利用數(shù)字圖像分析132 份胡枝子種子表型性狀遺傳多樣性

楊正禹，陸忠杰，張茂，董瑞

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025）

胡枝子屬（Lespedeza）為豆科（Leguminosae）多年生草本、灌木或半灌木，全世界共有本屬植物100 余種，我國(guó)約65 種，在全國(guó)各地廣泛分布［1?2］。其具有蛋白質(zhì)含量高、適口性好、抗逆性及水土保持能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［3?5］，富含生物堿、黃酮、萜類、縮合單寧等醫(yī)用化學(xué)物質(zhì)，其中縮合單寧能夠促進(jìn)反芻動(dòng)物的消化［6?8］。胡枝子（L. bicolor）還是中國(guó)草種子出口量較多的優(yōu)良飼草之一，每年出口量達(dá)50～80 t［9］。其在畜牧業(yè)、醫(yī)藥及水土保持方面都得到了廣泛的應(yīng)用。

種質(zhì)資源是育種工作和物種開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，豐富的種質(zhì)資源對(duì)于物種的收集、保存及改良具有重要意義［10］。物種的表型性狀多樣性是種質(zhì)資源遺傳變異的外在表現(xiàn)，受環(huán)境及遺傳綜合作用，是最基礎(chǔ)、直接和便于掌握的生物學(xué)特性［11?13］，也是植物遺傳多樣性研究及衡量物種多樣性的重要指標(biāo)和主要內(nèi)容，能直觀反映植物多樣性［14］。前人對(duì)同一物種不同種質(zhì)性狀存在的變異進(jìn)行了廣泛深入研究，如紅砂（Reaumuria soongorica）［15］、箭筈豌豆（Vicia sativa）［16］、大豆（Glycine max）［17］、苜蓿（Medicago sativa）［18］、小麥（Triticum aestivum）［19］等。

植物種子與其他器官相比，所受的外部壓力影響更小，形態(tài)更穩(wěn)定，具有易收集、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等多種優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)對(duì)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育也有很大影響［20?22］。種子的壽命、萌發(fā)等也與種子的形態(tài)特征存在著密切的聯(lián)系［23］。因此，種子形態(tài)特征在分類學(xué)、物種遺傳變異等方面均具有重要意義，特別是在物種的鑒定和區(qū)分方面［24?25］。Apuan等［26］使用幾何形態(tài)計(jì)量學(xué)（geometric morphology，GM）工具進(jìn)行圖像分析，將雜草稻與栽培水稻（Oryza sativa）種子性狀進(jìn)行比較，確定了雜草稻與栽培稻之間的關(guān)聯(lián)和關(guān)系。童躍偉等［27］利用種子的數(shù)字圖像分析了6 個(gè)種群紅松（Pinus koraiensis）種子表型分化程度和變異規(guī)律。

本研究對(duì)132 份胡枝子屬種質(zhì)的種子形態(tài)學(xué)特征、基因型變異進(jìn)行分析，旨在對(duì)胡枝子的種子表型性狀進(jìn)行全面了解，為胡枝子遺傳改良提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為132 份胡枝子屬種質(zhì)種子（表1）。其中131 份種質(zhì)由美國(guó)國(guó)家植物種質(zhì)系統(tǒng)（National Plant Germplasm System of the United States，NPGS）提供，1 份為中國(guó)野生種。

表1 胡枝子種質(zhì)信息表Table 1 Number distribution of Lespedeza germplasm

1. 2 試驗(yàn)方法

本研究于2019 年7 月進(jìn)行，分別對(duì)L. juncea（7份）、L. cuneata（42 份）、L. capitata（51 份）、L. bicolor（10 份）4 個(gè)種及全部132 份胡枝子種質(zhì)進(jìn)行分析。共測(cè)量7 個(gè)種子性狀，分別為種子長(zhǎng)（seed length，SL）、種子寬（seed width，SW）、長(zhǎng)寬比（width to length ratio，SL/SW）、種子周長(zhǎng)（perimeter，Pe）、種子厚（seed thick，ST）、種臍長(zhǎng)（hilum length，HL）、百粒重（100-seed weight，SY）。百粒重為100 粒種子重量，其余性狀每份種質(zhì)測(cè)量30 粒種子，3 次重復(fù)。

利用掃描儀（EPSON，印度尼西亞）對(duì)每份種質(zhì)種子（每份種子30 粒，3 次重復(fù)）進(jìn)行掃描，獲得種質(zhì)的種子圖片，圖像分辨率為300 dpi，像素為1024×1024。使用WinSEEDLETM 2011 圖像分析系統(tǒng)對(duì)種子圖像進(jìn)行分析，得到種子長(zhǎng)（SL）、種子寬（SW）、長(zhǎng)寬比（SL/SW）、種子周長(zhǎng)（Pe）。使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（AIRAI SR44，精度0. 01 mm，山東青島）測(cè)量種子厚度（ST）、種臍長(zhǎng)度（HL），電子天平（Mettler Toledo-MS204S，精度0. 0000 g，瑞士）稱量種子百粒重（SY）。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析基于：1）利用方差分析來(lái)評(píng)估胡枝子種質(zhì)間各表型性狀基因型變異的顯著性和大小。2）利用模式分析，包含聚類和主成分分析（principal component analysis，PCA）［28］，以圖形方式來(lái)展現(xiàn)所有種質(zhì)各性狀數(shù)據(jù)矩陣。

在GenStat 7. 1（2003）中使用殘差最大似然（residual maximum likelihood，REML）進(jìn)行方差分量分析。隨機(jī)線性模型用于分析胡枝子種質(zhì)間及種間性狀變異。利用最佳線性無(wú)偏估計(jì)值（best linear unbiased predictors，BLUP）［29］分析，來(lái)獲得各種質(zhì)種子的性狀均值，再利用均值進(jìn)行主成分和聚類分析。其中方向向量表示各性狀之間的相關(guān)性。還進(jìn)行了以胡枝子不同種質(zhì)和種作為固定效應(yīng)的混合線性模型分析，以研究胡枝子不同種質(zhì)和種之間的性狀差異。

使用REML 分析中的基因型（σg2）和實(shí)驗(yàn)誤差（σε2）的方差分量以及nr（重復(fù)次數(shù)）估算每個(gè)種質(zhì)各性狀的平均重復(fù)性（R）［30］。用變異系數(shù)（CV）表示各性狀離散程度。

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)差，X為平均值。

各種子性狀之間的表型相關(guān)性（rp）使用SPSS 20. 0 分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 表型性狀多樣性分析

對(duì)胡枝子屬不同種的種子表型性狀分析發(fā)現(xiàn)，性狀SL、SW、ST、HL、SY、Pe 在L. bicolor中最大，分別為3. 156 mm、2. 469 mm、1. 562 mm、0. 697 mm、0. 558 g 和8. 950 mm。性狀SL、SW、SY/SW、HL、SY 和Pe 在L.cuneata中最小，分別為1. 747 mm、1. 414 mm、1. 238 mm、0. 562 mm、0. 163 g 和4. 880 mm（表2）。 表明L.bicolor的種子最大，而L. cuneata的種子最小。132 份胡枝子種質(zhì)間各性狀均存在顯著（P<0. 05）差異。在L.juncea、L. cuneata、L. capitata和L. bicolor4 個(gè)種中，除SL/SW 外，其余性狀均具有顯著（P<0. 05）差異，表明胡枝子種子表型性狀存在豐富的基因型變異。所有種質(zhì)中除SL/SW 外，其余性狀的CV 均較高，其中SY 高達(dá)61. 53%。在L. juncea、L. cuneata和L. bicolor中，SY 的CV 最高，分別為61. 95%、20. 60% 和40. 63%。上述結(jié)果表明胡枝子種間及種內(nèi)的種子表型性狀多樣性均較高。

表2 胡枝子種質(zhì)估計(jì)基因型、實(shí)驗(yàn)誤差方差分量及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)誤差評(píng)估Table 2 Estimated genotype，experimental error variance component and related standard error evaluation of Lespedeza germplasm

在132 份胡枝子種質(zhì)間，性狀SL、SW、ST、SY 和Pe 具有高的性狀平均重復(fù)性（R）值，分別為0. 983、0. 984、0. 979、0. 997 和0. 990，性狀SL/SW 和HL 具有中等R值，分別為0. 677 和0. 783。在L. juncea中，性狀ST、SY 具有高R值，分別為0. 942 和0. 999。在L. cuneata和L. capitata中，僅SY 具有高R值，分別為0. 968 和0. 985。在L. bicolor中，SL、SW、HL、SY 和Pe 具有高R值，分別為0. 965、0. 944、0. 920、0. 999 和0. 980。所有種中性狀SY均有高的R值，表明性狀SY 遺傳性穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響，可作為品種選育的重要參考性狀。

2. 2 種子形態(tài)特征模式分析及表型相關(guān)性

在132 份胡枝子的7 個(gè)性狀中（圖1），性狀ST、SW、SY、SL 和Pe 之間呈正相關(guān)（方向向量間角度<90°），且SW 與SY 呈強(qiáng)正相關(guān)。而性狀SL/SW與HL、ST 呈負(fù)相關(guān)（方向向量間角度>90°）。主成分分析顯示，主成分1 貢獻(xiàn)率為68. 85%，主成分2 貢獻(xiàn)率為15. 95%，累計(jì)達(dá)84. 80%。

圖1 132 份胡枝子種質(zhì)7 個(gè)性狀的主成分分析及聚類分析Fig. 1 Principle component analysis and cluster analysis for seven traits of 132 Lespedeza germplasm

聚類分析將132 份胡枝子種質(zhì)分為3 個(gè)組群（表3），第1 組包含63 份種質(zhì)，第2 組包含52 份種質(zhì)，第3組包含17 份種質(zhì)。性狀SL、SW、ST、SY 和Pe 在第3組中存在最大值，性狀SL/SW 在第2 組中存在最大值，7 個(gè)性狀均在第1 組中存在最小值。

表3 132 份胡枝子種質(zhì)聚類分析分組信息Table 3 Cluster analysis grouping information of 132 Lespedeza accessions

表4 中132 份胡枝子種質(zhì)各性狀間的表型相關(guān)性（rp）系數(shù)進(jìn)一步證明了圖1 中ST、SW、SY、SL 和Pe之間呈正相關(guān)，且差異極顯著（P<0. 01）。正rp的最小值在SL/SW 與SY 間，為0. 058。 最大值在SL 與Pe 間，為0. 991。

表4 132 份胡枝子種質(zhì)各性狀間表型相關(guān)性系數(shù)Table 4 Phenotypic（rp）correlation coefficients among traits based on the 132 Lespedeza accessions

在L. juncea中（圖2），性狀ST 與HL，Pe 與SL 均呈強(qiáng)正相關(guān)。SY 與ST、HL 呈正相關(guān)（方向向量間角度<90°）。性狀SW 與SL/SW，SL/SW 與Pe、SL 均呈負(fù)相關(guān)（方向向量間角度>90°）。主成分分析顯示，主成分1 貢獻(xiàn)率為43. 25%，主成分2 貢獻(xiàn)率為36. 57%，累計(jì)達(dá)79. 82%。

對(duì)L. juncea進(jìn)行聚類分析，可將其分為2 個(gè)組群（表5）。第1 組包含3 個(gè)種質(zhì)，第2 組包含4 個(gè)種質(zhì)。第1 組各性狀均值除ST 外，其余均大于第2 組。

表5 L. juncea 聚類分析分組信息Table 5 Cluster analysis grouping information of L. juncea

相關(guān)性系數(shù)（rp）進(jìn)一步驗(yàn)證了圖2 所示的性狀Pe與SL，ST 與HL，SW 與Pe 均在顯著（P<0. 05）水平下呈正相關(guān)（表6）。正rp的最小值在SW 與SY 間，為0. 082，最大值在SL 與Pe 間，為0. 871。

表6 7 份L. juncea 種質(zhì)各性狀之間的表型相關(guān)性系數(shù)Table 6 Phenotypic（rp）correlation coefficients among traits based on the 7 L. juncea accessions

圖2 L. juncea 7 個(gè)性狀主成分分析及聚類分析Fig. 2 Principle component analysis and cluster analysis for seven traits of L. juncea

在L. cuneata中（圖3），性狀HL 與SL/SW，ST與SY 間均呈強(qiáng)正相關(guān)（方向向量間角度<90°），而性狀SW 與HL、SL/SW、SY、ST 呈負(fù)相關(guān)。主成分分析結(jié)果顯示，主成分1 貢獻(xiàn)率為42. 94%，主成分2 貢獻(xiàn)率為23. 69%，累計(jì)達(dá)66. 63%。

圖3 L. cuneata 7 個(gè)性狀的主成分分析及聚類分析Fig. 3 Principle component analysis and cluster analysis for seven traits of L. cuneata

聚類分析將42 份L. cuneata分為2 個(gè)組群（表7），第1 組包含23 個(gè)種質(zhì)，第2 組包含19 個(gè)種質(zhì)。由性狀均值可看出，第2 組除性狀SY 外，其余各性狀均值均大于第1 組。

表7 L. cuneata 聚類分析信息Table 7 Cluster analysis grouping information of L. cuneata

L. cuneata各性狀間表型（rp）相關(guān)性系數(shù)進(jìn)一步證明了性狀ST 與SY、HL 與SL/SW 均在極顯著（P<0. 05）水平下呈正相關(guān)（表8）。性狀Pe 與SL、ST 之間也存在極顯著（P<0. 01）正相關(guān)。HL 與SL/SW 間rp最大，為0. 893，最小rp在HL 與ST 之間，為0. 002。

表8 42 份L. cuneata 種質(zhì)各性狀之間的表型相關(guān)性系數(shù)Table 8 Phenotypic（rp）correlation coefficients among traits based on the 42 L. cuneata accessions

在L. capitata中（圖4），性狀SY 與SW 呈強(qiáng)正相關(guān)（方向向量間角度<90°），HL 與SY、SW 間呈正相關(guān)。性狀ST 與SY、SW、HL 呈負(fù)相關(guān)（方向向量間角度>90°）。主成分分析顯示，主成分1 貢獻(xiàn)率為43. 98%，主成分2貢獻(xiàn)率為23. 63%，累計(jì)達(dá)67. 61%。

圖4 L. capitata 7 個(gè)性狀的主成分分析及聚類分析Fig. 4 Principle component analysis and cluster analysis for seven traits of L. capitata

聚類分析將51 份L. capitata分為2 個(gè)組群（表9）。第1 組包含28 份種質(zhì)，第2 組包含23 份種質(zhì)。性狀HL 與SY 在2 個(gè)組群中的均值相等，第1 組除性狀SL/SW 外，其余性狀均值均小于第2 組。

表9 L. capitata 聚類分析信息Table 9 Cluster analysis grouping information of L. capitata

L. capitata各性狀之間的表型（rp）相關(guān)性系數(shù)進(jìn)一步證明了SY 與SW 在極顯著（P<0. 05）水平下正相關(guān)（表10）。 性狀SL 與SW、SL/SW、Pe，SW 與HL、SY，SL/SW 與Pe，ST 與Pe 間均存在極顯著（P<0. 01）正相關(guān)。 性狀SW 與ST 在極顯著（P<0. 01）水平下呈負(fù)相關(guān)。正rp最小值在SL/SW 與SY之間，為0. 050，最大值在SY 與SW 之間，為0. 945。

表10 51 份L. capitata 種質(zhì)各性狀之間的表型相關(guān)性系數(shù)Table 10 Phenotypic（rp）correlation coefficients among traits based on the 51 L. capitata accessions

在L. bicolor中（圖5），性狀SL、SL/SW、Pe、ST 和HL 之間呈正相關(guān)（方向向量間角度<90°）。性狀SY 與SW、SL/SW 呈負(fù)相關(guān)（方向向量間角度>90°）。主成分分析顯示，主成分1 貢獻(xiàn)率為60. 53%，主成分2 貢獻(xiàn)率為19. 80%，累計(jì)達(dá)80. 33%。

圖5 L. bicolor 7 個(gè)性狀的主成分分析及聚類分析Fig. 5 Principle component analysis and cluster analysis for seven traits of L. bicolor

聚類分析將10 份L. bicolor分為2 個(gè)組群（表11）。第1 組包含4 份種質(zhì)，第2 組包含6 份種質(zhì)。兩個(gè)組群的各性狀均值除HL 相等外，其余性狀均值第2組均大于第1 組。

表11 L. bicolor 聚類分析信息Table 11 Cluster analysis grouping information of L. bicolor

L. bicolor各性狀之間的表型（rp）相關(guān)性系數(shù)進(jìn)一步證明了性狀Pe 與ST、SL，SL 與ST 在極顯著（P<0. 01）水平下呈正相關(guān)，SL/SW 與HL、SL 與SW 在顯著（P<0. 05）水平下呈正相關(guān)（表12）。正rp的最小值在SL 與SY之間，為0. 049，最大值在SL 與Pe 之間，為0. 997。

表12 10 份L. bicolor 種質(zhì)各性狀之間的表型相關(guān)性系數(shù)Table 12 Phenotypic（rp）correlation coefficients among traits based on the 10 L. bicolor accessions

3 討論

自然資源的遺傳變異是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇形成，從而獲得了相對(duì)穩(wěn)定且豐富的表型變異特征［31］。本研究對(duì)胡枝子屬132 份種質(zhì)及4 個(gè)種L. juncea、L. capitata、L. bicolor和L. cuneata的7 個(gè)種子性狀進(jìn)行分析。結(jié)果表明，除性狀SL/SW 外，其余種子性狀都存在顯著（P<0. 05）的基因型變異，這些種子性狀的基因型變異和R值表明，在各種質(zhì)內(nèi)存在潛在可用的遺傳變異。張吉宇［32］對(duì)14 個(gè)胡枝子屬野生居群植株形態(tài)特征進(jìn)行了遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)胡枝子的表型性狀豐富。Bécquer 等［33］和Ocampo 等［25］也從不同植物種子數(shù)字圖像中提取了長(zhǎng)度、寬度、周長(zhǎng)以及種子形狀等數(shù)據(jù)來(lái)分析其遺傳多樣性和物種分類。本研究中各種子表型性狀的CV 均較高（>5%）。有研究表明，性狀的CV 超過(guò)5% 可視為產(chǎn)生了較大變異［34］，而CV 越大說(shuō)明植物對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，能適應(yīng)的環(huán)境范圍也越廣［35］。本研究中132 份胡枝子種質(zhì)CV 均較高，這是由于132 份胡枝子種質(zhì)來(lái)自全球不同地區(qū)，經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的地理隔離及不同海拔和環(huán)境氣候的影響。而環(huán)境條件是種質(zhì)資源遺傳變異的主要因素之一。

根據(jù)R值可判斷各表型性狀的遺傳穩(wěn)定性。L. juncea中性狀SL、SL/SW、Pe、HL、SY 和ST 具有較高（R>0. 7）的R值；L. cuneata中性狀SW、Pe、HL、ST 和SY 具有較高的R值；L. capitata中性狀SL、SW、Pe、SY 和ST具有較高的R值；L. bicolor中性狀SL、SW、Pe、HL、SY 和ST 具有較高的R值。性狀的R值越高表明其受遺傳因素的影響越大，越不易受環(huán)境因素影響，遺傳更具穩(wěn)定性。L. bicolor各性狀的R值均高于其他種，表明L.bicolor與其他種相比遺傳更穩(wěn)定。在4 個(gè)種中，性狀SY、ST、Pe 的R值均較高（R>0. 9），相比其他性狀，其遺傳穩(wěn)定性較好，不易被環(huán)境因素所改變，能夠在后期的繁育過(guò)程中穩(wěn)定遺傳，保持優(yōu)良性狀。

種子表型相關(guān)性分析表明，性狀SL/SW 與SY、Pe 之間相關(guān)性較弱，而種子的SL/SW 主要用來(lái)描述種子的形狀，與種子的大小性狀無(wú)關(guān)，因此胡枝子種子大小與種子形狀獨(dú)立遺傳，這與對(duì)青稞（Hordeum vulgare）［36］、小麥［37］的研究結(jié)果相似。主成分分析結(jié)果表明，在132 份胡枝子種質(zhì)中，第1 主成分解釋了總變異的68. 85%，第2主成分解釋了15. 95%，累計(jì)達(dá)84. 80%，說(shuō)明這兩個(gè)主成分可反映大部分信息。第1 主成分包括SL、SW、ST、SY、Pe，第2 主成分包括HL、SL/SW。表明第1主成分主要描述種子大小，第2 主成分主要描述種子形狀。 楊生華等［38］和侯維海等［36］分別對(duì)蠶豆（Vicia faba）和青稞種子表型性狀進(jìn)行的主成分分析都表明第1 主成分涵蓋了籽粒大小信息，第2 主成分涵蓋了籽粒形狀信息。在特定環(huán)境中物種種子大小對(duì)其幼苗的建植和存活具有顯著影響。因此，植物種子性狀遺傳變異的信息可為新品種選育提供重要的數(shù)據(jù)，尤其是對(duì)種子產(chǎn)量的提高以及幼苗建植和存活情況的改良具有十分重要的意義［39］。在本研究中，胡枝子屬各種質(zhì)間和種內(nèi)種子性狀均具有顯著的（P<0. 05）基因型變異，這些性狀可用于胡枝子屬植物分類學(xué)研究。

4 結(jié)論

種子豐富的表型性狀信息對(duì)于優(yōu)良品種的選育及保存具有重要意義，且種子的大小對(duì)植物幼苗的建植和存活具有顯著影響。本研究結(jié)果表明，胡枝子種質(zhì)及種間均存在顯著的基因型變異，表明胡枝子各種質(zhì)種子遺傳多樣性豐富。性狀SY、ST 和Pe 遺傳穩(wěn)定，可作為后期品種選育的參考指標(biāo)。這不僅為胡枝子種質(zhì)資源的收集、保存提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，還有利于胡枝子改良育種工作的開(kāi)展。