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    二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒奶粉中的壬基酚

    2021-11-22 08:02:48楊晉青虞成華翁史昱
    中國(guó)乳品工業(yè) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:壬基奶粉乙腈

    楊晉青,虞成華,翁史昱

    (上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 200233)

    0 引言

    壬基酚(nonylphenol,NP)是一種能夠干擾生物和人體激素合成、分泌、傳遞、結(jié)合以及消除等環(huán)節(jié)的環(huán)境類激素。相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)NP 的雌激素效應(yīng)和生物毒性[1-3]。由于壬基酚常作為塑料增塑劑使用,所以塑料食品包裝材料中的壬基酚很容易遷移至食品中,給食品帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。壬基酚在剛開(kāi)始發(fā)育的嬰幼兒身上作用將更加明顯,可能對(duì)嬰幼兒的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響,使得嬰幼兒性發(fā)育速度過(guò)快,免疫能力差[4-6]。

    目前,檢測(cè)壬基酚的方法有酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜質(zhì)譜法等,檢測(cè)對(duì)象包括包裝材料、水、蛋、牛奶、奶粉、水產(chǎn)品等樣品類型,研究方法也各有不同[7-14]。由于目前缺乏奶粉中壬基酚檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),壬基酚的食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)指定檢驗(yàn)方法為BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質(zhì)的測(cè)定》,該方法前處理過(guò)程需要固相萃取柱凈化、氮吹儀濃縮等步驟,容易造成本底值偏高或樣品被污染的相關(guān)問(wèn)題?;诙喾N分離機(jī)理的多維色譜技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)單,前處理時(shí)間可大大縮短,已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用到食品分析中[15-16]。本研究將建立一種使用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中壬基酚的方法,該方法具有操作簡(jiǎn)單高效、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。能夠準(zhǔn)確的對(duì)奶粉中的壬基酚殘留量進(jìn)行檢測(cè),為奶粉產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供有力技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    試劑:甲醇,乙腈,均為色譜純;氨水(分析純),水為符合GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水(Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備)。

    標(biāo)準(zhǔn)品:壬基酚(CAS號(hào):25154-52-3)純度≥99.0%;壬基酚-13C6(CAS 號(hào):1173020-38-6;100 μg/mL溶于乙腈中),于-20 ℃保存。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Thermo U3000 雙三元高效液相色譜儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司;Thermo TSQ QUANTUM UL?TRA 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司;其他設(shè)備包括超聲儀,上海鯨德公司;Vortex Ge?nius 3 型漩渦混合器,德國(guó)IKA 公司;離心機(jī),德國(guó)Ep?pendorf公司。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取10.0 mg的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液;壬基酚-13C6則用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

    分別準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 mg/L),加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1 mg/L),用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、20 μg/L和50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    1.4 儀器條件

    1.4.1 液相色譜條件

    第一維色譜柱:Waters XBridge C8:2.1 mm× 30 mm,10 μm;第二維色譜柱:Agilent Eclipse plus C18:2.1 mm×100 mm,3.5 μm。A1 和B1 流動(dòng)相對(duì)應(yīng)泵1,A2 和B2 對(duì)應(yīng)泵2,流動(dòng)相A1 和A2 為甲醇,流動(dòng)相B1 和B2 為水。泵1 的流速為2 mL/min,泵2 的流速為0.4 mL/min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量100 μL。泵1 和泵2 的梯度如表1 所示。

    表1 二維液相梯度洗脫條件

    1.4.2 質(zhì)譜條件

    離子源為ESI 源;掃描方式為負(fù)離子;鞘氣流量為55 L/min;輔助氣流量為15 L/min;噴霧電壓為-3 500 V;毛細(xì)管溫度為350 ℃;碰撞氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%);離子傳輸管電壓為73 V,數(shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。定性定量離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)如表2 所示,壬基酚的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖結(jié)果如圖1~2所示。

    表2 壬基酚的質(zhì)譜參數(shù)

    圖1 壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

    圖2 樣品中壬基酚的MRM色譜圖

    1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證

    定性測(cè)定:被測(cè)組分選擇1 個(gè)母離子,2 個(gè)子離子,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在2.5%之內(nèi);且樣品中被測(cè)組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較,偏差不超過(guò)表3 規(guī)定的范圍,則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。

    表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

    定量測(cè)定:將壬基酚標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,測(cè)定相應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中壬基酚與其對(duì)應(yīng)的13C 同位素標(biāo)記物的濃度比為橫坐標(biāo),峰面積比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,得到壬基酚峰面積與對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中壬基酚的濃度。

    1.5 樣品前處理方法

    準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)樣品于15 mL 具塞玻璃試管中,加入0.01 mL同位素內(nèi)標(biāo)工作液和10 mL乙腈,渦旋混勻,超聲提取15 min,置冰箱-20 ℃冷凍2 h,取出于8 000 r/min 離心5 min,取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜后,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。按上述操作步驟同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 流動(dòng)相的選擇

    實(shí)驗(yàn)選用了Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)作為實(shí)驗(yàn)用柱,分別比較了水/甲醇,水/乙腈,0.1%氨水溶液/甲醇,0.1%氨水溶液/乙腈,2 mmol/L 乙酸銨/乙腈這幾種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物離子化程度的影響,研究結(jié)果表明,采用水/甲醇作為流動(dòng)相洗脫,獲得了理想的峰形,質(zhì)譜信號(hào)最強(qiáng)。其他流動(dòng)相均會(huì)使信號(hào)降低,這可能是由于使用其他流動(dòng)相時(shí)離子源中濃度過(guò)高會(huì)抑制壬基酚的電離,從而導(dǎo)致離子化效率下降的緣故。

    2.2 二維色譜流路構(gòu)建與切換時(shí)間的確定

    二維液相色譜既要考慮2 個(gè)維度的體系兼容性,又要考慮這2 個(gè)維度存在一定的差異,本研究選用了Waters XBridge C8(2.1 mm× 30 mm,10 μm)作為第一色譜柱,Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)為第二色譜柱。在表1 液相條件下,壬基酚的分離度好,信號(hào)響應(yīng)大,雜質(zhì)干擾小,如圖1 所示。由圖1 可知壬基酚在第二維色譜柱的保留時(shí)間為4.98 min。因此將閥切換時(shí)間的設(shè)定在3.0 min之后。

    二維液相色譜的具體連接方法如圖3 所示。在0~3 min,六通閥處于1 和2 連通狀態(tài),如圖3(a)。樣品經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器導(dǎo)入第一維色譜柱(在線凈化柱),通過(guò)泵1 系統(tǒng),流動(dòng)相以一定流速淋洗第一維色譜柱,去除干擾基質(zhì),同時(shí)將樣品富集在柱頭處。與此同時(shí),第二維色譜柱(分析柱)通過(guò)泵2 系統(tǒng)以初始流動(dòng)相進(jìn)行平衡;在3~4 min,六通閥處于1 和6 連通狀態(tài),如圖3(b)。此時(shí),第一維色譜柱與第二維色譜柱串聯(lián),通過(guò)泵2,流動(dòng)相將富集在第一維色譜柱上的樣品導(dǎo)入第二維色譜柱中進(jìn)行分離分析;在4.0~10.0 min,六通閥處于1和2連通狀態(tài),如圖3(a)。此時(shí),第一維色譜柱與第二維色譜柱在各自的流動(dòng)相條件下沖洗和平衡。

    圖3 二維液相色譜系統(tǒng)連接示意圖

    2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    壬基酚具有一定的弱極性或中等極性,選擇電噴霧(ESI)離子源分別在正離子、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,對(duì)比兩種模式,得出壬基酚負(fù)離子模式的離子峰強(qiáng)度比正離子峰強(qiáng)度高很多。而且其分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,因此選擇負(fù)離子模式檢測(cè),首先進(jìn)行一級(jí)母離子全掃描,確定其母離子,再用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描分析,選擇豐度相對(duì)較高、質(zhì)荷比較大的兩個(gè)特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過(guò)優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、鞘氣、輔助加熱氣、離子傳輸管電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù),使壬基酚的母離子與特征碎片子離子的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。結(jié)果表明:壬基酚在負(fù)離子化模式下易形成一級(jí)特征離子峰[M-H]-219.3(m/z)和很強(qiáng)的二級(jí)特征離子峰為133.1(m/z),具體的二級(jí)特征離子峰見(jiàn)圖1。

    2.4 樣品前處理方法的確定

    本文采用乙腈作為提取溶劑,主要是考慮到乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時(shí)具有沉淀蛋白的作用,且?guī)С龅娜鯓O性成分較少。超聲時(shí)間是對(duì)結(jié)果影響較大的因素之一,對(duì)5,10,15,20 min 和30 min 不同超聲時(shí)間進(jìn)行了試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明超聲15 min后,樣品的回收率就能達(dá)到90%以上。

    圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

    2.5 空白試驗(yàn)的考察

    為了盡量降低空白實(shí)驗(yàn)的本底含量,實(shí)驗(yàn)器皿盡量都采用玻璃制品,而且發(fā)現(xiàn)濾膜、注射器和進(jìn)樣小瓶等實(shí)驗(yàn)用品均對(duì)空白實(shí)驗(yàn)的本底支有很大影響,如圖5 所示。故建議實(shí)驗(yàn)中使用到的所有有機(jī)溶劑和實(shí)驗(yàn)材料,在使用前,必須先考察空白實(shí)驗(yàn)的本底含量。

    圖5 空白樣品中壬基酚的MRM色譜圖

    2.6 基質(zhì)效應(yīng)

    質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中復(fù)雜的干擾物對(duì)分析物質(zhì)譜響應(yīng)的抑制或增強(qiáng),可用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評(píng)估[17]。本工作通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液中的內(nèi)標(biāo)的物質(zhì)的峰面積進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)壬基酚在奶粉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)比值小于1,存在輕微的基質(zhì)抑制效應(yīng),但可通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行消除。

    2.7 線性范圍和檢出限

    根據(jù)儀器工作條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以壬基酚的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,壬基酚的質(zhì)量濃度在0.5~50 μg/L 內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=4.938×10-2x+6.122×10-2,相關(guān)系數(shù)不小于0.999。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)為0.5 μg/kg,10倍信噪比計(jì)算方法的定量限(10S/N)為1.0 μg/kg。BJS 201913 方法的定量限為2.0 μg/kg,該方法可以滿足日常嬰幼兒奶粉中壬基酚的定量需求。

    2.8 回收率和精密度試驗(yàn)

    取經(jīng)檢驗(yàn)不含壬基酚的嬰幼兒奶粉樣品,分別按樣品中1、2、10 μg/kg 含量水平添加一定量的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,每一添加濃度重復(fù)6 份樣品,按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定,計(jì)算其回收率和精密度。得到3 個(gè)添加水平下的回收率結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明:在3 個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率在85.4%~97.3%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%~5.11%。

    表5 壬基酚回收率及精密度(n=6)

    2.9 方法比對(duì)

    按照試驗(yàn)方法對(duì)6 種嬰幼兒奶粉進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)和BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行比較,比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知:本方法和BJS 201913 方法相對(duì)偏差小于10%;并經(jīng)F 檢驗(yàn)雙樣本方差分析,當(dāng)a=0.05 時(shí),F(xiàn)=1.01,小于F 臨界值5.05,說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異。該方法可用于嬰幼兒奶粉中壬基酚殘留的快速檢測(cè)。與BJS 201913 相比,本方法由于省去了前處理過(guò)程的固相萃取柱凈化和濃縮步驟,節(jié)約了前處理時(shí)間,并且降低了本底值偏高或樣品被污染的可能性。

    表6 不同測(cè)定方法的結(jié)果比對(duì)

    3 結(jié)論

    本文建立了一種使用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中壬基酚含量的檢測(cè)方法,該方法在0.5~50 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性,線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999;定量限為1.0 μg/kg;在3 個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率在85.4%~97.3%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%~5.11%。使用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),證明該方法具有特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),適用于嬰幼兒奶粉中壬基酚的測(cè)定。

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