二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒奶粉中的壬基酚

楊晉青，虞成華，翁史昱

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

0 引言

壬基酚（nonylphenol，NP）是一種能夠干擾生物和人體激素合成、分泌、傳遞、結(jié)合以及消除等環(huán)節(jié)的環(huán)境類激素。相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)NP 的雌激素效應(yīng)和生物毒性[1-3]。由于壬基酚常作為塑料增塑劑使用，所以塑料食品包裝材料中的壬基酚很容易遷移至食品中，給食品帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。壬基酚在剛開(kāi)始發(fā)育的嬰幼兒身上作用將更加明顯，可能對(duì)嬰幼兒的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，使得嬰幼兒性發(fā)育速度過(guò)快，免疫能力差[4-6]。

目前，檢測(cè)壬基酚的方法有酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜質(zhì)譜法等，檢測(cè)對(duì)象包括包裝材料、水、蛋、牛奶、奶粉、水產(chǎn)品等樣品類型，研究方法也各有不同[7-14]。由于目前缺乏奶粉中壬基酚檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，壬基酚的食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)指定檢驗(yàn)方法為BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質(zhì)的測(cè)定》，該方法前處理過(guò)程需要固相萃取柱凈化、氮吹儀濃縮等步驟，容易造成本底值偏高或樣品被污染的相關(guān)問(wèn)題?；诙喾N分離機(jī)理的多維色譜技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)單，前處理時(shí)間可大大縮短，已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用到食品分析中[15-16]。本研究將建立一種使用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中壬基酚的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單高效、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。能夠準(zhǔn)確的對(duì)奶粉中的壬基酚殘留量進(jìn)行檢測(cè)，為奶粉產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供有力技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：甲醇，乙腈，均為色譜純；氨水（分析純），水為符合GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水（Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備）。

標(biāo)準(zhǔn)品：壬基酚（CAS號(hào)：25154-52-3）純度≥99.0%；壬基酚-13C6（CAS 號(hào)：1173020-38-6；100 μg/mL溶于乙腈中），于-20 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo U3000 雙三元高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Thermo TSQ QUANTUM UL?TRA 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；其他設(shè)備包括超聲儀，上海鯨德公司；Vortex Ge?nius 3 型漩渦混合器，德國(guó)IKA 公司；離心機(jī)，德國(guó)Ep?pendorf公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液；壬基酚-13C6則用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 mg/L），加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液（1 mg/L），用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、20 μg/L和50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

第一維色譜柱：Waters XBridge C8：2.1 mm× 30 mm，10 μm；第二維色譜柱：Agilent Eclipse plus C18：2.1 mm×100 mm，3.5 μm。A1 和B1 流動(dòng)相對(duì)應(yīng)泵1，A2 和B2 對(duì)應(yīng)泵2，流動(dòng)相A1 和A2 為甲醇，流動(dòng)相B1 和B2 為水。泵1 的流速為2 mL/min，泵2 的流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量100 μL。泵1 和泵2 的梯度如表1 所示。

表1 二維液相梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI 源；掃描方式為負(fù)離子；鞘氣流量為55 L/min；輔助氣流量為15 L/min；噴霧電壓為-3 500 V；毛細(xì)管溫度為350 ℃；碰撞氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%）；離子傳輸管電壓為73 V，數(shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。定性定量離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)如表2 所示，壬基酚的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖結(jié)果如圖1～2所示。

表2 壬基酚的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

圖2 樣品中壬基酚的MRM色譜圖

1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證

定性測(cè)定：被測(cè)組分選擇1 個(gè)母離子，2 個(gè)子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在2.5%之內(nèi)；且樣品中被測(cè)組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過(guò)表3 規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。

表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

定量測(cè)定：將壬基酚標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中壬基酚與其對(duì)應(yīng)的13C 同位素標(biāo)記物的濃度比為橫坐標(biāo)，峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到壬基酚峰面積與對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中壬基酚的濃度。

1.5 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.001 g）樣品于15 mL 具塞玻璃試管中，加入0.01 mL同位素內(nèi)標(biāo)工作液和10 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取15 min，置冰箱-20 ℃冷凍2 h，取出于8 000 r/min 離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。按上述操作步驟同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)選用了Agilent Eclipse plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）作為實(shí)驗(yàn)用柱，分別比較了水/甲醇，水/乙腈，0.1%氨水溶液/甲醇，0.1%氨水溶液/乙腈，2 mmol/L 乙酸銨/乙腈這幾種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物離子化程度的影響，研究結(jié)果表明，采用水/甲醇作為流動(dòng)相洗脫，獲得了理想的峰形，質(zhì)譜信號(hào)最強(qiáng)。其他流動(dòng)相均會(huì)使信號(hào)降低，這可能是由于使用其他流動(dòng)相時(shí)離子源中濃度過(guò)高會(huì)抑制壬基酚的電離，從而導(dǎo)致離子化效率下降的緣故。

2.2 二維色譜流路構(gòu)建與切換時(shí)間的確定

二維液相色譜既要考慮2 個(gè)維度的體系兼容性，又要考慮這2 個(gè)維度存在一定的差異，本研究選用了Waters XBridge C8（2.1 mm× 30 mm，10 μm）作為第一色譜柱，Agilent Eclipse plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）為第二色譜柱。在表1 液相條件下，壬基酚的分離度好，信號(hào)響應(yīng)大，雜質(zhì)干擾小，如圖1 所示。由圖1 可知壬基酚在第二維色譜柱的保留時(shí)間為4.98 min。因此將閥切換時(shí)間的設(shè)定在3.0 min之后。

二維液相色譜的具體連接方法如圖3 所示。在0～3 min，六通閥處于1 和2 連通狀態(tài)，如圖3（a）。樣品經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器導(dǎo)入第一維色譜柱（在線凈化柱），通過(guò)泵1 系統(tǒng)，流動(dòng)相以一定流速淋洗第一維色譜柱，去除干擾基質(zhì)，同時(shí)將樣品富集在柱頭處。與此同時(shí)，第二維色譜柱（分析柱）通過(guò)泵2 系統(tǒng)以初始流動(dòng)相進(jìn)行平衡；在3～4 min，六通閥處于1 和6 連通狀態(tài)，如圖3（b）。此時(shí)，第一維色譜柱與第二維色譜柱串聯(lián)，通過(guò)泵2，流動(dòng)相將富集在第一維色譜柱上的樣品導(dǎo)入第二維色譜柱中進(jìn)行分離分析；在4.0～10.0 min，六通閥處于1和2連通狀態(tài)，如圖3（a）。此時(shí)，第一維色譜柱與第二維色譜柱在各自的流動(dòng)相條件下沖洗和平衡。

圖3 二維液相色譜系統(tǒng)連接示意圖

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

壬基酚具有一定的弱極性或中等極性，選擇電噴霧（ESI）離子源分別在正離子、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，對(duì)比兩種模式，得出壬基酚負(fù)離子模式的離子峰強(qiáng)度比正離子峰強(qiáng)度高很多。而且其分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，因此選擇負(fù)離子模式檢測(cè)，首先進(jìn)行一級(jí)母離子全掃描，確定其母離子，再用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描分析，選擇豐度相對(duì)較高、質(zhì)荷比較大的兩個(gè)特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過(guò)優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、鞘氣、輔助加熱氣、離子傳輸管電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使壬基酚的母離子與特征碎片子離子的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。結(jié)果表明：壬基酚在負(fù)離子化模式下易形成一級(jí)特征離子峰[M-H]-219.3（m/z）和很強(qiáng)的二級(jí)特征離子峰為133.1（m/z），具體的二級(jí)特征離子峰見(jiàn)圖1。

2.4 樣品前處理方法的確定

本文采用乙腈作為提取溶劑，主要是考慮到乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時(shí)具有沉淀蛋白的作用，且?guī)С龅娜鯓O性成分較少。超聲時(shí)間是對(duì)結(jié)果影響較大的因素之一，對(duì)5，10，15，20 min 和30 min 不同超聲時(shí)間進(jìn)行了試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明超聲15 min后，樣品的回收率就能達(dá)到90%以上。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.5 空白試驗(yàn)的考察

為了盡量降低空白實(shí)驗(yàn)的本底含量，實(shí)驗(yàn)器皿盡量都采用玻璃制品，而且發(fā)現(xiàn)濾膜、注射器和進(jìn)樣小瓶等實(shí)驗(yàn)用品均對(duì)空白實(shí)驗(yàn)的本底支有很大影響，如圖5 所示。故建議實(shí)驗(yàn)中使用到的所有有機(jī)溶劑和實(shí)驗(yàn)材料，在使用前，必須先考察空白實(shí)驗(yàn)的本底含量。

圖5 空白樣品中壬基酚的MRM色譜圖

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中復(fù)雜的干擾物對(duì)分析物質(zhì)譜響應(yīng)的抑制或增強(qiáng)，可用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評(píng)估[17]。本工作通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液中的內(nèi)標(biāo)的物質(zhì)的峰面積進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)壬基酚在奶粉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)比值小于1，存在輕微的基質(zhì)抑制效應(yīng)，但可通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行消除。

2.7 線性范圍和檢出限

根據(jù)儀器工作條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以壬基酚的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，壬基酚的質(zhì)量濃度在0.5～50 μg/L 內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=4.938×10-2x+6.122×10-2，相關(guān)系數(shù)不小于0.999。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S/N）為0.5 μg/kg，10倍信噪比計(jì)算方法的定量限（10S/N）為1.0 μg/kg。BJS 201913 方法的定量限為2.0 μg/kg，該方法可以滿足日常嬰幼兒奶粉中壬基酚的定量需求。

2.8 回收率和精密度試驗(yàn)

取經(jīng)檢驗(yàn)不含壬基酚的嬰幼兒奶粉樣品，分別按樣品中1、2、10 μg/kg 含量水平添加一定量的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一添加濃度重復(fù)6 份樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，計(jì)算其回收率和精密度。得到3 個(gè)添加水平下的回收率結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明：在3 個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率在85.4%～97.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%～5.11%。

表5 壬基酚回收率及精密度（n=6）

2.9 方法比對(duì)

按照試驗(yàn)方法對(duì)6 種嬰幼兒奶粉進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)和BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行比較，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知：本方法和BJS 201913 方法相對(duì)偏差小于10%；并經(jīng)F 檢驗(yàn)雙樣本方差分析，當(dāng)a=0.05 時(shí)，F(xiàn)=1.01，小于F 臨界值5.05，說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異。該方法可用于嬰幼兒奶粉中壬基酚殘留的快速檢測(cè)。與BJS 201913 相比，本方法由于省去了前處理過(guò)程的固相萃取柱凈化和濃縮步驟，節(jié)約了前處理時(shí)間，并且降低了本底值偏高或樣品被污染的可能性。

表6 不同測(cè)定方法的結(jié)果比對(duì)

3 結(jié)論

本文建立了一種使用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中壬基酚含量的檢測(cè)方法，該方法在0.5～50 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999；定量限為1.0 μg/kg；在3 個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率在85.4%～97.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%～5.11%。使用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，證明該方法具有特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于嬰幼兒奶粉中壬基酚的測(cè)定。