Bar基因雙元載體的快速構(gòu)建及其在蛹蟲草中的功能驗證

婁海偉，林俊芳，趙仁勇，葉志偉，田雙起，王新偉，郭麗瓊*，趙 玉*

（1 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450001 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣州 510642）

蛹蟲草 （Cordyceps militaris） 又名北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式種，已實現(xiàn)人工規(guī)?；耘?。蛹蟲草作為一種新食品原料，其菌絲體和子實體富含多種生物活性成分，如蟲草素[1]、免疫調(diào)節(jié)蛋白[2]、蟲草多糖[3]、新型黃色素[4-5]、噴司他丁[6]等，具有抗癌[7]、免疫調(diào)節(jié)[2-3]、抗炎[8]、抗氧化[9]等功效?；诖?，蛹蟲草的市場需求量逐年增多，在東南亞國家被廣泛食用，目前在西方國家亦得到廣泛推廣。

雖然蛹蟲草含有多種生物活性成分，但是其含量較低，不能滿足市場需求。提高蛹蟲草生物活性成分的含量是亟待解決的關(guān)鍵問題。采用基因工程方法（如異源表達(dá)、關(guān)鍵基因超表達(dá)等）可從根本上解決這一問題，然而需要鑒定（活性物質(zhì)生物合成途徑中）關(guān)鍵基因的功能。鑒定基因功能的方法有基因敲除[10]、基因超表達(dá)[11]、RNA 干擾[12]等技術(shù)，然而，使用上述技術(shù)需要選擇標(biāo)記基因來篩選目標(biāo)轉(zhuǎn)化子，目前在蛹蟲草基因功能鑒定中被廣泛使用的篩選標(biāo)記基因為膦絲菌素（Phosphinothricin）乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（即Bar基因）[13-14]。

構(gòu)建載體較常用的方法為T4 DNA 連接酶法[15]，通過對載體、插入片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后在T4 DNA 連接酶的作用下實現(xiàn)載體和插入片段的連接；而同源重組法構(gòu)建載體是一種較新的方法[16]，通過限制性內(nèi)切酶酶切或者PCR方法制備線性載體，然后在重組酶的作用下實現(xiàn)線性載體和插入片段的重組。上述兩種構(gòu)建載體的方法，哪一種更快速、更高效，目前未見對比上述兩種方法的相關(guān)報道。本研究首先采用雙接頭PCR（Double-joint PCR，DJ-PCR）方法構(gòu)建Bar基因表達(dá)盒；其次，以雙元載體pAg1-H3 作為出發(fā)載體，通過構(gòu)建標(biāo)記基因載體（pAg-Bar），比較兩種載體構(gòu)建方法 （T4 DNA 連接酶法和同源重組法）的效果，旨在獲得一種更快速、高效的載體構(gòu)建方法。最后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobac terium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）來驗證載體pAg-Bar 的有效性及Bar基因在蛹蟲草中的功能。為促進(jìn)蛹蟲草基因功能鑒定，加快蛹蟲草活性物質(zhì)代謝通路研究，以及通過生物技術(shù)方法提高蛹蟲草活性物質(zhì)的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌DH5α，天根生化科技公司；農(nóng)桿菌AGL1，上海唯地生物技術(shù)有限公司；蛹蟲草菌株CM10、質(zhì)粒pCAMBIA3301（含Bar基因），保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然產(chǎn)物實驗室；質(zhì)粒pAg1-H3（含構(gòu)巢曲霉的PtrpC啟動子、TtrpC終止子），中國科學(xué)院微生物研究所劉鋼研究員饋贈；草銨膦（Basta），德國Bayer 公司；瓊脂糖（Agarose G-10），Biowest 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 純化試劑盒、基因組抽提試劑盒，美基生物公司；PrimeSTAR Max DNA 聚合酶，Takara 公司；KOD FX DNA 聚合酶，Toyobo 公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶（Hind III 和EcoR I），Thermo Fisher Scientific 公司；無縫克隆試劑盒，Abm 公司；卡那霉素（Kanamycin），Amresco 公司；頭孢噻肟（Cefotaxime），Solarbio 公司；乙酰丁香酮（Acetosyringone），廣州賽國公司；硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等試劑均為分析純級，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria broth）培養(yǎng)基，參照李曉霞等[17]的方法；PDA（Potato dextrose agar）培養(yǎng)基，參照婁海偉等[5]的方法；液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Induction liquid medium，IM）、固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基 （Induction solid medium，CO-IM），參照Zheng 等[18]的方法。

1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD 超凈工作臺，江蘇安泰有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DMi8L 徠卡顯微鏡，德國徠卡有限公司；凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+、C1000 PCR 儀，Bio-Rad 公司；ND-1000 超微量分光光度計，NanoDrop 公司；FRESCO21 冷凍離心機，Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 草銨膦抑制蛹蟲草生長的濃度梯度試驗轉(zhuǎn)化蛹蟲草較常用的方法為ATMT 法[18]，使用的受體細(xì)胞為分生孢子。本文研究草銨膦對蛹蟲草分生孢子的抑制效果。根據(jù)有關(guān)報道，完全抑制蛹蟲草生長的草銨膦質(zhì)量濃度有150 μg/mL[19]，200 μg/mL[20]和400 μg/mL[21]?；诖耍疚姆謩e采用草銨膦質(zhì)量濃度為0，200，250，300，350，400，450，500，600，700 μg/mL 的PDA 抗性培養(yǎng)基做濃度梯度試驗，以確定能完全抑制蛹蟲草分生孢子生長的草銨膦濃度。蛹蟲草分生孢子的收集方法參照Lou 等[13]的報道，在顯微鏡下觀察是否收集到分生孢子，將該分生孢子涂布在含有不同草銨膦質(zhì)量濃度的PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃避光靜止培養(yǎng)10 d，觀察并記錄草銨膦對蛹蟲草的抑制效果。

1.4.2 質(zhì)粒的抽提 采用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒pCAMBIA3301、pAg1-H3 和pAg-Bar，抽提方法參照試劑盒說明書。采用ddH2O （Double distilled water）洗脫質(zhì)粒。

1.4.3 元件的擴增和Bar基因表達(dá)盒的構(gòu)建 雙元載體pAg1-H3 含有潮霉素抗性基因（hyg）。前期試驗表明潮霉素不能完全抑制蛹蟲草CM10 的生長，因此本文采用Bar基因替換載體pAg1-H3中的hyg基因。由于hyg基因兩端均無單一的酶切位點，而hyg基因表達(dá)盒的兩端均有合適的單一酶切位點（Hind III 和EcoR I），因此本試驗采用Bar基因表達(dá)盒替換載體pAg1-H3 中hyg基因表達(dá)盒。

以源于構(gòu)巢曲霉的PtrpC啟動子和TtrpC終止子作為Bar基因的啟動子和終止子，采用DJPCR 方法[22]融合啟動子PtrpC、Bar基因和終止子TtrpC，融合產(chǎn)物即Bar基因表達(dá)盒 （PtrpC-Bar-TtrpC），融合流程見圖1和圖2，所使用的引物見表1。

表1 本試驗用引物Table 1 Primers used in this study

以質(zhì)粒pAg1-H3 作為DNA 模板，采用引物F1/R1、F3/R3 分別擴增PtrpC啟動子和TtrpC終止子。以質(zhì)粒pCAMBIA3301 作為DNA 模板，用引物F2/R2 擴增Bar基因。采用DNA 純化試劑盒對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。以純化回收的元件PtrpC、Bar、TtrpC作為DNA 模板（3 種元件的物質(zhì)的量比為1∶1∶1），以F1 和R3 為引物，采用DJ-PCR融合Bar基因表達(dá)盒，最后對融合片段進(jìn)行純化回收。元件擴增和融合采用PrimeSTAR Max DNA聚合酶，PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照其說明書。

1.4.4 線性載體的制備 采用T4 DNA 連接酶法和同源重組法均需對載體進(jìn)行線性化處理，因PCR 方法制備線性載體易出現(xiàn)堿基突變，故采用限制性內(nèi)切酶酶切法制備線性載體。首先用限制性內(nèi)切酶HindIII 和EcoR I 對質(zhì)粒pAg1-H3 進(jìn)行雙酶切，然后采用DNA 純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，即得長度為3 801 bp 的線性載體pAg1-H3（圖1和圖2）。雙酶切體系和反應(yīng)條件參照限制性內(nèi)切酶的說明書，僅把酶切時間調(diào)整為30 min，以保證酶切完全。

圖1 T4 DNA 連接酶法構(gòu)建雙元載體pAg-BarFig.1 Construction of binary vector pAg-Bar by T4 DNA ligase method

圖2 同源重組法構(gòu)建雙元載體pAg-BarFig.2 Construction of binary vector pAg-Bar by homologous recombination method

1.4.5 雙元載體pAg-Bar 的構(gòu)建 T4 DNA 連接酶法構(gòu)建雙元載體pAg-Bar 的方法見圖1。首先對融合的Bar基因表達(dá)盒進(jìn)行雙酶切，用DNA 純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，獲得兩端為Hind III 和EcoR I 黏性末端的Bar基因表達(dá)盒，然后采用T4 DNA 連接酶將帶有黏性末端的Bar基因表達(dá)盒與線性載體pAg1-H3 進(jìn)行連接，連接體系和反應(yīng)條件參照T4 DNA 連接酶說明書。該說明書提供的連接時間為10 min，而預(yù)試驗結(jié)果表明，該條件下未獲得轉(zhuǎn)化子。將連接時間延至2 h 時才出現(xiàn)目標(biāo)轉(zhuǎn)化子。將本試驗的T4 DNA連接酶反應(yīng)時間延長至2 h。

同源重組法構(gòu)建雙元載體pAg-Bar 見圖2。在1.4.3 節(jié)，構(gòu)建的Bar基因表達(dá)盒兩側(cè)序列分別與線性載體pAg1-H3 的兩側(cè)序列同源，兩端的同源序列長度均為18 bp。采用無縫克隆試劑盒對線性載體pAg1-H3 和插入片段Bar基因表達(dá)盒進(jìn)行重組，重組體系和反應(yīng)條件參照無縫克隆試劑盒說明書。

上述兩種方法所得連接體系和重組體系分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含50 μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基上，于37℃倒置過夜培養(yǎng)。隨機挑取抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 分析和測序鑒定。

1.4.6Bar基因在蛹蟲草中的功能驗證 為驗證本試驗構(gòu)建載體（pAg-Bar）的有效性和Bar基因在蛹蟲草中的功能，首先把載體pAg-Bar 轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌AGL1 的感受態(tài)細(xì)胞，獲得菌株AGL1-pAg-Bar，然后參照Zheng 等[18]報道的ATMT 法對蛹蟲草分生孢子和農(nóng)桿菌菌株AGL1-pAg-Bar 進(jìn)行共培養(yǎng)，以實現(xiàn)Bar基因表達(dá)盒整合入蛹蟲草基因組。挑取共培養(yǎng)平板上的抗性轉(zhuǎn)化子，接種至含400 μg/mL 草銨膦的PDA 抗性培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性篩選。對具有草銨膦抗性的蛹蟲草轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因組提取，以提取的基因組為DNA 模板，采用引物F4/R4 和KOD FX DNA 聚合酶擴增轉(zhuǎn)化子中Bar基因表達(dá)盒的836 bp 片段，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，以鑒定Bar基因是否整合入蛹蟲草基因組。

2 結(jié)果與分析

2.1 草銨膦對蛹蟲草分生孢子生長的抑制作用

收集的蛹蟲草分生孢子見圖3。蛹蟲草分生孢子呈圓形或橢圓形，這與Zheng 等[23]的研究結(jié)果一致。

圖3 蛹蟲草分生孢子Fig.3 Conidia of C.militaris

不同濃度的草銨膦對蛹蟲草分生孢子生長的抑制效果見圖4。在不含草銨膦的PDA 培養(yǎng)基上，蛹蟲草分生孢子生長最快，菌落最大，而隨著PDA抗性培養(yǎng)基中草銨膦濃度的增加，蛹蟲草分生孢子的菌落越來越小，在草銨膦質(zhì)量濃度400 μg/mL時，蛹蟲草分生孢子的生長被完全抑制，這與Wang 等[21]采用的草銨膦濃度一致。Xiong 等[19]和茅文俊等[20]在蛹蟲草轉(zhuǎn)化子篩選試驗中所用草銨膦質(zhì)量濃度分別為150 μg/mL 和200 μg/mL，與本研究結(jié)果不一致，這可能是因菌株差異，不同蛹蟲草菌株對草銨膦的敏感程度不同所致。針對蛹蟲草菌株CM10，宜采用400 μg/mL 草銨膦進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。

圖4 草銨膦對蛹蟲草分生孢子生長的抑制Fig.4 Inhibition of glufosinate ammonium on the growth of C.militaris conidia

2.2 Bar 基因表達(dá)盒的構(gòu)建

抽提的質(zhì)粒pAg1-H3 和pCAMBIA3301 分別見圖5的泳道1 和泳道2。以質(zhì)粒pAg1-H3 為DNA 模板擴增的啟動子PtrpC（402 bp）和終止子TtrpC（770 bp），分別見圖5的泳道3 和泳道5，條帶清晰，啟動子PtrpC的長度在300～500 bp 之間，終止子TtrpC的長度在500～800 bp 之間。以質(zhì)粒pCAMBIA3301 為DNA 模板擴增的Bar基因（582 bp），見圖5的泳道4，條帶清晰，長度在500～700 bp 之間。采用DJ-PCR 方法融合啟動子PtrpC、Bar基因、終止子TtrpC 3 個元件，融合片段（1 694 bp）見圖5的泳道6，條帶明亮且清晰，長度在1 200～2 000 bp 之間，符合預(yù)期長度。經(jīng)測序鑒定，Bar基因表達(dá)盒融合成功，融合片段的5' 端有18 bp 序列，與載體pAg1-H3 的EcoR I 位點序列同源；融合片段的3' 端有18 bp 序列，與載體pAg1-H3 的Hind III 位點序列同源。

圖5 Bar 基因表達(dá)盒的構(gòu)建Fig.5 Construction of bar gene expression cassette

2.3 雙元載體pAg-Bar 的構(gòu)建

限制性內(nèi)切酶Hind III 和EcoR I 對質(zhì)粒pAg1-H3 的雙酶切效果見圖6的泳道1 和泳道2。雙酶切效果明顯，酶切后出現(xiàn)3 個條帶，擬回收的線性載體pAg1-H3 長度3 800 bp。純化回收線性載體pAg1-H3，結(jié)果見圖6的泳道3，條帶清晰明亮，符合預(yù)期長度，其兩端分別為限制性內(nèi)切酶Hind III 和EcoR I 的黏性末端。

采用限制性內(nèi)切酶Hind III 和EcoR I 對融合片段PtrpC-Bar-TtrpC 進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物（1 668 bp）見圖6的泳道4，條帶清晰明亮，該（插入）片段與線性載體pAg1-H3 進(jìn)行T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR 分析和測序、鑒定，成功構(gòu)建雙元載體pAg-Bar。抽提該質(zhì)粒，結(jié)果見圖6的泳道5。

在重組酶的作用下，DJ-PCR 融合的Bar基因表達(dá)盒與線性載體pAg1-H3 直接進(jìn)行同源重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR 分析和測序、鑒定，成功構(gòu)建雙元載體pAg-Bar。抽提該質(zhì)粒，結(jié)果見圖6的泳道6。

圖6 雙元載體pAg-Bar 的構(gòu)建Fig.6 Construction of binary vector pAg-Bar

以上結(jié)果表明，T4 DNA 連接酶法和同源重組法均可成功構(gòu)建雙元載體pAg-Bar。T4 DNA 連接酶法較同源重組法多了一步（插入片段的）雙酶切，酶切時間30 min，酶切產(chǎn)物仍需純化，純化時間1 h，表明T4 DNA 連接酶法更繁瑣、耗時。在線性載體與插入片段連接時，T4 DNA 連接酶法需2 h，而同源重組法僅需30 min，即同源重組法更省時。此外，T4 DNA 連接酶的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 后，在LB 抗性培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）上出現(xiàn)的菌落較少（圖7a），而重組酶的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 后，在LB 抗性培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落較多（圖7b），表明同源重組法更高效。綜上，在構(gòu)建載體時，同源重組法較T4 DNA 連接酶法更快速、更高效。

圖7 大腸桿菌DH5α 的轉(zhuǎn)化Fig.7 Transformation of Escherichia coli DH5α

2.4 Bar 基因在蛹蟲草中的功能驗證

農(nóng)桿菌菌株AGL1-pAg-Bar 與蛹蟲草分生孢子的共培養(yǎng)結(jié)果見圖8a。在含有400 μg/mL 草銨膦的PDA 抗性培養(yǎng)基上出現(xiàn)許多白色的蛹蟲草抗性菌落。挑取蛹蟲草抗性菌落進(jìn)行草銨膦抗性篩選，結(jié)果見圖8b。左側(cè)的蛹蟲草轉(zhuǎn)化子在PDA抗性培養(yǎng)基上生長良好，能夠抵抗400 μg/mL 草銨膦的抑制，而右側(cè)的野生型蛹蟲草CM10 被完全抑制，這表明獲得的蛹蟲草轉(zhuǎn)化子具有草銨膦抗性。隨機選取3 株具有草銨膦抗性的蛹蟲草轉(zhuǎn)化子，對其基因組進(jìn)行PCR 擴增，檢測Bar基因是否整合入蛹蟲草基因組，結(jié)果見圖8c。3 株轉(zhuǎn)化子均有清晰的條帶，長度在800 bp 左右，符合預(yù)期長度。經(jīng)測序鑒定，Bar基因被成功整合入蛹蟲草基因組，這表明本研究構(gòu)建的雙元載體pAg-Bar 能有效應(yīng)用于蛹蟲草，且Bar基因能作為蛹蟲草的選擇標(biāo)記基因。

圖8 Bar 基因在蛹蟲草中的功能驗證Fig.8 Functional verification of bar gene in C.militaris

3 結(jié)論

蛹蟲草分生孢子呈圓形或橢圓形，400 μg/mL草銨膦能夠完全抑制蛹蟲草分生孢子的生長。通過DJ-PCR 方法融合啟動子PtrpC、Bar基因和終止子TtrpC，成功獲得Bar基因表達(dá)盒PtrpC-Bar-TtrpC。T4 DNA 連接酶法和同源重組法均能有效構(gòu)建雙元載體pAg-Bar，而同源重組法更簡便、快速和高效。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蛹蟲草分生孢子，成功把雙元載體pAg-Bar 中的Bar基因整合入蛹蟲草基因組，并獲得具有草銨膦抗性的蛹蟲草轉(zhuǎn)化子。本研究不僅提供了一種快速構(gòu)建載體的方法，而且確定了雙元載體pAg-Bar 能夠用于蛹蟲草的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步明確了Bar基因適合作為蛹蟲草的選擇標(biāo)記基因，這對促進(jìn)蛹蟲草中關(guān)鍵基因的功能鑒定和活性物質(zhì)代謝途徑的解析，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。