量、PPO 酶活、POD 酶活呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量與可溶性醌含量、PPO 酶活和POD 酶活有密切聯(lián)系，可能的原因是總蛋白含量對(duì)酶活有重要影響，并且蛋白質(zhì)與醌也可能會(huì)發(fā)生一定程度的相互作用[35]。褐變度和白度的相關(guān)性為-0.799，說(shuō)明白度除了受酶促褐變的影響，還受其它因素影響，例如：溫度、pH 值和氧氣等。這些結(jié)果表明AA 處理后的藕汁的品質(zhì)特征與酶促褐變指標(biāo)之間密切相關(guān)，酶促褐變中的3 個(gè)指標(biāo)（總酚含量、可溶性醌含量、PPO 酶活）都與白度、pH 值有顯著相關(guān)性，說(shuō)明AA 的加入改變了pH值，進(jìn)而影響了酶促褐變的發(fā)生，改善了產(chǎn)品的理化指標(biāo)和特征營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

表4 AA 處理的蓮藕汁品質(zhì)和酶促褐變指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of quality and enzymatic browning index of lotus rhizome juice treated with AA

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了不同濃度AA 處理的蓮藕汁酶促褐變與品質(zhì)特征的變化，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)性分析。在蓮藕汁酶促褐變方面，隨著AA 濃度升高，蓮藕汁總酚含量上升，褐變度、可溶性醌含量、PPO 酶活、POD 酶活下降。酶促褐變指標(biāo)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)AA 在蓮藕汁酶促褐變中的作用主要分為2 個(gè)方面：一方面保護(hù)酚類不被氧化，還原褐變中間產(chǎn)物醌，提高總酚含量；另一方面，AA 抑制了PPO 和POD 酶活性。在蓮藕汁品質(zhì)特征分析方面，與對(duì)照組相比，隨著AA 濃度升高，蓮藕汁白度、黏度、VC 含量呈上升趨勢(shì)，pH 值和蛋白質(zhì)含量下降，可溶性固形物含量基本維持穩(wěn)定。品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)AA 處理改善了藕汁的理化性質(zhì)及特征營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。酶促褐變指標(biāo)與品質(zhì)特征參數(shù)之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)pH 值和白度等蓮藕汁品質(zhì)指標(biāo)的變化與其總酚含量、可溶性醌含量、PPO 酶活等酶促褐變參數(shù)的變化密切相關(guān)，說(shuō)明AA 的加入使蓮藕汁整體酸度下降，進(jìn)而抑制了酶促褐變的發(fā)生，從而提高了蓮藕汁的品質(zhì)特征。綜合來(lái)看，AA 處理的蓮藕汁在抑制酶促褐變及維持品質(zhì)特征方面優(yōu)于對(duì)照組，在研究范圍內(nèi)AA 濃度越高，效果越好，而且酶促褐變和品質(zhì)之間密切相關(guān)。