西藏林芝3種市售牦牛奶渣的細(xì)菌多樣性研究

楊林，龔小曼，池福敏，辜雪冬，張昊，張哲

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

0 引言

牦牛奶是一種營養(yǎng)豐富、品質(zhì)優(yōu)良的特色奶源，被稱為“天然濃縮乳”，是藏族同胞聚居地區(qū)的人們重要的食品和乳制品加工原料，奶渣、酸奶、酥油、干酪等便是其常見的加工制品，其中，奶渣是一種發(fā)酵乳制品，含有豐富的微生物資源[1-4]。常見對牦牛奶渣及其它發(fā)酵乳制品中微生物資源的研究報道，但偏向?qū)ζ渲袃?yōu)良乳酸菌、酵母菌的篩選分離及其生理功能特性的研究。如萬金敏等人以西藏牦牛奶渣對象，對奶渣中優(yōu)勢乳酸菌的產(chǎn)胞外多糖及其耐受性進行了探討[5]；張曉旭則以西部牧區(qū)酸馬奶和奶渣為對象，對其中的優(yōu)勢酵母菌進行分離篩選，探討了其應(yīng)用特性[6]；楊俊俊也以牦牛奶渣為對象，對其中的乳酸菌、酵母菌進行了研究、鑒定、篩選[7]；肖秋穎等則以川西高原發(fā)酵牦牛乳為對象，分離篩選降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌，并得到了降解能力極強的菌株[8]。然而，對市場銷售的各種有著地區(qū)差異的牦牛奶渣的細(xì)菌菌群多樣性還鮮有報道。

本研究以西藏林芝市場銷售的3 種不同形式的牦牛奶渣為研究對象，采用Illumina HiSeq 高通量測序檢測技術(shù)，提取牦牛奶渣中微生物宏基因組DNA，對16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)域[9]進行特異性擴增、高通量測序，研究牦牛奶渣中細(xì)菌的組成及豐度，分析牦牛奶渣中細(xì)菌群落的多樣性，以便全面認(rèn)識牦牛奶渣的價值，也為進一步開發(fā)、利用西藏特色發(fā)酵乳制品中的微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 牦牛奶渣樣品的采集

本研究所采用的樣品均購自西藏林芝市巴宜區(qū)，3 組供試奶渣樣品分別來自3 個不同的市售攤點，每組樣品采用無菌包裝取樣3 份后在無菌操作環(huán)境下混勻，小心轉(zhuǎn)至無菌離心管中，按照要求分別編號為M01、M02、M03后置于冰箱（-20 ℃）中保存[10]。

圖1 3種市售奶渣外觀圖

1.2 主要實驗試劑

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒，Life 公司；2×Taq Master Mix，Vazyme 公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，Transgen公司。

1.3 實驗設(shè)備

Pico-21 型臺式離心機，Thermo Fisher 公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源，北京市六一儀器廠；DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司；Q32866Qubit?3.0 熒光計，Invitro?gen公司；T100TM Thermal Cyeler PCR儀，BIO-RAD公司；Research plus 0.5～10μL移液器，Eppendorf公司。

1.4 實驗方法

所有奶渣樣品進行DNA 提取和高通量測序。

1.4.1 DNA 提取及純度鑒定

參照OMEG 公司的E.Z.N.ATMMag-Bind 土壤基因組提取試劑盒提取奶渣樣品中DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對抽提后的基因組DNA 進行檢測。

1.4.2 16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)域特異性擴增及高通量測序

使用Qubit 2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量供試奶渣樣品DNA，以純化的DNA 為模板，采用通用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GAC?TACHVGGGTATCTAATCC）擴增目的片段16S rD?NA V3～V4區(qū)。

PCR 擴增反應(yīng)體系：5 μL10× PCR buffer，0.1 mmol/LdNTP，10 ngGenomic DNA，0.5 μmol/L341F，0.5 μmol/L805R，0.05U Plantium Taq，ddH2O 補充至50 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計5 個循環(huán)；然后再94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計20個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳后，使用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒回收DNA。再使用Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量回收的DNA，1∶1 的等量混合后，利用Illumina HiSeq 平臺進行測序。

重大突破出現(xiàn)了：他的團隊在一個極小的模糊熱團塊中探測到了熱斑（或者說“耀斑”）存在的證據(jù)，這直接標(biāo)明了那個疑似黑洞天體的位置。一個重達(dá)400萬個太陽質(zhì)量的黑洞應(yīng)該有一張“嘴”（或者說“視界”），其直徑大約是1 600萬英里 ——實在是太小了，小到地球上的“引力”干涉儀都無法將其分辨出來。

1.4.3 生物信息學(xué)分析

使用QIIME（version1.8.0）軟件中的UCLUST 對Tags 在相似度為97%水平下聚類、獲得OTU[11]。根據(jù)OTU 的序列組成得到種屬地位，并進行分類學(xué)分析，同時利用Alpha 多樣性指數(shù)分析、Beta 多樣性指數(shù)分析等評價微生物群落的豐度和多樣性，挖掘樣品間的差異。

2 結(jié)果及分析

2.1 OTU 聚類分析

3 個樣品測序共產(chǎn)生238 280 對Reeds，對其進行雙端Reeds拼接、過濾后，每個樣品至少產(chǎn)生42 912 條Clean tags，平均產(chǎn)生74 702 條Clean tags，進一步將得到的優(yōu)化序列聚類，劃分OTU 數(shù)。樣本間OTU 數(shù)組成的相似性及其重疊情況見圖2。由圖可知，樣品M01 中OTU 總數(shù)目為190，其中獨有的OTU 數(shù)為6；樣品M02 中OTU 總數(shù)為81，其中獨有的OTU 數(shù)為3；樣品M03 中OTU 總數(shù)為226，其中獨有的OTU 數(shù)為37，M01 和M02、M01 和M03、M02 和M03 分別共有的OTU 數(shù)為73、184、78，3 組樣品中共有的OTU 數(shù)為73。經(jīng)過分析，樣品M03 中細(xì)菌的種類比另外兩種更豐富，且樣品M03與樣品M01中共有微生物數(shù)目較多。聚類的OTU 數(shù)表現(xiàn)出一定的差異性，在數(shù)量上表現(xiàn)為樣品M03>樣品M01>樣品M02。

圖2 3種市售奶渣OTU Venn圖

2.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

3種市售奶渣的物種多樣性指數(shù)見表1和圖3。

表1 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

樣本在不同測序數(shù)量時的生物物種信息見圖3a。由圖3a 可知，其斜率在0～10 000 的測序數(shù)量范圍內(nèi)逐漸上升，后趨勢平緩，進入平臺期，說明測序量再增加，而OTU 種類不會再隨著增長，表明樣品中絕大多數(shù)的微生物信息在使用研究中的測序數(shù)據(jù)量情況下已經(jīng)能夠被充分反映。

圖3 3種市售奶渣物種信息圖

驗證測序數(shù)據(jù)量反映樣品物種多樣性結(jié)果見圖3b。從圖中可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測序范圍在0～20 000，曲線隨著測序條數(shù)增加出現(xiàn)了急劇上升的趨勢，這表明有大量物種在群落中被發(fā)現(xiàn)。從各樣品該曲線的斜率來看，M03>M01>M02，說明各物種的多樣性為M03＞M01＞M02。隨著測序數(shù)量的進一步增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，但未進入平臺期，說明再增加測序數(shù)量也只會產(chǎn)生少量新的OTUs。結(jié)合表1 種牦牛奶渣樣品M01、M02、M03 在Alpha 多樣性分析中的Simp?son 指數(shù)結(jié)果0.1985、0.8475、0.036，Chao1 指數(shù)213、108、226，Coverage 指數(shù)0.9997、0.9993、1.0，表明測序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

不同物種的分布規(guī)律見圖3c。由圖3c 可知，M01 樣品的曲線比其他樣品的曲線更平坦且在橫坐標(biāo)上長度越寬，說明M03 中的微生物組成更豐富、分布更均一，其次是M01、M02。

2.3 物種注釋及分類學(xué)分析

表2 樣品各等級Tags統(tǒng)計表

表3 樣品各等級物種統(tǒng)計表

由表2 可知，在門、科、屬水平上，M01、M02、M03物種tags 數(shù)均分別為83731、2694、83299。由表3 可知，在門水平上，物種組成分析共獲得15 個門，在科水平上，物種組成分析共獲得89 個科，在屬水平上，物種組成分析共獲得156 個屬。其中樣品M01、樣品M03物種類型豐富且相似，樣品M02物種較少。

3 種不同牦牛奶渣樣品中不同門水平下物種分布見圖4。由圖4a 可知，樣品M01 中厚壁菌門（Fir?micutes）豐度最大，占細(xì)菌群落52.47%；其次是變形桿菌門（Proteobacteria），為38.38%，未識別的菌群占比6.87%，其他檢測出來的菌種含量極低。樣品M02 中變形桿菌門（Proteobacteria）為可檢測出來菌群中豐度最大的菌種，占比5.38%；厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）含量極低，檢測出未識別的菌群占比93.3%。樣品M03 中，變形菌門Proteobacteria 為其優(yōu)勢菌種，細(xì)菌含量占比55.91%，其次是厚壁菌門（Firmicutes），占比26.74%。M03 樣品可檢測出的菌種相較另外兩種而言，含量與種類均更豐富多樣。

牦牛奶渣樣品中細(xì)菌群落在科分類水平的分布情況見圖4b。由圖4b 可知，樣品M01 中乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）豐度最大，在細(xì)菌群落中占比49.18%，為其優(yōu)勢菌種，其次是醋菌科（Acetobactera?ceae），占比27.12%，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）占比分別為2.11%、2.33%，檢測出未識別的菌群占比6.87%，Others 菌群占比5.7%。樣品M02 中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）有一定豐度，占比3.12%，為其優(yōu)勢菌種，Others 菌群占比0.88%，但其檢出卻未識別的菌群占比最大，為93.30%。樣品M03 中，細(xì)菌群落豐富且均有一定豐度，其中，乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）豐度最大，在細(xì)菌群落中占比13.42%，其次為假單胞菌科（Pseudo?monadaceae），占比10.00%，所檢出的其他微生物均有一定豐度，為2.76%～8.47%，除此之外，Others 菌群占比26.24%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出M01、M02 樣品，檢測出未識別的菌群僅有0.57%，少于M01、M02樣品。

牦牛奶渣樣品中細(xì)菌群落在屬分類水平的分布情況見圖4c。由圖4c 可知，樣品M01 中乳酸菌屬（Lactobacillus）豐度最高，細(xì)菌群落占比49.18%，其次是醋酸桿菌屬（Acetobacter）占比27.12%，Others 菌群占比9.85%，檢測出未識別的菌群占比6.87%。樣品M02 中所檢測出來的微生物豐度極小，占比0.03%～0.99%；M02 中Others 菌群占比3.70%，檢測出未識別的菌群占比極大，為93.30%。樣品M03 中，乳酸菌屬（Lactoba?cillus）豐度最大，為13.42%，其次為假單胞菌屬（Pseudo?monas），占比10.00%，所檢測出來的其他微生物有一定豐度，為2.70%～8.02%，Others 菌群占比極大，為34.27%，檢測出未識別的菌群占比較低，為0.57%。其變化規(guī)律與科分類水平相似。

圖4 不同水平下物種分布柱狀圖

綜上所述，在門水平上，3 種牦牛奶渣中樣品M01中厚壁菌門（Firmicutes）豐度最大，其次是變形桿菌門（Proteobacteria），樣品M02、M03 中變形桿菌門（Pro?teobacteria）為優(yōu)勢菌種；在科水平上，樣品M01、M03中乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）豐度最大，樣品M02中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為其優(yōu)勢菌種。在屬水平上，樣品M01、M03 中優(yōu)勢菌群都是乳酸菌屬（Lactobacillus），與萬金敏[12]、南志強[13]、劉潔潔[14]等眾多研究發(fā)酵乳制品中優(yōu)勢菌群的學(xué)者的研究結(jié)果一致，但樣品M02 中無顯著的優(yōu)勢菌群。三水平下的細(xì)菌群落分布均說明M03 樣品可檢測出的菌種相較另外兩種而言，含量與種類均更豐富多樣，而樣品M02 中極大部分微生物是檢出未識別狀態(tài)。分析由于其自然環(huán)境、地理位置的不同，各個地區(qū)制備傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品所采用的牦牛奶、加工工藝等方面也存在差異[15]。因此，造成不同地區(qū)牦牛奶渣制品中微生物結(jié)構(gòu)、物種組成與含量存在一定差異。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序法，對林芝市售3 種牦牛奶渣中的細(xì)菌多樣性進行分析，共獲得有效序列224 106 條，OTU 數(shù)為235；對不同市售牦牛奶渣產(chǎn)品中細(xì)菌群落組成的分析發(fā)現(xiàn)，牦牛奶渣樣品中細(xì)菌門有15 種，厚壁菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteo?bacteria）豐度最高；細(xì)菌科有89 種，乳酸桿菌科（Lac?tobacillaceae）的豐度最高；細(xì)菌屬有156 種，乳酸菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）為優(yōu)勢菌屬。另外，細(xì)菌群落豐富度和多樣性高低、分布均勻性上來說，M03樣品＞M01樣品＞M02樣品。