MALDI-TOF MS與16S rDNA方法對(duì)乳酸菌鑒定分析比較

宋丹靚敏，陳晴，周夢(mèng)瑤，張佳欣，程莎莎，方如雪，姜毓君，滿朝新

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

0 引言

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)，是檢測(cè)和鑒定多肽、蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力工具[1]，目前已被用于微生物檢測(cè)，其具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高和樣品處理速度快等特點(diǎn)。由于微生物核糖體蛋白和外周蛋白具有特異性，其主要為遺傳因素控制，培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分等外部因素對(duì)其影響較小，通過(guò)基質(zhì)輔助電離微生物蛋白質(zhì)，可測(cè)得蛋白質(zhì)和多肽的分子質(zhì)量，形成獨(dú)特的蛋白質(zhì)片段組指紋圖，通過(guò)特征性模式峰積累計(jì)算，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的鑒定[2]。

目前，乳酸菌作為國(guó)內(nèi)外常用的益生菌，在我國(guó)衛(wèi)生部2010 年4 月公布的《可用于食品的菌種名單》中，包括6 種雙歧桿菌、14 種乳桿菌、1 種鏈球菌，均屬于乳酸菌[3]。由此可見(jiàn)乳酸菌有著十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但由于其屬種較多，為更好的對(duì)其分類(lèi)，使用快速、可靠的分類(lèi)鑒定方法顯得尤為重要[4]。但傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力不適于大量乳酸菌的分類(lèi)鑒定，然而隨著分子技術(shù)的發(fā)展，一些方法如16S rDNA 序列分析[5]、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）[6]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）[7]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）[8]等已用于乳酸菌分類(lèi)鑒定。而16S rDNA 基因具有高度保守性，因此難以區(qū)分具有較高遺傳相似性的菌株，不能系統(tǒng)地研究其遺傳變異及進(jìn)化歷程相關(guān)情況，故該方法更適用于屬內(nèi)物種之間的區(qū)分鑒別[9]。同時(shí)，該些方法，需要對(duì)于微生物DNA 提取并擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，導(dǎo)致其操作條件要求嚴(yán)格、花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)以及費(fèi)用較高的問(wèn)題，極大限制了鑒定時(shí)效性，無(wú)法滿足當(dāng)今對(duì)于乳酸菌快速、廉價(jià)及高通量的鑒定要求。本研究以實(shí)驗(yàn)室所保藏以及由發(fā)酵乳制品中分離得到的15 株乳酸菌為研究對(duì)象，使用MALDI-TOF MS 以及16S rDNA 方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)該兩種方法的系統(tǒng)歸類(lèi)學(xué)結(jié)果分析比較，以此評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS方法用于乳酸菌鑒定及分類(lèi)的準(zhǔn)確程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

本試驗(yàn)研究所使用15 株乳酸菌菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)工程實(shí)驗(yàn)室提供。其中12 株菌株分離自?xún)?nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，3 株參考菌株Lactoba?cillus casei ATCC 393，Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469，Lactobacillus plantarum ATCC 14917，均購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑與儀器

MRS培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，BioTeKe公司；三氟乙酸、無(wú)水乙醇購(gòu)于津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、乙腈、甲酸購(gòu)于融智生物科技（青島）有限公司；MasterMix購(gòu)于日本TaKaRa公司。

BCN1360 型生物潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Eppendorf 5810R 型低溫冷凍離心機(jī)，上海艾研生物科技有限公司；DH-101 型恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；HH-s6 型電熱恒溫水浴鍋，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；MAL?DI-TOF MS 基質(zhì)輔助激光解吸收電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，融智生物科技（青島）有限公司；Veriti 96-Well型PCR 擴(kuò)增儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一儀器廠；Cheimdox XRS型凝膠成像儀，美國(guó)Bio.Rad 公司；BioDrop 型超微量蛋白核酸分析儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇與培養(yǎng)

將受試菌株按5 %接種量，接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，復(fù)蘇后接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，于MRS 平板培養(yǎng)基中三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，將第二代純化單菌落分別用于MAL?DI-TOF MS鑒定檢測(cè)及16S rRNA 測(cè)序分析。

1.2.2 MALDI-TOF MS樣品前處理

使用1 μL 接種環(huán)挑取純化后劃線所得單個(gè)菌落，將微生物菌落涂在靶點(diǎn)中央位置，并攤涂均勻，形成薄層，使用移液器滴加2 μL 甲酸-乙腈溶液，待其自然晾干后，滴加1.5 μL CHCA 溶液，自然干燥備用。

1.2.3 MALDI-TOF MS采集條件

激光能量：5 uJ；激光頻率：5 000 Hz；檢測(cè)器電壓：-0.56 kV；聚焦質(zhì)量（Focus Mass）：10 000 u。

1.2.4 MALDI-TOF MS鑒定及分析

將采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入QuanID DB 數(shù)據(jù)庫(kù)與標(biāo)準(zhǔn)菌株的圖譜進(jìn)行比較，通過(guò)對(duì)比質(zhì)荷比和特征峰得到微生物的鑒定結(jié)果；根據(jù)所收集得到的微生物蛋白質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)，使用Cluster 3.0 軟件中的聚類(lèi)分析程序，對(duì)該15 株乳酸菌進(jìn)行聚類(lèi)分析，分析結(jié)果使用Tree?View 3軟件制作樹(shù)狀圖及熱圖。

1.2.5 乳酸菌16S rDNA 擴(kuò)增

在1.5 mL 離心管中加入300 μL 已培養(yǎng)完成的乳酸菌，12 000 r/min離心5 min收集菌體，使用DNA快速抽提試劑盒提取的各菌株DNA，將提取后的菌株DNA 使用超微量蛋白核酸分析儀測(cè)定濃度。將所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為27F（5-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3），反向引物為1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板5 μL、ddH2O 27 μL、Taq PCR Master mix 16 μL，總體積50 μL。PCR 擴(kuò)增步驟：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。待擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取2 μL 的PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若PCR 成功則在1 500 bp左右可見(jiàn)清晰的條帶。

1.2.6 16S rDNA 測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將得到的序列使用DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接及校準(zhǔn)，將結(jié)果與NCBI 上GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行BLAST（Basic Lo?cal Alignment Search Tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性比對(duì)分析。運(yùn)用MEGA 5.0軟件，選取鄰接法進(jìn)行序列分析，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[10]。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌DNA 提取及16S rDNA 擴(kuò)增結(jié)果

使用超微量核酸蛋白分析儀對(duì)所提取的實(shí)驗(yàn)室所提供的15 株乳酸菌菌株DNA 濃度進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定濃度均在1.9 μg/mL 左右，達(dá)到要求PCR 擴(kuò)增濃度要求。經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，使用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，15 株乳酸菌菌株擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示，從圖中可看出，在約1 500 bp 處可見(jiàn)清晰明亮的條帶，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，表明擴(kuò)增成功[11]。

圖1 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 MALDI-TOF MS與16S rDNA 鑒定結(jié)果比較

本研究所選用的15 株乳酸菌MALDI-TOF MS與16S DNA 鑒定結(jié)果比較列于表1。MALDI-TOF MS 對(duì)微生物鑒定為蛋白水平，對(duì)微生物的質(zhì)譜前處理目的為促進(jìn)微生物細(xì)胞破碎，使核糖體蛋白質(zhì)析出。同時(shí)，由于微生物細(xì)胞破碎，胞內(nèi)所含的糖類(lèi)和脂類(lèi)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物亦會(huì)溶出，該些物質(zhì)分子量低于3 000，其譜峰多為雜質(zhì)峰，難以識(shí)別，故選用分子量在3 000～12 000的收集峰進(jìn)行識(shí)別。

由表1 可知，使用MALDI-TOF MS 方法對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室所保藏的15 株乳酸菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)QuanID DB 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定后，結(jié)果均為乳酸菌。其中乳桿菌屬微生物11 株，雙歧桿菌屬微生物4 株，由此可見(jiàn)，MALDI-TOF MS 方法的鑒定水平均可至種水平級(jí)別，可有效對(duì)未知微生物屬種名稱(chēng)進(jìn)行識(shí)別。相比較16S rDNA 方法所得的鑒定結(jié)果，雖然兩種鑒定方法鑒定的屬級(jí)別水平一致，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株均有一致的鑒定結(jié)果。但兩種鑒定方法對(duì)于種水平鑒定結(jié)果存在偏差，表現(xiàn)為MALDI-TOF MS 對(duì)鑒定結(jié)果為類(lèi)布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri），而16S rDNA 鑒定為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）；MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），而16S rDNA 鑒定結(jié)果為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

表1 15株乳酸菌MALDI-TOF MS與16S rDNA鑒定結(jié)果比較

圖2 選取MALDI-TOF MS 與16S rDNA 兩 者結(jié)果存在差異的NM-121-1 與鑒定結(jié)果一致的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC393 質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在m/z 7185.126、7943.827、9600.611 處存在顯著性差異。而基于16S rDNA 方法區(qū)分Lactobacillus casei 與Lactobacillus paracasei通常存在誤判，需通過(guò)recA基因序列進(jìn)行輔助分析[12]。

圖2 Lactobacillus casei ATCC 393與NM-121-1質(zhì)譜圖比較

16S rDNA 作為控制核糖體蛋白生成的一段保守序列，可用作微生物區(qū)別手段[13]，是目前可信度較高，應(yīng)用較廣的傳統(tǒng)微生物鑒定手段。但在本試驗(yàn)中，種水平不一致鑒定結(jié)果的出現(xiàn)，表明使用16S rDNA 方法對(duì)于乳酸菌中親緣關(guān)系較近的菌株及其亞種的鑒定區(qū)分能力存在一定偏差，出現(xiàn)該種結(jié)果的原因可能是由于種水平菌株與亞種菌株的核酸序列中堿基差異程度較小，整體序列相似度較高，其差異程度難以區(qū)分，導(dǎo)致其分類(lèi)鑒別能力難度較高。而MAL?DI-TOF MS 方法針對(duì)于微生物細(xì)胞內(nèi)整體的核糖體蛋白進(jìn)行分析比對(duì)，再經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)性比較，在數(shù)據(jù)量及分析能力上更突顯優(yōu)勢(shì)，故可以更好地對(duì)于種水平菌株及其亞種進(jìn)行更為精確的區(qū)分。

2.3 MALDI-TOF MS系統(tǒng)發(fā)育圖譜

將通過(guò)MALDI-TOF MS 鑒定的15 株乳酸菌，使用各自全蛋白譜圖數(shù)據(jù)，按照其質(zhì)荷比及相對(duì)強(qiáng)度的相似性，進(jìn)行聚類(lèi)分析得到樹(shù)狀圖及熱圖，如圖3 所示。在圖中，15 株乳酸菌均可歸為同一個(gè)大類(lèi)，這與MALDI-TOF MS 鑒定的所有菌株均屬于乳酸菌的結(jié)果一致。同時(shí)，圖3 直觀地反映了15 株乳酸菌在蛋白水平的相關(guān)性和親緣性，其中4 株雙歧桿菌屬微生物親緣關(guān)系較近，歸為一類(lèi)；布氏乳桿菌與類(lèi)布氏乳桿菌被歸為一類(lèi)，但干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌被分為同一大類(lèi)下的兩個(gè)小類(lèi)；加氏乳桿菌及嗜酸乳桿菌與其他菌株分類(lèi)水平較遠(yuǎn)。以上結(jié)果的出現(xiàn)，表明MALDI-TOF MS 方法所得到的微生物全譜圖數(shù)據(jù)，可較好的對(duì)乳酸菌進(jìn)行聚類(lèi)分析，并可通過(guò)聚類(lèi)熱圖，在一定程度上明確不同種屬水平菌株差異蛋白的所在，為進(jìn)一步探討菌株間的差異提供基礎(chǔ)。

圖3 15株乳酸菌的MALDI-TOF MS聚類(lèi)分析圖

2.4 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

16S rDNA 鄰近連接方法系統(tǒng)發(fā)育歸類(lèi)如圖4 所示。該圖反映了15 株乳酸菌在16S rDNA 水平下的親緣關(guān)系與位置。雙歧桿菌屬4 株菌與乳桿菌屬11株菌被分為兩個(gè)大類(lèi)。其中，布氏乳桿菌與類(lèi)布氏乳桿菌相對(duì)偏差較小，被分為1 個(gè)分支；干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌雖有一定偏差，亦被分為1 個(gè)分支；羅伊氏乳桿菌與其他乳桿菌差異較大，與其他乳桿菌分為2個(gè)分支。對(duì)比MALDI-TOF MS 聚類(lèi)分析熱圖與16S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，兩者均可較好的將雙歧桿菌屬微生物及乳桿菌屬微生物進(jìn)行分類(lèi)；但MAL?DI-TOF MS 聚類(lèi)熱圖中顯示干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌的分類(lèi)距離較遠(yuǎn)，表明使用MALDI-TOF MS 所得蛋白譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析可有效區(qū)分，這與MALDI-TOF MS 與16S rDNA 對(duì)干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌的鑒定結(jié)果一致，表明MALDI-TOF MS 可有效區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌株及其亞種，而16S rD?NA 方法對(duì)于種水平菌株及其亞種區(qū)分有一定缺陷。

圖4 15株乳酸菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

總體看來(lái)，在兩種分類(lèi)學(xué)方法計(jì)算下，15株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及MALDI-TOF MS聚類(lèi)熱圖存在一定差異，不同種屬水平微生物的分之地位及下級(jí)分支有所不同。表明兩種分類(lèi)學(xué)方法對(duì)于乳酸菌相關(guān)分析有一定差異存在，但均適用于乳酸菌的親緣關(guān)系分析。

3 結(jié)論

MALDI-TOF MS 作為一種新興的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，有著高通量、高靈敏度、低成本等優(yōu)點(diǎn)，其前處理方法簡(jiǎn)便，鑒定結(jié)果獲取時(shí)效快的特點(diǎn)，使得該技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物鑒定之中。其鑒定水平較高，可至微生物種屬的水平。相比于16S rDNA 方法，MAL?DI-TOF MS 基于微生物外周蛋白和核糖體蛋白的差異對(duì)于不同種屬水平微生物進(jìn)行鑒別，僅需將固體培養(yǎng)基中單菌落涂抹至靶板，經(jīng)前處理操作后即可得出結(jié)果，省略了純化及DNA 提取的步驟，極大縮短了微生物鑒定的時(shí)間，以乳酸菌為例，可提前約12～18 h 得出鑒定結(jié)果。對(duì)于基因型相近的乳酸菌，如干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌，相比于16S rDNA 方法，MAL?DI-TOF MS 基于細(xì)菌表達(dá)的蛋白指紋進(jìn)行鑒定，可顯示出更精確的區(qū)分。雖然MALDI-TOF MS 方法對(duì)于微生物鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率較高，但其蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)峰歸類(lèi)法與16S rDNA 所用的基因?qū)W方法對(duì)于乳酸菌歸類(lèi)仍有差異。整體說(shuō)來(lái)，MALDI-TOF MS 可作為一種快速、簡(jiǎn)便、高效率的微生物鑒定技術(shù)，應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域之中。