基于MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)不同地區(qū)奶豆腐細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

張春林，張苗苗，楊甜甜，郭壯，肖石高，侯強(qiáng)川

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.湖北澳利龍食品股份有限公司，湖北宜昌 444100）

0 引言

奶豆腐是一種以牛奶、馬奶、羊奶為原料，經(jīng)煮沸使乳清與乳酪分離，隨后經(jīng)過(guò)凝固、自然發(fā)酵等過(guò)程制作而成的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品[1]，因其形狀與豆腐相似而得名。奶豆腐已有幾千年的食用歷史，深受我國(guó)北方蒙古、哈薩克等游牧民族的喜愛(ài)[2]。奶豆腐中富含蛋白質(zhì)、氨基酸以及對(duì)人體有益的微量元素[3]，具有提高免疫力、美容養(yǎng)顏等方面的作用。目前我國(guó)奶豆腐的消費(fèi)較少，究其原因與當(dāng)前奶豆腐主要以手工制作為主，尚未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品品質(zhì)無(wú)法得到有效保障等有關(guān)。

作為一種代表性傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，奶豆腐中有著豐富的微生物群系，其在產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其中細(xì)菌對(duì)于奶豆腐風(fēng)味及感官品質(zhì)的形成發(fā)揮重要作用。例如乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)[4]，有利于奶豆腐的凝固，同時(shí)提高了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味[5]，而丙酸桿菌和哈夫尼菌等細(xì)菌的存在則有利于奶豆腐顏色的形成[6]。傳統(tǒng)手工奶豆腐多為牧民自家制作，制作環(huán)境、生產(chǎn)工藝[7]、氣候條件[8]等因素均會(huì)對(duì)奶豆腐微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致不同地區(qū)手工制作的奶豆腐品質(zhì)存在差異。因此，對(duì)奶豆腐細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析有助于揭示不同地區(qū)奶豆腐風(fēng)味品質(zhì)存在差異的潛在機(jī)制，促進(jìn)奶豆腐后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)。當(dāng)前以Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)為代表的第二代測(cè)序技術(shù)具有通量大、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠全面解析微生物群落結(jié)構(gòu)[9]，目前已經(jīng)應(yīng)用于食品[10]、土壤[11]、水體[12]等領(lǐng)域的研究。

本研究從新疆塔城和內(nèi)蒙古錫林郭勒兩個(gè)代表性的奶豆腐制作地區(qū)各采集了10 份奶豆腐樣品，采用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，探究了兩個(gè)地區(qū)奶豆腐中微生物群落結(jié)構(gòu)的共性和差異，為奶豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)及品質(zhì)控制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

奶豆腐：采集自新疆塔城和內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)各10 份，奶豆腐樣品收集后置于自封袋中，依次編號(hào)為T(mén)C1～TC10和XM1～XM10，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室中于-20 ℃暫存，用于后續(xù)分析。

DNeasy mericon Food Kit 提取試劑盒，德國(guó)QIA?GEN 公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；Illumina MiSeq 測(cè)序配套試劑，美國(guó)Illumina公司。

1.1.2 設(shè)備

MiSeq PE250 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina 公司；R930 機(jī)架式服務(wù)器，美國(guó)DELL 公司；Veriti FAST梯度PCR 儀，美國(guó)ABI公司。

1.2 奶豆腐DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和高通量測(cè)序

將奶豆腐樣品解凍完成后用無(wú)菌研缽將其磨碎置于無(wú)酶無(wú)菌離心管中，使用QIAGEN DNeasymeri?con Food Kit 試劑盒進(jìn)行基因組DNA 提取。參照Wang 等人的研究方法[13]，使用帶不同barcode 的16S引物以16S rRNA V3～V4 區(qū)為靶點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將經(jīng)過(guò)純度和完整性檢測(cè)合格后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Illu?mina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

根據(jù)引物中不同的barcode（核苷酸標(biāo)簽）將返回的序列分配給每個(gè)樣品，使用QIIME 分析平臺(tái)[14]將合格的序列依次 使用PyNAST[15]、UCLUST[16]、Chime?raSlayer 進(jìn)行對(duì)齊、劃分操作分類單元（operational tax?onomic units，OTU）以及去除含嵌合體OTU 的操作，然后使用Silva[17]、Greengene[18]和RDP[19]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)以明確各OTU 的分類學(xué)地位，并對(duì)各樣品菌群α多樣性和不同地區(qū)樣品菌群β多樣性進(jìn)行計(jì)算。

1.4 圖形繪制與數(shù)據(jù)分析

使用R 軟件（v3.6.2）對(duì)α多樣性指數(shù)、相關(guān)性熱圖進(jìn)行可視化，基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac 距離進(jìn)行β多樣性分析，使用Canoco（v4.5）軟件進(jìn)行冗余分析（Re?dundancy analysis，RDA），其他圖均采用origin2017 進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)奶豆腐中細(xì)菌群落組成分析

本研究20 份奶豆腐樣本中共測(cè)得序列647 963條，平均每份樣本的測(cè)序量為32 398 條。依據(jù)97%相似度進(jìn)行OTU劃分后共得到4 760個(gè)非嵌合體OTU，平均每份樣本OTU 數(shù)為238 個(gè)?；贠TU 的注釋信息，本研究首先在門(mén)水平對(duì)不同地區(qū)奶豆腐中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度

所有奶豆腐樣本中共注釋到32 個(gè)細(xì)菌門(mén)。由圖1 可知，奶豆腐中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（平均相對(duì)含量大于1.0%）共有4 個(gè)，分別為Firmicutes（硬壁菌門(mén)）、Proteo?bacteria（變形菌門(mén)）、Actinobacteria（放線菌門(mén)）和Bac?teroidetes（擬桿菌門(mén)），其平均相對(duì)含量分別為69.56%、20.35%、6.85%和2.19%，累計(jì)相對(duì)含量為98.95%。這與雷炎[20]等人之前的研究基本一致，不同之處在于上述研究發(fā)現(xiàn)奶豆腐中硬壁菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)含量基本相同。顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，塔城地區(qū)樣品中放線菌門(mén)的相對(duì)含量顯著高于錫林郭勒地區(qū)（P<0.05），顯示出不同地區(qū)奶豆腐菌群群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。本研究進(jìn)一步在屬水平上對(duì)奶豆腐中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2 可知，奶豆腐中含有12 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（平均相對(duì)含量大于1.0%），分別為L(zhǎng)actococcus（乳球菌屬，28.52%）、Lactobacillus（乳桿菌屬，26.77%）、Streptococcus（鏈球菌屬，5.23%）、Acetobacter（醋桿菌屬，4.98%）、An?oxybacillus（無(wú)氧芽胞桿菌屬，3.57%）、Kocuria（考克氏菌屬，2.87%）、Pseudochrobactrum（假蒼白桿菌屬，2.70%）、Arthrobacter（節(jié)桿菌屬，1.93%）、Pseudomonas（假單胞菌屬，1.76%）、Acinetobacter（不動(dòng)桿菌屬，1.52%）、Rouxiella（魯希氏菌屬，1.34%）和Ralstonia（羅爾斯頓菌屬，1.18%）?？梢?jiàn)奶豆腐中的優(yōu)勢(shì)菌屬大多隸屬于乳酸菌，且以乳球菌屬和乳桿菌屬為主。在優(yōu)勢(shì)菌屬類群方面，本研究的結(jié)果與之前的報(bào)道基本一致[21]，但不同菌屬間相對(duì)含量存在明顯差異。乳酸菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中主要的微生物，不僅可以在奶豆腐發(fā)酵過(guò)程中分解乳糖產(chǎn)生乳酸，提升營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可以分解蛋白質(zhì)形成具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)，對(duì)于形成奶豆腐的特殊風(fēng)味具有重要的作用[22]。例如，乳酸乳球菌可將牛奶中的乳糖發(fā)酵形成乳酸，進(jìn)而產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰和乙醛[23]，其胞內(nèi)的肽酶和胞外蛋白酶在乳制品成熟過(guò)程中可促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，對(duì)最終產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用[24]。此外，相關(guān)報(bào)道顯示，乳桿菌屬中的植物乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生一系列抑菌物質(zhì)如抗菌肽、雙乙酰、過(guò)氧化氫等[25]，這對(duì)于提高機(jī)體免疫力和抑制病原菌具有積極的作用。

圖2 不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度

2.2 不同地區(qū)奶豆腐細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)α和β多樣性分析

α多樣性常用來(lái)評(píng)估樣本中微生物的多樣性情況，其常用的評(píng)估指標(biāo)包括物種多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)）和物種豐富度指數(shù)（發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和Chao1 指數(shù)）。本研究為探究不同地區(qū)奶豆腐微生物多樣性的整體差異，對(duì)4 種不同的α多樣性指數(shù)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同地區(qū)奶豆腐中微生物α多樣性的比較分析

由圖3 可知，錫林郭勒地區(qū)奶豆腐中微生物在香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)上均略高于塔城地區(qū)奶豆腐，但所有α多樣性指數(shù)差異均不顯著（P>0.05）?？梢?jiàn)，塔城和錫林郭勒地區(qū)奶豆腐中微生物的多樣性和豐富度均無(wú)顯著性差異。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)不同地區(qū)奶豆腐中微生物群落的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4（a）可知，在以前兩個(gè)主成分繪圖時(shí)，采集自錫林郭勒的奶豆腐樣品分布較為集中，而塔城的奶豆腐樣品在圖中分布較為分散，同時(shí)兩個(gè)地區(qū)的樣品存在一定的交疊。由圖4（b）可知，錫林郭勒和塔城奶豆腐沿第一主成分方向具有完全分離的趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，兩個(gè)地區(qū)的奶豆腐樣品在高豐度的菌群組成方面具有一定相似性，但是低豐度的菌群組成存在較大差異。同時(shí)，隸屬于塔城的奶豆腐菌群群落結(jié)構(gòu)差異大于錫林格勒地區(qū)奶豆腐，這為將來(lái)從中分離和收集乳酸菌菌株資源提供了寶貴的原材料。之前有研究發(fā)現(xiàn)奶豆腐中的微生物主要來(lái)源于環(huán)境[21]，塔城位于歐亞大陸腹地，屬于溫帶干旱和氣候[26]，而錫林郭勒為高原草場(chǎng)，屬北溫帶大陸性氣侯[27]。兩者在氣候上的差異會(huì)可能會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中的微生物存在明顯的不同[28]，這可能是導(dǎo)致奶豆腐中微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異的最主要的原因之一。除此之外，不同牧民家庭在制作奶豆腐時(shí)擠壓乳酪以分離乳清時(shí)所采用的力度可能不同，使得原始奶豆腐中的水分含量存在較大差異。由于塔城地區(qū)的氣候更為干燥，乳酪中原始的水分含量對(duì)最終奶豆腐產(chǎn)品中菌群組成影響更為顯著，導(dǎo)致該地區(qū)奶豆腐制品中菌群群落結(jié)構(gòu)差異更大。

圖4 基于加權(quán)（a）和非加權(quán)（b）UniFrac距離的主坐標(biāo)分析

2.3 不同地區(qū)奶豆腐中差異菌屬的甄別

為了進(jìn)一步甄別導(dǎo)致兩個(gè)地區(qū)奶豆腐中微生物群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵細(xì)菌屬，本研究以不同采樣地作為分組依據(jù)，以優(yōu)勢(shì)菌屬為響應(yīng)變量進(jìn)行了RDA 分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5 可知，僅有乳球菌屬和鏈球菌屬共計(jì)2 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬與RDA 排序軸上的奶豆腐樣本具有良好的賦值相關(guān)性?？梢?jiàn)乳球菌屬和鏈球菌屬是造成兩地奶豆腐微生物群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵細(xì)菌類群，其中乳球菌屬在錫林郭勒奶豆腐中的相對(duì)含量較高，鏈球菌屬在塔城奶豆腐中的相對(duì)含量較高。Li 等人使用乳酸乳球菌進(jìn)行奶制品發(fā)酵時(shí)能提升酸奶中3-甲基丁醛和3-甲基-2-丁酮等揮發(fā)性香味物質(zhì)的含量，對(duì)于提升酸奶風(fēng)味品質(zhì)具有重要的作用[29]；而嗜熱鏈球菌作為酸奶發(fā)酵常用的發(fā)酵劑之一，其在與保加利亞乳桿菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵酸奶時(shí)，對(duì)于奶制品品質(zhì)的形成具有重要的作用[30]。此外，本研究對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬在兩地奶豆腐中的差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如6所示。

圖5 RDA雙序圖

由圖6 可知，12 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中有5 個(gè)菌屬在兩地奶豆腐中存在顯著性差異。其中乳球菌屬在錫林郭勒奶豆腐中的相對(duì)含量顯著高于塔城奶豆腐（P<0.05），與RDA 結(jié)果一致。而假蒼白桿菌屬（Pseudo?chrobactrum）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Aci?netobacter）和羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）在塔城奶豆腐中的相對(duì)含量顯著高于錫林郭勒奶豆腐（P<0.05）。乳球菌屬的生長(zhǎng)與周圍環(huán)境中水分活度之間存在密切聯(lián)系，Bassit[31]等人的研究發(fā)現(xiàn)，水分活度的降低會(huì)顯著抑制乳酸乳球菌乳酸亞種diacetylactis 變種（Lactococ?cus lactis subsp.lactis var.diacetylactis，原名為Streptococcus diacetylactis）的生長(zhǎng)。由于塔城身居歐亞大陸內(nèi)部，導(dǎo)致該地區(qū)氣候較錫林郭勒地區(qū)更為干燥，這可能是乳球菌屬在錫林郭勒奶豆腐中的相對(duì)含量顯著高于塔城奶豆腐的原因之一。同時(shí)，不同地區(qū)奶豆腐中菌群群落結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)一步引起各地奶豆腐不同的產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)。

圖6 不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢(shì)菌屬的差異分析

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)采自塔城和錫林郭勒地區(qū)奶豆腐中的微生物多樣性進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢(shì)菌屬的種類相似，但一些優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)含量及低豐度物種組成存在較大差異。不同地區(qū)奶豆腐中存在大量的乳酸菌類群，且主要以Lactococcus（乳球菌屬）、Lactobacillus（乳桿菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）為主，乳球菌屬和乳桿菌屬是造成塔城和錫林郭勒菌群結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵菌屬，上述兩個(gè)菌屬可以作為后續(xù)評(píng)估不同地區(qū)奶豆腐品質(zhì)差異的重點(diǎn)關(guān)注菌屬。