弱后酸發(fā)酵劑菌株篩選及復(fù)配應(yīng)用研究

馮麗莉，張棟，劉堯堯，李建磊，李艷娟，馬蕊，賈洪利，王世杰

（1.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221；2.河北一然生物科技有限公司，石家莊 050800）

0 引言

酸奶是以生牛乳為主要原料，經(jīng)過(guò)殺菌后在發(fā)酵劑的作用下保溫發(fā)酵得到的凝固或非凝固狀態(tài)的乳制品[1]。酸奶發(fā)酵劑是一種以乳酸菌為主要成份的微生物培養(yǎng)物。發(fā)酵劑的發(fā)酵特性主要包括產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏等[2]，其中產(chǎn)酸是發(fā)酵劑最重要的發(fā)酵特性。但正常的發(fā)酵結(jié)束后，酸奶中的菌體持續(xù)產(chǎn)生乳酸引起產(chǎn)品pH 值降低，產(chǎn)生難以接受的過(guò)酸味，被稱為后酸化（Postacidification）[3]。目前解決后酸化的措施主要為冷鏈運(yùn)輸[4-5]和添加乳酸鏈球菌素[6-7]等。但我國(guó)目前尚未形成完整的食品冷鏈體系且添加乳酸鏈球菌素易對(duì)酸奶產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生影響并提高生產(chǎn)成本[8]。因此，控制酸奶后酸化的最佳途徑是篩選能在發(fā)酵條件下快速產(chǎn)酸，在低溫條件下產(chǎn)酸量較低的菌株[9-10]。所以，篩選具有優(yōu)良特性的乳酸菌并進(jìn)行發(fā)酵劑開(kāi)發(fā)是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酸奶的關(guān)鍵。

本研究旨在從自有菌庫(kù)中篩選發(fā)酵特性優(yōu)良的菌株，并將其通過(guò)合理配比得到一種整體發(fā)酵特性強(qiáng)、弱后酸化突出的的酸奶發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳，石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司；菌株，石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司研發(fā)管理中心菌種資源庫(kù)；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋。

1.2 設(shè)備

電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，日本YAMATO；pH 計(jì)，梅特勒-托利多集團(tuán)；pH 在線監(jiān)測(cè)儀，法國(guó)ALLIANCE 公司；7890A—5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑單菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)前期，從石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司菌種資源庫(kù)（以下簡(jiǎn)稱本公司菌種資源庫(kù)）的800 余株菌種中挑選活力較好的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共66株，初篩得到13 株優(yōu)異菌株，分別活化后編號(hào)1～13，各按1% 的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)好的13 株菌株以轉(zhuǎn)速3 500 r/min，4 ℃離心10 min，滅菌生理鹽水清洗一次，分別用滅菌脫脂奶（滅菌條件：115 ℃，15 min）混勻，以10%接種量于37 ℃進(jìn)行單菌株發(fā)酵，共發(fā)酵16 h。以pH值、酸度、黏度、活菌數(shù)、質(zhì)構(gòu)、凝乳發(fā)酵時(shí)間等指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選具備不同優(yōu)良發(fā)酵特性的發(fā)酵菌株。

1.3.2 發(fā)酵劑菌株復(fù)配

將篩選得到的菌株按照不同的比例復(fù)配后發(fā)酵，共復(fù)配3 種配方，編號(hào)為I、II、III。取商業(yè)發(fā)酵劑作為對(duì)照組，編號(hào)為Ⅳ，將發(fā)酵劑I～Ⅳ分別進(jìn)行中試發(fā)酵，發(fā)酵步驟為：分別稱取鮮牛乳920 g、白砂糖75 g、其他輔料5 g，在水浴中加熱攪拌使其充分融化，達(dá)65 ℃時(shí)，20 MPa 條件下均質(zhì)，95 ℃滅菌10min，降溫至42 ℃左右，接種發(fā)酵劑I～I(xiàn)II（約10 g/kg），42 ℃發(fā)酵至pH 值為4.5 終止發(fā)酵，破乳后放入4 ℃冷藏24 h 后熟，召集感官評(píng)價(jià)17 名人員對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。整體口感喜好度用9 點(diǎn)強(qiáng)度標(biāo)度法（9→1 表示喜歡→不喜歡，＜5 表示不被喜歡），其它感官特性用10 點(diǎn)強(qiáng)度標(biāo)度法（10→0 表示極強(qiáng)→察覺(jué)不到）。采用此方法對(duì)上述發(fā)酵乳樣品進(jìn)行整體喜好度、香氣、甜味、酸味、黏稠度、細(xì)膩度等指標(biāo)評(píng)價(jià)[11]。

1.3.3 發(fā)酵劑產(chǎn)酸測(cè)定

將活化好的單菌株按1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)好的菌株4 ℃，轉(zhuǎn)速為3 500 r/min 離心10 min，滅菌生理鹽水清洗一次，按篩選出的配方接種至滅菌脫脂奶混勻，采用pH 在線監(jiān)測(cè)發(fā)酵劑在滅菌乳中的pH 值變化情況。

將發(fā)酵后的酸奶，在分別在4，15，30，37 ℃放置；分別取0，7，14，21，28 d 測(cè)定發(fā)酵乳的活菌數(shù)、pH 值、酸度。其中酸度的測(cè)定采用GB 5413.34-2010 中第二法進(jìn)行[12]。計(jì)算公式如下：

式中：X2為試樣的酸度（°T）；c2為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）；V2為滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；m2為試樣的質(zhì)量（g）；0.1 為酸度理論定義氫氧化鈉的濃度（mol/L）。

1.3.4 發(fā)酵劑產(chǎn)香物質(zhì)分析

采用SPME 固相微萃取方式對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行產(chǎn)香物質(zhì)分析，分別取酸奶樣品7 mL，加入1 mL 飽和NaCl 溶液，60 ℃條件下用50/30 μm 的DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空恒溫萃取30 min，然后再將萃取頭在250 ℃進(jìn)樣口熱解析5 min，進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS解析。

（1）GC 條件。色譜柱：DB-WAX 聚乙二醇色譜柱；升溫程序起始溫度為35 ℃，保持6 min。然后以8 ℃/min的速率升至80 ℃，保持2 min。再以5 ℃/min的速度升至110 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升至210 ℃，保留10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

（2）MS 條件。EI 離子源：電子轟擊能量70 eV；離子源溫度：230 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌株發(fā)酵特性分析

產(chǎn)酸速率是乳酸菌最關(guān)鍵的發(fā)酵特性[13]。在酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)中，《GB 19302—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》對(duì)終產(chǎn)品的要求為酸度/（°T）≥70.0[14]，因此，產(chǎn)酸速度快、產(chǎn)酸量大是篩選發(fā)酵劑菌種的重要指標(biāo)。表1 結(jié)果顯示了自本公司菌種資源庫(kù)篩選出的66 株自有菌株中，優(yōu)選得到13 株，單菌株分別發(fā)酵16 h 后的不同pH 值。表中數(shù)據(jù)可以看出，菌株7的最終pH 最低，表明其在16 h 時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，而菌株13 的最終pH 值最高，在上述篩選菌株中產(chǎn)酸能力最弱。

酸奶的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味也是判斷乳酸菌發(fā)酵特性的重要標(biāo)準(zhǔn)[15-16]。表1 結(jié)果顯示了13 株自有菌株單株發(fā)酵后的質(zhì)構(gòu)特性和風(fēng)味香氣特性，結(jié)果表明4、11 號(hào)菌株發(fā)酵后樣品質(zhì)構(gòu)好，并有奶油香。12 號(hào)樣品拉絲性強(qiáng)。13號(hào)后酸弱，口味清淡。

表1 單菌株發(fā)酵特性結(jié)果

通過(guò)各單菌株的發(fā)酵特性比較，篩選出產(chǎn)酸正常、質(zhì)構(gòu)較好、香氣有特點(diǎn)的4 個(gè)單菌株，分別為第4，11，12，13號(hào)作為發(fā)酵劑的復(fù)配單菌株備用。

2.2 不同菌株組合發(fā)酵特性分析

將4 個(gè)單菌株進(jìn)行不同比例組合發(fā)酵劑配方，組合發(fā)酵劑3 個(gè)，分別為：將上述配方復(fù)配發(fā)酵劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，經(jīng)復(fù)配發(fā)酵劑發(fā)酵制備的樣品II 酸度最高、pH 值最低，表明在4 種復(fù)配發(fā)酵劑中，發(fā)酵劑II 的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)4 組發(fā)酵樣品的整體評(píng)價(jià)為：Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。各復(fù)配發(fā)酵劑發(fā)酵特性結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 各復(fù)配發(fā)酵劑發(fā)酵特性結(jié)果

9 點(diǎn)強(qiáng)度標(biāo)度法對(duì)發(fā)酵樣品的整體口感喜好度進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，數(shù)據(jù)分析用配對(duì)T 檢驗(yàn)，圖1 為整體喜好及各指標(biāo)平均值的雷達(dá)圖。由圖1 可以看出，在5%顯著性水平上，整體喜好度綜合排序?yàn)棰螅劲瘢劲颉?組樣品的整體口感喜好度無(wú)顯著性差異。這一結(jié)果表明，3 組發(fā)酵樣品中，Ⅲ號(hào)發(fā)酵樣品的整體喜好度偏高，香氣最強(qiáng)，酸味和甜味適中，即Ⅲ號(hào)發(fā)酵劑的發(fā)酵效果最佳，適合用于制備口感、品質(zhì)優(yōu)良的發(fā)酵酸奶。

圖1 復(fù)配發(fā)酵劑的感官評(píng)分

2.3 發(fā)酵劑產(chǎn)酸

篩選得到的Ⅲ號(hào)發(fā)酵劑命名為JLB-1510，取商業(yè)化發(fā)酵劑作為對(duì)照，利用兩種發(fā)酵劑分別進(jìn)行發(fā)酵，6 h左右后發(fā)酵達(dá)到pH＜4.5時(shí)停止發(fā)酵，將JLB-1510發(fā)酵得到的樣品記為實(shí)驗(yàn)組，商業(yè)化發(fā)酵劑發(fā)酵得到的樣品記為對(duì)照組。將發(fā)酵好的樣品分別放置于4 ℃、15 ℃、室溫和30 ℃環(huán)境，分別在發(fā)酵后20 h、2 d、3 d、5 d、7 d、11 d、15 d、19 d、21 d 檢測(cè)其pH 值，發(fā)酵后2、3、5、7、11、15、19、21 d檢測(cè)其酸度，共21 d。

通過(guò)21 天得到的階段數(shù)據(jù)顯示，在保質(zhì)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品在pH、酸度、黏度指標(biāo)上無(wú)顯著差異，但具體結(jié)果顯示：恒溫4 ℃條件下，21 d 內(nèi)實(shí)驗(yàn)組樣品的pH 值始終高于對(duì)照組，除第5 天、第11 天以外，實(shí)驗(yàn)組樣品的酸度之均低于對(duì)照組；恒溫15 ℃條件下，21 d 內(nèi)實(shí)驗(yàn)組樣品的pH 值始終高于對(duì)照組，酸度值低于對(duì)照組；室溫條件下，21 d 內(nèi)實(shí)驗(yàn)組樣品的pH 值始終高于對(duì)照組，除第15 天以外，其余時(shí)間實(shí)驗(yàn)組樣品的酸度均低于對(duì)照組；恒溫30 ℃條件下，第15天實(shí)驗(yàn)組pH 值低于對(duì)照組，其余均高于對(duì)照組，第5天實(shí)驗(yàn)組酸度高于對(duì)照組，其余均低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，在不同溫度條件下，JLB-1510 發(fā)酵劑后酸較弱，能較好地保持發(fā)酵乳制品風(fēng)味。

2.4 發(fā)酵乳香氣物質(zhì)分析

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，主要包括乙醛、乙酸、乙偶姻、丙酮等[17-18]，這些物質(zhì)作為揮發(fā)性有機(jī)芳香成分形成酸奶終產(chǎn)品的典型風(fēng)味[19-20]。以JLB-1510 為1#，商業(yè)發(fā)酵劑為2#，分別中試發(fā)酵乳后，對(duì)兩個(gè)中試樣品的香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3、表3。

表3 主要風(fēng)味物質(zhì)的峰面積響應(yīng)值及香氣描述

對(duì)比圖3 中兩個(gè)樣品的色譜圖，香氣物質(zhì)組成基本一致，都含有：醛酮類（乙醛、丁二酮、戊二酮、2-庚酮、乙偶姻），和揮發(fā)性的酸類（乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸）。對(duì)比峰面積的響應(yīng)值，2#樣品中醛酮類物質(zhì)都要略高于1#樣品，說(shuō)明2#樣品表現(xiàn)的奶油、黃油樣的香氣略強(qiáng)于1#樣品；然而，1#樣品中的己酸、癸酸和辛酸的響應(yīng)值比2#樣品偏高，說(shuō)明1#樣品表現(xiàn)出的油脂、奶酪樣香氣更為濃郁?？傮w而言，兩個(gè)樣品的香氣物質(zhì)構(gòu)成一致，整體香氣風(fēng)味接近，但兩個(gè)樣品也略有微小差異，1#樣品油脂、奶酪香更濃郁，2#樣品奶油、黃油樣香氣更濃。

圖3 香氣物質(zhì)分析

以上結(jié)果表明，由JLB-1510 發(fā)酵制備的1#樣品與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵制備的2#樣品香氣物質(zhì)構(gòu)成一致，整體香氣風(fēng)味接近，但兩個(gè)樣品仍存在差異，其中1#樣品油脂、奶酪香更濃郁，2#樣品奶油、黃油樣香氣更濃。

圖2 不同溫度條件下發(fā)酵樣品產(chǎn)酸情況

3 結(jié)論

本研究挖掘本公司菌種庫(kù)種發(fā)酵性能優(yōu)良的單菌株，并按其發(fā)酵特性進(jìn)行不同比例的復(fù)配，開(kāi)發(fā)了一種弱后酸化的酸奶發(fā)酵劑JLB-1510。本研究開(kāi)發(fā)的發(fā)酵劑JLB-1510，發(fā)酵制備的酸奶香氣清淡、感官評(píng)價(jià)結(jié)果良好，與傳統(tǒng)商業(yè)化發(fā)酵劑制備的酸奶相比，能在4 ℃、15 ℃、常溫、30 ℃不同的溫度環(huán)境中，21 d 時(shí)間內(nèi)維持較低的酸度和較高的pH 值，是一款發(fā)酵性能優(yōu)良的弱后酸化酸奶發(fā)酵劑，可應(yīng)用于發(fā)酵酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)，并提高發(fā)酵乳的口感和品質(zhì)。為解決我國(guó)冷鏈運(yùn)輸系統(tǒng)不完善，發(fā)酵酸奶的銷售半徑受限制[21]和酸奶發(fā)酵劑長(zhǎng)期依賴于國(guó)外進(jìn)口[22]的現(xiàn)狀提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。