煙草種質(zhì)資源抗馬鈴薯Y 病毒病基因型鑒定

林世鋒，王仁剛*，任學良，李尊強，元野，龍明錦，張吉順，王自力

1 貴州省煙草科學研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081；

2 中國煙草總公司黑龍江省煙草公司牡丹江煙草科學研究所，哈爾濱市道里區(qū)哈藥路17號 150076

由馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）引起的煙草PVY 病毒病是影響煙草生產(chǎn)的主要病害之一。實踐證明，選育和種植抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟有效的措施[1]。抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘、研究和利用是煙草抗PVY 育種的重要基礎(chǔ)。已知煙草PVY 的抗源分為兩大類，一類是以VAM（TI1406）及其衍生種質(zhì)TN86 為代表的隱性基因位點（VAM和va）控制的抗性[2-3]，另一類是以非洲煙草（Nicotiana africana）為代表的對PVY 免疫的抗性[4]。目前，受va位點控制的抗源被廣泛應用于煙草抗病育種。為了提高va位點的育種利用效率，國內(nèi)外研究者相繼開發(fā)了與va位點相關(guān)的分子標記，如Randomly Amplified Polymorphic DNA（RAPD） 和Sequence Characterized Amplified Region（SCAR）標記[5-7]。這些標記與va位點間的遺傳距離較遠，導致利用標記數(shù)據(jù)判斷抗性表型誤差較大，進而限制了這類分子標記在育種中的實際應用。

在抗性獲得的研究中，Noguchis 等[5]認為va基因型煙草植株的抗性是由于對PVY 感病的基因片段的缺失造成的。2014 年，Julio 等[8]通過更加深入的研究，進一步明確了va基因型煙草植株對PVY的抗性是由于真核翻譯起始因子4E1（eukaryotic translation initiation factor 4E1，elF4E1）基因的缺失造成的，即eIF4E1基因為煙草隱性抗PVY 基因（感病基因）。2015 年，劉勇等[9]根據(jù)煙草eIF4E1基因及其家族基因的序列信息，開發(fā)出一個與eIF4E1野生型等位基因緊密連鎖的顯性標記，隨后利用該標記進行分子標記輔助選擇育成抗PVY 新品種云煙301[10]，但由于該標記不能作為eIF4E1等位基因缺失的共顯性標記，降低了其在實際育種中的應用價值和意義。2018 年，Dluge 等[11]利用RNA 測序的方法比較了VAM基因型、va基因型和野生型三種煙草中的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)在具有PVY 抗性的VAM和va基因型煙草中，真核翻譯起始因子eIF4E1基因所在的染色體區(qū)段發(fā)生大范圍的缺失，由于建立eIF4E1等位基因缺失的共顯性標記需要了解該基因缺失連接片段的序列特點，而eIF4E1基因及其側(cè)翼序列的大范圍缺失，造成研究者未能有效地克隆到該基因的缺失連接片段、獲得序列信息，從而未能開發(fā)出等位基因缺失的共顯性標記。

作物種質(zhì)資源中蘊含著大量優(yōu)異等位基因，如何鑒定并將這些變異應用于作物遺傳改良是種質(zhì)資源研究的中心任務之一[12]。先前研究結(jié)果表明, 在煙草種質(zhì)中存在一定數(shù)量的PVY 抗性資源，但有關(guān)種質(zhì)資源基因型，特別是有關(guān)煙草eIF4E1優(yōu)異等位基因及其特異分子標記的研究報道甚少[13-15]。本研究目的是鑒定收集到的900 多份來自國內(nèi)外的煙草種質(zhì)資源的PVY 抗性表型，并通過抗性基因等位性測驗和RTPCR 擴增測序相結(jié)合的方法，分析篩選出的抗源材料所攜帶的eIF4E1基因的基因型，以期為后續(xù)煙草PVY 抗性優(yōu)異等位基因的發(fā)掘和育種利用提供基礎(chǔ)材料和信息支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試種質(zhì)由貴州省煙草科學研究院提供，其中包括PVY 抗病對照煙草品種TN90 和感病對照煙草品種K326。以TN90 和K326 作母本與研究中篩選到的PVY 抗病資源作父本進行雜交獲得F1 代雜交種材料，用于抗病資源中PVY 抗性基因的等位性檢測。

1.2 PVY 人工接種

以普遍發(fā)生的脈壞死株系（PVYN）為接種毒源，由貴州省煙草科學研究院品種選育三室分離和保存?？筆VY 測試采用常規(guī)汁液摩擦接種法[16]。

1.3 煙草基因組DNA 的提取

采用AxyPrep 基因組DNA 小量制備試劑盒（Axygen）提取煙草基因組DNA，并通過紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測基因組DNA 的提取質(zhì)量。

1.4 煙草RNA 提取和cDNA 合成

采用Invitrogen 公司的Trizol 試劑盒提取總RNA。cDNA 第一鏈的合成按照TaKaRa 公司的PrimeScriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行。

1.5 煙草eIF4E1 基因的特異分子標記檢測

根據(jù)文獻報道合成eIF4E1野生型等位基因的5’端顯性分子標記引物[9]、開陽小黑煙和福泉柳葉煙eIF4E1突變型等位基因的共顯性分子標記引物[17-18]及內(nèi)參基因NR（硝酸還原酶基因）的特異性引物[19]，同時設(shè)計合成eIF4E1野生型等位基因的3’端顯性分子標記引物（表1），對篩選到的PVY 抗病資源中的eIF4E1基因進行PCR 擴增試驗。

1.6 煙草eIF4E1 基因的全長cDNA 擴增

根據(jù)文獻[20]合成eIF4E1基因全長序列擴增引物（表1），以各自煙草cDNA 為模板擴增eIF4E1基因全長cDNA 序列。PCR 擴增體系：TaKaRa LA Taq 酶0.25 μL，10×LA Taq Bufer Ⅱ2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，加入ddH2O 補平至25 μL。PCR 擴增程序：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min（30個循環(huán)），最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物電泳檢測，送上海生工公司進行基因測序。

表1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 抗性表型鑒定

從900 多份種質(zhì)資源中，通過苗期盆栽人工接種PVY 抗性鑒定，獲得抗PVY 資源開陽小黑煙、半坤村曬煙等19 份（表2）。抗PVY 資源大部分屬于我國地方性曬煙及黃花煙品種。

表2 抗PVY 的煙草種質(zhì)資源信息Tab. 2 The information of the tobacco germplasm resource with resistance to PVY

2.2 與TN90 抗病位點的等位性檢測

已知白肋煙品種TN90 對PVY 的抗性是由隱性基因位點（va）控制的，具體而言是由煙草PVY 感病基因eIF4E1缺失造成的[11,21]。為檢測抗PVY 資源與TN90 對PVY 抗性間的等位性關(guān)系，利用抗PVY資源與TN90 及感病品種K326 配制抗抗及抗感雜交組合，各選取60 個F1代單株，通過人工摩擦接種法進行鑒定。結(jié)果顯示，19 份抗PVY 資源與TN90 配制抗抗組合的F1代單株均表現(xiàn)為抗病，而19 份抗PVY 資源與K326 配制抗感組合的F1代單株均表現(xiàn)為感病。上述結(jié)果表明，篩選到的19 份抗PVY 資源與TN90 的PVY 抗病基因間具有等位性，即推斷19份抗PVY 資源的PVY 抗性均是由感病基因eIF4E1缺失造成的。

2.3 eIF4E1 基因的特異分子標記檢測

近年來研究發(fā)現(xiàn)煙草抗PVY 材料的eIF4E1基因可發(fā)生數(shù)種不同形式的突變，包括最為常見的基因全序列缺失突變[11]，及單堿基插入和大片段缺失突變等[18,20]；相繼開發(fā)了不同的分子標記，包括煙草eIF4E1野生型等位基因5’端顯性分子標記[9]、開陽小黑煙eIF4E1突變型等位基因共顯性分子標記[17]和福泉柳葉煙eIF4E1突變型等位基因共顯性分子標記[18]，這些分子標記的相對位置如圖1 所示?？紤]到上述分子標記的檢測范圍未能涵蓋煙草eIF4E1基因3’端，本研究另外在煙草eIF4E1基因3’端設(shè)計了煙草eIF4E1野生型等位基因3’端顯性分子標記（圖1）。接著本研究利用4 種分子標記引物對19 份抗PVY 資源和1 份感PVY 資源進行PCR 擴增試驗，結(jié)果顯示，4 種分子標記將20 份資源區(qū)分為4 個標記基因型（圖2）。標記基因型A 包括開陽小黑煙、壩林曬煙、光柄柳葉（木）、一朵花、勐海鄉(xiāng)曬煙（二）、盤縣大柳葉和冊亨威旁土煙共7 份抗病資源。標記基因型B 包括半坤村曬煙和K326，其中半坤村曬煙表型鑒定為抗PVY，K326 表型鑒定為感PVY。標記基因型C 只包括抗PVY 資源福泉柳葉煙，已知福泉柳葉煙eIF4E1基因3’端發(fā)生大片段缺失（部分缺失）[18]。標記基因型D 包括普安付耳煙（3）、C151、NC55、TN86、Havana 10、Criodllo Salteno 11、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、茄子煙、建平大蘭花煙共10 份抗病資源，利用4 種分子標記引物擴增均未產(chǎn)生任何條帶，初步推測這10 份抗病資源eIF4E1基因發(fā)生了完全缺失。

圖1 煙草eIF4E1 基因的4 種分子標記在基因組上的相對位置示意圖Fig. 1 Relative positions of four molecular markers of tobacco eIF4E1 gene in the genome

圖2 抗PVY 煙草種質(zhì)資源中eIF4E1 基因的分子標記檢測Fig. 2 Molecular marker detection of eIF4E1 gene in tobacco germplasm resources resistant to PVY

2.4 eIF4E1 基因的RT-PCR 擴增及序列分析

應用RT-PCR 技術(shù)對19 份抗PVY 資源的eIF4E1基因進行RT-PCR 擴增和序列測定，結(jié)果顯示，在福泉柳葉煙、普安付耳煙（3）、C151、NC55、TN86、Havana 10、Criodllo Salteno 11、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、茄子煙和建平大蘭花煙等11 份種質(zhì)資源中未能擴增出eIF4E1基因的全長cDNA 序列（圖3），已知在福泉柳葉煙中eIF4E1基因發(fā)生3’端大片段缺失（該種突變型等位基因被命名為eIF4E1.F），結(jié)合eIF4E1基因的特異分子標記檢測結(jié)果，推測其他10 份種質(zhì)資源中eIF4E1基因發(fā)生了完全缺失；在開陽小黑煙、壩林曬煙、光柄柳葉（木）、一朵花、勐海鄉(xiāng)曬煙（二）、盤縣大柳葉和冊亨威旁土煙等7份種質(zhì)資源中均能擴增出兩個大小不同的條帶（圖3），進一步測序顯示eIF4E1基因在這些資源中存在兩種剪接模式（圖4），其原因在于eIF4E1基因1號外顯子3’端發(fā)生單一堿基（T）插入突變影響到部分前體RNA 內(nèi)含子1 的正確剪接（GT-AG 法則），導致下游2 號外顯子發(fā)生跳躍缺失突變，考慮到此種突變型等位基因最初在開陽小黑煙中被發(fā)現(xiàn)，故將其命名為eIF4E1.K[20]；與上述eIF4E1基因突變類型不同，在半坤村曬煙中可以擴增出與感病品種K326 一樣的單一條帶（圖3），測序結(jié)果顯示，半坤村曬煙的eIF4E1基因編碼區(qū)（CDS）第149 位堿基處存在一個等位基因突變，即由G 突變?yōu)镃（圖4），從而導致相應編碼的蛋白質(zhì)第50 位氨基酸殘基由色氨酸（W）突變?yōu)榻z氨酸（S），為將半坤村曬煙中發(fā)現(xiàn)的eIF4E1突變型等位基因與其他突變型等位基因區(qū)分開來，我們將半坤村曬煙中發(fā)現(xiàn)的eIF4E1突變型等位基因命名為eIF4E1.B。

圖3 煙草eIF4E1 基因的全長cDNA 序列的PCR 擴增Fig. 3 PCR amplification of the full-length cDNA sequence of eIF4E1 gene in tobacco

圖4 煙草eIF4E1 野生型與突變型等位基因的全長cDNA 序列比對Fig. 4 Alignment of the full-length cDNA sequences of wild-type and mutant alleles of eIF4E1 in tobacco

3 討論

溫室盆栽苗期人工接種鑒定結(jié)果，19 份煙草種質(zhì)資源對PVY 表現(xiàn)為高抗，其中開陽小黑煙、壩林曬煙、半坤村曬煙、福泉柳葉煙、C151、NC55、TN86、Havana 10、Criodllo Salteno 11、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、建平大蘭花煙等12 份資源PVY 抗性在先前文獻中已有報道[9,13,15,18,20]，但除開陽小黑煙、福泉柳葉煙、C151、NC55 和TN86 等5 份種質(zhì)資源外，對其他種質(zhì)資源中PVY 感病基因eIF4E1的基因型未見報道。已知目前煙草育種利用的PVY 抗源可能全部衍生自煙草資源VAM，利用VAM 抗源及其衍生抗源育成的抗PVY 煙草品種包括白肋煙品種TN86、TN90 和烤煙品種NC744、NC55、NC102 等，但是在這些抗源及育成的抗病品種中往往圍繞著eIF4E1基因及其側(cè)翼序列的染色體區(qū)域發(fā)生了大范圍的缺失，其中涵蓋上百個基因的缺失[11]。上述染色體區(qū)域的大范圍缺失及無法獲得缺失連接片段序列信息不僅造成eIF4E1基因位點野生型和突變型共顯性分子標記難以開發(fā)，不利于隱性性狀的選擇，而且也會由于一些功能基因的缺失帶來不利的農(nóng)藝性狀。早有研究報道，VAM 基因型抗源材料的PVY 抗性存在連鎖累贅，如葉片短小、產(chǎn)量較低、缺乏葉面分泌物等[22-23]。這些連鎖累贅現(xiàn)象可能與eIF4E1基因上下游大量功能基因的缺失相關(guān)，因此即使針對這類抗源材料設(shè)計出共顯性標記用于回交育種輔助選擇或增加回交次數(shù)，也無法打破PVY 抗性定向改良帶來的連鎖累贅。

為克服或避開上述問題的困擾，本研究從鑒定煙草種質(zhì)資源抗PVY 表型和基因型入手，通過分析發(fā)現(xiàn)所有篩選到的抗病資源無一例外在eIF4E1基因位點發(fā)生了不同類型的突變，其中篩選到的曬煙和黃花煙抗病資源均是我國地方品種（又稱農(nóng)家品種），是經(jīng)過長期的自然繁衍、淘汰及人工馴化選擇的結(jié)果，不涉及人工誘變或基因修飾。盡管篩選到的所有抗病農(nóng)家品種均是由于eIF4E1基因位點發(fā)生自然突變造成的結(jié)果，還不能說明eIF4E1基因是煙草抗PVY 的唯一機制，但可能表明eIF4E1基因位點是目前進行煙草抗PVY 品種選育的最佳靶向位點，不會對其他農(nóng)藝性狀帶來負面效應或帶來的負面效應相對較小，同時利用篩選到的eIF4E1單個基因突變的抗病資源（如開陽小黑煙或半坤村曬煙）也可能消除或減小圍繞eIF4E1基因位點發(fā)生大量基因缺失突變的抗病資源（如TN90 或NC55）作為供體親本帶來的負面效應。然而，需要指出的是，近年來，國內(nèi)外學者先后在煙草上發(fā)現(xiàn)了多個能夠突破eIF4E1基因型抗性的PVY毒株[24-27]，于此同時，在煙草中發(fā)現(xiàn)了與之對應的新的隱性抗病基因eIF(iso)4E-T[28]。因此，今后如果能夠針對兩個隱性抗病基因eIF4E1和eIF(iso)4E-T進行煙草種質(zhì)資源抗PVY 優(yōu)異等位變異的挖掘和聚合育種，勢必可以創(chuàng)制出賦予煙草對絕大多數(shù)PVY 病毒株系抗性的新品種[27]。

回交育種對帶有個別不良性狀的品種改良是一種較好的育種途徑，而分子標記輔助選擇（MAS）因其對目標基因的快速準確選擇為回交育種提供了有效工具[29]。由于eIF4E1基因是隱性抗病基因，在以選擇雜合個體為目標的回交轉(zhuǎn)育過程中，以擴增eIF4E1野生型等位基因為目標的顯性分子標記不能有效識別含有eIF4E1突變型等位基因的雜合個體，仍需通過逐代測交或自交的方法鑒定基因型，不盡完美。鑒于共顯性的分子標記允許在回交轉(zhuǎn)育雜合體階段進行隱性基因的鑒定，無需進行測交或自交檢驗，節(jié)省選育時間，本研究對煙草種質(zhì)資源抗PVY 表型和基因型進行鑒定，篩選到多個新的抗病資源，并獲得了各個抗病資源eIF4E1基因突變序列信息，為建立煙草PVY 隱性抗病基因eIF4E1的共顯性分子標記提供了可能，為提高煙草PVY 抗病育種選擇效率，加快品種改良進程奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從900 多份煙草種質(zhì)資源中篩選出19 份高抗PVY 資源，其中14 份為中國煙草地方品種資源。通過抗性基因等位性測驗，初步推斷19 份抗源的PVYN抗性由隱性抗病基因eIF4E1所控制。通過序列分析，確定19 份抗源中eIF4E1基因存在4 種突變類型，包括單堿基插入、替換、基因片段部分或完全缺失。這些結(jié)果為煙草PVY 抗病育種中抗病材料的選擇提供了依據(jù)，也為煙草抗PVY 共顯性分子標記的開發(fā)和應用提供了可能，從而有利于提高育種效率，加快育種進程。