胃癌發(fā)病關(guān)鍵基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其靶向治療中藥活性成分篩選研究

宋厚盼，劉恒銘，仇婧玥，馮 瑤，吳嫚婷，喻 昶，熊 萌，曾梅艷

胃癌發(fā)病關(guān)鍵基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其靶向治療中藥活性成分篩選研究

宋厚盼1, 3，劉恒銘2，仇婧玥1, 3，馮 瑤2，吳嫚婷1, 3，喻 昶1, 3，熊 萌1, 3，曾梅艷3*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208

通過生物信息學(xué)方法分析與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討其在胃癌預(yù)后中的價值，并進一步挖掘靶向治療胃癌的中藥活性成分。通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取GSE103236胃癌芯片數(shù)據(jù)，對芯片數(shù)據(jù)進行均一化處理，分析胃癌組織與正常胃組織的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）；應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫對DEGs進行基因本體論（genetic ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析；通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)；采用Cytohubba篩選關(guān)鍵基因，分析關(guān)鍵基因表達程度與患者的預(yù)后及免疫細胞浸潤的相關(guān)性；運用CTD數(shù)據(jù)庫篩選能靶向作用于關(guān)鍵DEGs的中藥活性成分。共獲得45 015個胃癌組織與正常組織的DEGs，其中顯著性DEGs 176個。它們與細胞周期過程調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）級聯(lián)調(diào)控等生物過程密切相關(guān)，集中于細胞外區(qū)域、細胞外泌體等細胞組分，主要參與胰島素樣生長因子結(jié)合、Wnt蛋白結(jié)合等細胞功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)顯著性DEGs主要參與環(huán)磷酸酰胺（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53信號級聯(lián)等信號通路。篩選出、、、、、、、、、10個關(guān)鍵基因。這些基因表達異常均與免疫細胞的大范圍浸潤存在極高的相關(guān)性，其中、、、、、6個關(guān)鍵基因的異常表達顯著影響患者的生存率。進一步挖掘出樺木酸、長春新堿、丹參酮等30個可能靶向治療胃癌的中藥活性成分。篩選出10個與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的核心基因，并分析了這些核心基因與胃癌患者預(yù)后及免疫細胞浸潤的相關(guān)性；挖掘出30個可能用于胃癌靶向治療的中藥活性成分；研究結(jié)果可為胃癌生物標(biāo)志物的篩選、胃癌的防治及預(yù)后分析提供思路和參考。

胃癌；差異表達基因；生物信息學(xué)；中藥活性成分；免疫細胞浸潤；預(yù)后分析；樺木酸；長春新堿；丹參酮

胃癌是一種在發(fā)生在胃黏膜上皮的惡性腫瘤，我國胃癌的發(fā)病率和死亡率分別占世界比例的42.6%和45.0%[1]；2019年中國胃癌新發(fā)病例約為42.4萬，全國胃癌發(fā)病率為每千人0.312 8[2]，主要集中于中西部等經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)[3]。胃癌發(fā)病初期患者較少出現(xiàn)自覺癥狀，偶見的腹脹、消化不良等癥狀極易被當(dāng)做普通胃炎進行治療。隨著病情的發(fā)展，患者開始出現(xiàn)消瘦、營養(yǎng)不良、腹痛、貧血等癥狀，到了晚期開始出現(xiàn)黑便、嘔血、體質(zhì)量急劇下降甚至“皮包骨”。手術(shù)切除是根治早期胃癌的主要醫(yī)學(xué)手段，但由于早期胃癌難以被發(fā)現(xiàn)、診斷、治療，導(dǎo)致大量患者錯過黃金治療期。胃癌在我國的發(fā)病率逐年攀升，給患者及其親屬帶來了極大的心理壓力及沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。

胃癌是多因素共同作用所導(dǎo)致的惡性腫瘤疾病，現(xiàn)普遍認(rèn)為幽門螺旋桿菌感染是誘發(fā)胃癌最主要的因素，此外還包括不良的飲食習(xí)慣、長期食用過量的腌制食品、高鹽飲食、遺傳易感性、慢性胃炎、微量元素失調(diào)等因素[4]。胃癌的主流治療手段包括手術(shù)切除、放療、化療、免疫療法、中醫(yī)藥治療，對于早期胃癌還可使用創(chuàng)傷更小的內(nèi)窺鏡切除術(shù)[4]。

生物信息學(xué)分析是通過收集大量生物學(xué)芯片數(shù)據(jù)、高通量測序數(shù)據(jù)，運用計算機算法系統(tǒng)地對其進行整合、對比、分析，從非編碼RNA、mRNA、蛋白等分子層面揭示機體與疾病的相互作用關(guān)系。本研究通過挖掘GEO數(shù)據(jù)庫中胃癌基因芯片生物學(xué)數(shù)據(jù)，從分子層面對胃癌的發(fā)生發(fā)展過程進行研究。通過分析胃癌組織與周圍正常組織之間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），對基因功能進行富集與分類，通過拓撲學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析其重要節(jié)點，尋找影響胃癌發(fā)病的關(guān)鍵基因。通過對關(guān)鍵基因的免疫細胞浸潤以及預(yù)后分析綜合判定關(guān)鍵基因的表達對患者生存的影響，并進一步發(fā)掘出可能通過靶向作用于這些關(guān)鍵基因治療胃癌的中藥活性成分。本研究旨在為胃癌的臨床診斷和治療提供新的思路和方法，為中藥抗癌新藥及其靶點的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

登錄美國國立生物信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫，以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞找到符合本研究所需的胃癌組織與周圍正常組織差異表達基因譜數(shù)據(jù)集GSE103236，下載該數(shù)據(jù)集的series matrix文件以獲取樣本信息（矩陣數(shù)據(jù)）。本數(shù)據(jù)集依托于Agilent公司的GPL4133芯片，包含19個樣本，其中10個為來源于胃癌患者的組織樣本，樣本編號為GSM2758661、GSM2758663、GSM2758665、GSM2758667、GSM2758669、GSM2758671、GSM2758673、GSM2758674、GSM2758676、GSM2758678；其余9個為胃癌組織周圍的正常組織樣本，樣本編號為GSM2758660、GSM2758662、GSM2758664、GSM2758666、GSM2758668、GSM2758670、GSM2758672、GSM2758675、GSM2758677。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃癌組織與周圍正常組織DEGs篩選 將數(shù)據(jù)集GSE103236中的所有樣本分2組，一組為胃癌組織樣本，一組為周圍正常組織。利用GEO 2R分析工具對GSE103236數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)進行比較分析，獲得胃癌的DEGs。將得到的DEGs以＜0.05，|log2FC|＞1 [FC表示差異倍數(shù)（fold change）] 為條件進行篩選，得到2991個較高相關(guān)性DEGs，以此篩選結(jié)果繪制DEGs火山圖；進一步以＜0.01，|log2FC|＞2為條件進行篩選，以獲得顯著性DEGs，以此結(jié)果繪制層次聚類熱圖。

1.2.2 胃癌組織與周圍正常組織DEGs基因本體論（genetic ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 GO富集分析包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cell components，CC）3個獨立的本體論，其通過建立一套具有動態(tài)形態(tài)的控制集解釋基因及蛋白在細胞內(nèi)所產(chǎn)生的作用，進而分析出DEGs在BP、MF、CC 3個方面的富集情況。KEGG信號通路分析是以基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息為基礎(chǔ)，預(yù)測蛋白在細胞活動中的作用，并對信號通路中的關(guān)鍵基因進行富集。Metascape（https://metascape.org/）是一個可對基因和蛋白組的生物學(xué)功能進行注解的資源庫，本研究使用Metascape網(wǎng)站對胃癌特異性DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以是否具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）作為判斷顯著性DEGs富集的信號通路、BP、MF、CC是否具有特異性的依據(jù)。

1.2.3 胃癌組織與周圍正常組織DEGs編碼蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及模塊分析 String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）可在線分析預(yù)測蛋白質(zhì)之間直接或間接相互作用關(guān)系，并可構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)。將參與GO功能富集和KEGG通路富集的顯著DEGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，進行PPI分析；構(gòu)建并下載顯著性DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，去除游離靶點后進行可視化處理及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析；節(jié)點（node）代表基因，邊（edge）代表基因之間的相互作用情況；使用Network Analyzer分析蛋白網(wǎng)絡(luò)的拓撲學(xué)特征，得到可以反映每個蛋白與其他蛋白相互作用情況以及作用程度的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 與胃癌發(fā)病相關(guān)的核心基因篩選 CytoHubba是一款Cytoscape的內(nèi)置插件，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)特征對網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點進行排序，提供了11種基于最短路徑的拓撲分析方法，包括度、邊緣穿透分量、最大鄰域分量、最大鄰域分量密度、最大集團中心度和6個中心度（瓶頸、邊緣中心度、緊密度、徑向度、中間度和應(yīng)力）。CytoHubba可以準(zhǔn)確地篩選出網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，其中最大集團中心度（maximal clique centrality，MCC）算法是已被證實的預(yù)測重要靶點較為精確的方法。通過使用MCC算法計算網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，選出排名前10的核心（hub）基因即胃癌發(fā)病過程中的關(guān)鍵基因，這些基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著極為重要的作用。

1.2.5 作用于胃癌發(fā)病過程中關(guān)鍵基因靶點的中藥活性成分分析 比較毒理基因組數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）是研究中藥活性成分與基因靶點或者人體病患之間相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，其整合了大量的基因靶點信息和化合物的生物活性數(shù)據(jù)；通過內(nèi)置于CTD數(shù)據(jù)庫的PTS網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，可迅速準(zhǔn)確地分析與靶基因相互作用的分子結(jié)構(gòu)，并進一步發(fā)掘可能與之相互作用的中藥活性成分。CTD數(shù)據(jù)庫目前已更新至2021年6月1日，共包含1568個化合物、146 689個基因、7212個疾病表型、1 812 207個化合物-基因關(guān)系、37 782個基因-疾病關(guān)系、211 974個化合物-疾病關(guān)系；通過與其他數(shù)據(jù)庫交集，可提供超過4700萬個交互作用關(guān)系。將關(guān)鍵基因?qū)胨阉骺?，檢索得到與關(guān)鍵基因相互作用的化合物，以Excel表格的形式導(dǎo)出，依據(jù)度值大小選擇其中與關(guān)鍵基因相互作用的中藥活性成分。

1.2.6 胃癌發(fā)病過程中關(guān)鍵基因表達高低與患者預(yù)后情況相關(guān)性分析 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）是一個包含各種腫瘤和癌癥基因表達譜的數(shù)據(jù)庫，其可通過對腫瘤不同階段基因表達量的高低對患者預(yù)后情況進行分析。登錄GEPIA數(shù)據(jù)庫，依次導(dǎo)入關(guān)鍵基因，將高表達與低表達的患者分為2組，選擇95%的置信區(qū)間，以是否具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）作為判斷關(guān)鍵基因與患者預(yù)后是否存在相關(guān)性的依據(jù)，探究關(guān)鍵基因表達值的高低對于胃癌患者總生存率的影響。

1.2.7 胃癌發(fā)病過程中關(guān)鍵基因表達值與免疫細胞浸潤程度相關(guān)性分析 TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個對腫瘤或癌組織芯片或高通量測序數(shù)據(jù)進行免疫細胞浸潤程度分析的數(shù)據(jù)庫，其囊括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞6種免疫細胞的浸潤數(shù)據(jù)。將關(guān)鍵DEGs導(dǎo)入，選擇關(guān)鍵基因所在的胃癌組織并選擇免疫細胞類型，獲得關(guān)鍵DEGs在胃癌組織中表達量與免疫細胞浸潤情況之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)均一化處理結(jié)果

將基因芯片GSE103236數(shù)據(jù)集映射到同一個度量體系中進行數(shù)據(jù)分析和權(quán)重比較（即標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理），繪制出每個樣本相對表達值的均一化圖（圖1）；其中橫坐標(biāo)代表數(shù)據(jù)集中各樣本的編號，縱坐標(biāo)表示樣本中基因的相對表達值（relative expression value，RLE），小提琴圖上下端點表示RLE的95%置信區(qū)間，小提琴圖中四邊形的上下邊表示RLE四分位點，四邊形的中間短線代表中位數(shù)。圖1結(jié)果顯示，19個樣本數(shù)據(jù)的中位數(shù)均位于95%的置信區(qū)間，且基本處于一條直線上，表明數(shù)據(jù)集質(zhì)量優(yōu)良、樣本數(shù)據(jù)可靠，可對胃癌組織與周圍正常組織的差異表達基因進行下一步分析。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化后GSE103236數(shù)據(jù)集各樣本基因表達值的小提琴圖

2.2 胃癌組織與周圍正常組織DEGs篩選

將GSE103236芯片中的9例正常胃組織設(shè)為空白組，10例胃癌組織設(shè)為對照組，對其數(shù)據(jù)進行分析，共獲得45 016個基因。以＜0.05且|log2（FC）|＞1作為初步篩選條件，得到2991個較高相關(guān)性的DEGs（圖2），其中1128個上調(diào)基因（紅色小點），1863個下調(diào)基因（綠色小點），通過火山圖可直觀地觀察到總體DEGs的分布情況。以＜0.01且|log2（FC）|＞2為篩選條件，獲得顯著DEGs 176個，其中77個上調(diào)基因，99個下調(diào)基因；對其進行聚類分析，繪制層次聚類熱圖（圖3）；圖中綠色小塊代表下調(diào)基因，紅色小塊代表上調(diào)基因，方塊顏色越深表示差異表達的倍數(shù)越高，其中差異表達上調(diào)倍數(shù)最大的5個基因：、、、、；差異表達下調(diào)倍數(shù)最大的5個基因：、、、；熱圖結(jié)果表明胃癌組織與周圍正常組織基因的差異表達明顯，分層和聚類情況良好。

圖2 胃癌組織與周圍正常組織DEGs火山圖

2.3 胃癌組織與正常組織顯著性DEGs GO功能富集分析

GO分析結(jié)果顯示，胃癌組織與正常組織顯著性DEGs的BP主要富集在膠原分解代謝、細胞外基質(zhì)拆卸、消化、細胞黏附、細胞遷移、上皮細胞增殖負向調(diào)控、鉀離子轉(zhuǎn)運負調(diào)控、肌酸代謝、蛋白水解、內(nèi)胚層細胞分化等方面。CC主要富集在細胞外區(qū)域、細胞外空間、質(zhì)膜外側(cè)、膠原三聚體、細胞外基質(zhì)、細胞表面、中間絲、細胞外泌體、分泌顆粒等部位。MF主要富集在絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、胰島素樣生長因子結(jié)合、細胞骨架的結(jié)構(gòu)成分、鈣離子結(jié)合、細胞因子活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合等方面。圖4展示了BP、CC和MF中?lg排名前10的富集組分。

圖3 胃癌組織與正常組織顯著性DEGs聚類熱圖

圖4 胃癌組織與正常組織顯著性DEGs的GO富集分析

2.4 胃癌組織與正常組織顯著性DEGs的KEGG通路分析

對基因芯片中的顯著性DEGs進行KEGG分析后發(fā)現(xiàn)其主要富集于20條信號通路：細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）-受體相互作用信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收信號通路、黏著斑信號通路、細胞因子與細胞因子受體相互作用信號通路、細胞周期信號通路、環(huán)磷酸酰胺（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路、胃酸分泌、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路、癌癥中央碳代謝信號通路、癌癥相關(guān)信號通路、維生素消化吸收信號通路、p53信號通路、細胞黏附分子信號通路、碳水化合物消化吸收通路、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）信號通路及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝信號通路。將結(jié)果繪制為氣泡圖（圖5），圖中縱坐標(biāo)代表通路名稱，橫坐標(biāo)代表通路富集度；氣泡顏色代表值，顏色越深提示值越??；氣泡大小代表富集通路含有基因的數(shù)量，氣泡面積越大表示該通路含有的基因數(shù)量越多。

2.5 與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的基因靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將顯著性DEGs進行擴展并生成可視化的PPI網(wǎng)絡(luò)，去除游離基因后得到由388個節(jié)點，1449條邊構(gòu)成的圓形網(wǎng)絡(luò)；其中節(jié)點代表靶基因，邊代表靶基因之間的相互作用關(guān)系。使用CytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析，采用MCC算法分析得到排名前10的hub基因：金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，）、分泌磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，）、載脂蛋白B（apolipoprotein E，）、纖維蛋白原α（fibrinogen α，）、纖維蛋白原γ（fibrinogen γ，）、富半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich61，）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor-binding protein-1，）、嗜鉻粒蛋白B（chromogranin B，）、分泌粒蛋白III（secretory granule protein III，）（圖6），拓撲學(xué)數(shù)據(jù)見表1；其中、、的度值、介數(shù)中心性、最短路徑中心3個數(shù)據(jù)均排名前3。上述10個hub基因即為與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的核心基因。

2.6 靶向作用于胃癌發(fā)病密切相關(guān)基因的中藥活性成分篩選

根據(jù)相互作用指數(shù)篩選與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的10個hub基因靶向結(jié)合的中藥活性成分，結(jié)果（表2）顯示，可靶向作用于的中藥活性化合物有辣椒素、檳榔堿、樺木酸、苦瓜堿、長春新堿；可靶向作用于的中藥活性化合物有柚皮苷、苦瓜素、穿心蓮內(nèi)酯、銀杏酸、丹參酮；可靶向作用于的中藥活性化合物有三七皂苷、植物固醇、楊桃素、茶黃素、姜黃素；可靶向作用于的中藥活性化合物有槲皮素、麻黃堿、葡萄籽原花青素；可靶向作用于的中藥活性化合物有槲皮素、茶堿；可靶向作用于的中藥活性化合物有香豆素、皂苷、雷公藤甲素；可靶向作用于的中藥活性化合物有魚藤酮；可靶向作用于的中藥活性化合物有白藜蘆醇、棕櫚酸、花青素、五味子素B；可靶向作用于的中藥活性化合物有番茄紅素、魚藤酮；可靶向作用于的中藥活性化合物有類黃酮。

圖5 胃癌組織與正常組織顯著性DEGs信號通路富集氣泡圖

圖6 與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的核心基因PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 與胃癌發(fā)病密切相關(guān)的核心基因PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)數(shù)據(jù)

表2 與胃癌發(fā)病相關(guān)Hub基因相互作用的中藥活性成分

2.7 與胃癌發(fā)病相關(guān)的核心基因?qū)膊☆A(yù)后意義的分析

通過研究關(guān)鍵基因?qū)颊哳A(yù)后的價值，發(fā)現(xiàn)、、、、、6個關(guān)鍵基因?qū)颊哳A(yù)后總生存率具有重要的影響。圖7描述了關(guān)鍵基因表達高低與患者總生存率的相關(guān)性，圖中橫坐標(biāo)代表患者生存時間，縱坐標(biāo)代表患者的總生存率，紅色線條代表基因高表達患者，藍色線條代表基因低表達患者；風(fēng)險比logrank＜0.05表示基因高表達患者的預(yù)后生存率與基因低表達者存在統(tǒng)計學(xué)差異；危害比（hazard ratios，HR）表示基因高表達患者相對于基因低表達患者發(fā)生癌癥進展或死亡的概率，如HR＝1.8說明基因高表達患者的癌癥進展或死亡風(fēng)險是基因低表達患者的1.8倍。結(jié)果顯示，、、、、、6個基因的HR值分別為1.8、1.7、1.5、2.4、1.5、1.4。

2.8 胃癌核心致病基因與免疫細胞浸潤相關(guān)性分析

通過評估胃癌相關(guān)免疫細胞的浸潤情況及分析關(guān)鍵基因表達水平的高低與不同免疫細胞（B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）浸潤程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)這10個關(guān)鍵基因的異常表達均與免疫細胞的大量浸潤有一定相關(guān)性，其中、、、、5個基因與免疫細胞的大范圍浸潤有較高的相關(guān)性。結(jié)果如圖8所示，圖中橫坐標(biāo)代表免疫細胞豐度，縱坐標(biāo)代表基因表達量，其中＜0.05表示基因的異常表達與引發(fā)免疫細胞浸潤之間存在相關(guān)性。基因?qū)Σ煌庖呒毎櫹嚓P(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表3。

圖7 胃癌組織與正常組織核心DEGs表達值高低與患者預(yù)后情況分析

3 討論

胃癌是一種發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，全世界每年大約有100萬新增病例，約有85萬人死于胃癌[5]。胃癌的發(fā)病具有地區(qū)和年齡特征，農(nóng)村高于城市，40歲以上人群發(fā)病率顯著升高[5]。胃癌發(fā)病的危險因素包括：幽門螺桿菌感染、飲食因素、吸煙、肥胖、輻射、惡性貧血等[4]；涉及的基本發(fā)病機制包括：炎癥因子浸潤、氧化應(yīng)激、細胞周期調(diào)控異常、自噬調(diào)控異常等[6]。近年來，研究者們對胃癌發(fā)病的認(rèn)識程度在不斷地加深，一系列靶向藥物陸續(xù)地被探索發(fā)掘，但目前對于胃癌靶點的發(fā)掘還不夠全面和深入，無法進行多靶點、多層次的系統(tǒng)性治療。因此，對胃癌潛在靶點的擴大研究和發(fā)掘具有重要的臨床意義。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫獲得胃癌及周圍正常組織基因芯片數(shù)據(jù)集GSE103236，對正常和胃癌組織進行DEGs分析，篩選出45 015個DEGs；其中表達差異達2倍以上的基因共有176個，包括上調(diào)基因77個和下調(diào)基因99個。對這些顯著性差異表達基因進行GO和KEGG分析，結(jié)果顯示，胃癌組織在BP、CC、MF上和正常組織細胞之間均存在巨大差異；主要表現(xiàn)在膠原分解代謝過程、細胞外基質(zhì)拆卸、膠原原纖維組織合成等生物學(xué)過程；差異的細胞組分包括細胞外區(qū)域、蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)、膠原三聚體等；這些BP和CC均在腫瘤細胞的遷移過程中發(fā)揮了重要作用。細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是一種位于細胞外的疏松結(jié)締組織，內(nèi)含多種生物大分子物質(zhì)如膠原蛋白、黏附因子、糖蛋白、細胞因子等，在細胞間信號傳遞、細胞間的相互作用以及調(diào)控細胞增殖、分化、遷移等功能上具有重要的生理意義[7-8]；ECM不僅為正常組織細胞的生長代謝提供了一個良好的環(huán)境，還是阻礙腫瘤細胞遷移和侵襲的天然保護屏障，一旦ECM的完整性遭到破壞，腫瘤細胞就更容易發(fā)生遷移和侵微環(huán)境，為其侵襲提供便利條件[10]。研究表明[11]，細胞外基質(zhì)蛋白1（ECM1）可直接與整合素β4（integrin beta 4，ITGB4）相互作用，激活I(lǐng)TGB4/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/糖原合成酶激酶3β信號通路，促進胃癌細胞對葡萄糖的吸收和利用，有利于胃癌細胞的增殖與遷移，因此血清ECM1含量的增高往往提示惡性腫瘤的強侵襲性以及患者預(yù)后的不佳。

圖8 胃癌與正常組織關(guān)鍵DEGs表達水平與不同免疫細胞浸潤程度關(guān)系

表3 胃癌與正常組織關(guān)鍵DEGs與免疫細胞浸潤相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析

√表示＜0.05，提示該基因與免疫細胞浸潤有較強相關(guān)性

√indicates0.05, suggesting a strong correlation between the gene and immune cell infiltration

KEGG結(jié)果顯示，胃癌顯著性DEGs主要富集于ECM-受體相互作用通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路等。PI3K/Akt通路是一條主要調(diào)控細胞凋亡、生長、分化的信號通路，在胃癌組織中過表達而參與癌組織的血管生成，促進癌細胞生長、抑制癌細胞凋亡、促進癌細胞惡性轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程[12]。研究表明[13]，通過microRNA或小分子蛋白酶阻斷PI3K/Akt信號通路激活，可減少胃癌細胞的增殖與侵襲，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。HIF-1是一種缺氧誘導(dǎo)因子，可促進微血管的生長，增強組織在低氧環(huán)境中的適應(yīng)能力，在多種腫瘤組織中表達量均顯著提高[14]，是腫瘤細胞耐受低氧環(huán)境的重要因子。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，HIF-1信號通路與PI3K/Akt信號通路存在重要的交互作用，胃癌細胞可通過PI3K/Akt信號通路上調(diào)HIF-1表達，使其在缺氧條件下的黏附和侵襲能力顯著增強。p53信號通路是最經(jīng)典的抑癌通路之一，p53轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控眾多轉(zhuǎn)錄過程及細胞程序的運行，如維持基因組穩(wěn)定性、細胞代謝、細胞凋亡、非凋亡細胞死亡、遷移/侵襲等生物過程[17]。p53可通過激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），抑制雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，mTOR）活性，誘導(dǎo)細胞自噬水平提高[18]。研究[19]還發(fā)現(xiàn)，p53過表達可顯著抑制腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移，這些都是p53有著極強抗癌作用的分子基礎(chǔ)，同時也解釋了為什么有接近一半癌癥患者體內(nèi)的p53基因位點都發(fā)生突變[17]。綜上所述，已有大量研究表明細胞外基質(zhì)信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路與胃癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，表明本研究對于胃癌發(fā)病機制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析結(jié)果可靠。

通過Cytohubba軟件的MCC算法，研究預(yù)測了與胃癌發(fā)病具有緊密關(guān)聯(lián)的10個核心靶點基因：、、、、、、、、、。運用GEPIA數(shù)據(jù)庫考察這些hub基因的預(yù)后價值發(fā)現(xiàn)，、、、、、這6個基因的異常表達與患者的總體生存率不良密切相關(guān)。TIMP1是一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制蛋白，廣泛地存在于細胞外基質(zhì)，對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲具有重要影響[20]。Huang等[21]發(fā)現(xiàn)，TIMP1在結(jié)直腸癌中的持續(xù)高表達是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)。Laitinen等[22]研究表明，血清TIMP1水平升高與胃癌患者預(yù)后不佳顯著相關(guān)，高表達的TIMP1是患者預(yù)后不良的獨立指征，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。APOE與APOB屬于載脂蛋白家族，由膽固醇、磷脂、三酰甘油等組分構(gòu)成，可與血脂結(jié)合以調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)代謝。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對載脂蛋白研究的深入，發(fā)現(xiàn)其與癌癥、自噬、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程密切相關(guān)。研究表明[23]，通過實時PCR技術(shù)監(jiān)測mRNA表達，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中表達量顯著增高，該基因的高表達不僅與胃癌的肌肉層、漿膜層侵襲以及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，并且會導(dǎo)致患者預(yù)后生存期縮短。研究表明[24]，APOB/APOA1值較高的患者生存時長較短，這可能與APOB高表達促進癌細胞的遷移和侵襲有關(guān)。APOB與APOE可作為許多癌癥預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物，二者的高表達會導(dǎo)致胃癌、乳腺癌、肝細胞癌、肺小細胞癌、卵巢癌患者預(yù)后不良[25]。胰島素/類胰島素生長因子（insulin/insulin like growth factor，IGF）是一類小分子生物活性肽，可促進有絲分裂，調(diào)控細胞生長，目前認(rèn)為腫瘤細胞可自分泌IGF，從而促進腫瘤的生長與惡變；IGFBP1屬于胰島素樣生長因子家族，它主要通過與IGF結(jié)合形成IGF/IGFBP1復(fù)合物而限制IGF的生物學(xué)活性，發(fā)揮負向調(diào)節(jié)的作用。目前對IGFBP1的報道較少，但對于其同家族的IGFBP3報道較多，研究發(fā)現(xiàn)[26]，結(jié)腸癌組織相比于正常組織IGFBP1水平顯著升高，而IGFBP3的表達水平顯著低于正常組織；鑒于當(dāng)前已有的對IGFBP1的研究，無法驗證其表達水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，本研究對IGFBP1D預(yù)測結(jié)果可為之后的胃癌預(yù)后研究提供一定的思路。CYR61是基質(zhì)蛋白家族中的重要因子，具有促進血管生成、促進血管內(nèi)皮新生、抑制細胞凋亡、刺激腫瘤增殖與侵襲等功能，參與了包括Wnt/β-catenin信號通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、Akt信號通路等多條信號通路，CYR61的高表達與各類癌癥新生血管的形成均有密切的關(guān)系。研究表明[27]，CYR61高表達的胃癌患者多見于更遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚期的腫瘤分期以及更頻繁的復(fù)發(fā)，將CYR61轉(zhuǎn)染到人胃腺癌細胞系中可大大增強其侵襲性。Yan等[28]運用miR-142-5p阻斷CYR61的生物學(xué)作用，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移明顯減弱，患者的預(yù)后明顯轉(zhuǎn)好，提示CYR61有望成為反映胃癌預(yù)后情況的重要指標(biāo)。FGG是纖維蛋白原的組成成分之一，主要參與組織的早期凝血和創(chuàng)傷組織細胞的遷移，在癌癥組織中，主要參與癌細胞的增殖和侵襲。研究表明[29]，F(xiàn)GG可通過EMT信號通路增強癌細胞運動性和侵襲性，導(dǎo)致腫瘤細胞的早期浸潤及術(shù)后復(fù)發(fā)，F(xiàn)GG表達水平較高的患者，預(yù)后生存期較短。本預(yù)測結(jié)果與Duan等[30]研究結(jié)果一致，認(rèn)為FGG是評定胃癌患者預(yù)后情況的生物標(biāo)志物之一。

辣椒素、樺木酸、長春新堿、柚皮苷、穿心蓮內(nèi)酯、丹參酮、三七皂苷、姜黃素、槲皮素、白藜蘆醇等中藥活性成分均可用于胃癌的防治，對提高患者的預(yù)后具有顯著的療效。辣椒素是辣椒的主要活性成分，宋文龍等[31]研究表明，辣椒素可通過凋亡相關(guān)因子及其配體途徑上調(diào)半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）、Caspase-3表達，從而促進胃癌細胞凋亡。樺木酸是來源于白樺樹皮的五環(huán)三萜類化合物，有研究表明樺木酸可通過抑制細胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）和Cyclin B1表達降低胃癌細胞的增殖能力[32]。長春新堿是從中藥長春花中提取的主要活性成分，可顯著抑制胃癌細胞增殖[33]。柚皮苷是從橙或柚的果皮中提取的黃酮類化合物，有研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷可通過增加癌細胞內(nèi)溶酶體膜的通透性誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生自噬[34]。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要活性成分，研究表明穿心蓮內(nèi)酯可抑制拓撲異構(gòu)酶IIα的活性，導(dǎo)致DNA損傷，從而誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡[35]。丹參酮是丹參的主要活性成分，丹參酮可通過加強p53介導(dǎo)的鐵死亡和下調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達抑制胃癌細胞生長[36]。三七皂苷是三七的重要活性成分，三七皂苷可通過上調(diào)p21、Caspase-3和B淋巴細胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（B lymphocytoma-2 gene associated X，Bax）蛋白表達而發(fā)揮胃黏膜保護作用及胃癌細胞的生長抑制作用[37]。姜黃素是姜科植物根莖的主要活性成分，其可通過調(diào)控多條信號通路和多種蛋白表達以抑制胃癌細胞的遷徙和轉(zhuǎn)移[38]。槲皮素是一類常見的黃酮類化合物，是許多中草藥的活性成分，它可通過抑制胃癌細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而減少胃癌細胞轉(zhuǎn)移[39]。

本研究基于生物信息學(xué)對胃癌發(fā)病機制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行了分析，對胃癌發(fā)病過程中的關(guān)鍵基因進行了預(yù)測，并對關(guān)鍵基因的預(yù)后價值及其與免疫細胞浸潤的相關(guān)性進行了探究，闡明了胃癌發(fā)病中各基因靶點之間的相互作用、參與的信號通路以及關(guān)鍵基因的預(yù)后價值，并進一步挖掘得到多種可以靶向作用于關(guān)鍵基因用于胃癌治療的中藥活性成分，本研究結(jié)果可為胃癌生物標(biāo)志物的檢測、胃癌的臨床治療及抗癌中藥活性成分的研發(fā)提供新的思路和參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Construction of regulatory network of key genes in gastric cancer and screening of active components of traditional Chinese medicine for targeted therapy

SONG Hou-pan1, 3, LIU Heng-ming2, QIU Jing-yue1, 3, FENG Yao2, WU Man-ting1, 3, YU Chang1, 3, XIONG Meng1, 3, ZENG Mei-yan3

1.Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostic Research in Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2.Faculty of Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3.Key Laboratory of TCM Heart and Lung Syndrome Differentiation & Medicated Diet and Dietotherapy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To analyze the gene regulatory network closely related to gastric cancer through bioinformatics methods, explore its value in the prognosis of gastric cancer, and further explore the active ingredients of traditional Chinese medicine for targeted therapy of gastric cancer.GSE103236 gastric cancer chip data was obtained from the GEO database, and the chip data was homogenized to analyze the differentially expressed genes (DEGs) between gastric cancer tissue and normal gastric tissue.The genetic ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways were analyzed on DEGs using the Metascape database, and DEGs protein interaction network was constructed through String database.The key genes were screened by Cytohubba, and the correlation between the expression of key genes and prognosis and infiltration of immune cells was analyzed.CTD database was used to screen active components of traditional Chinese medicine which could target the key genes.A total of 45 015 DEGs from gastric cancer and normal tissue were obtained, of which 176 were significant DEGs.These significant DEGs were closely related to cell cycle process regulation, mitogen activated protein kinases (MAPK) cascade regulation and other biological processes.They were concentrated in the extracellular werea, cellular exosomes and other cellular components, and were mainly involved in cell functions such as insulin-like growth factor binding and Wnt protein binding.The KEGG analysis found that DEGs were mainly involved in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathway, phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling pathway, cancer transcription disorder, p53 signaling cascade and other signaling pathways.Ten hub genes:,,,,,,,,,were screened out.The abnormal expression of these genes were highly correlated with the large-scale infiltration of immune cells.Among them, the abnormal expression of the six key genes of,,,,, andcould significantly affect the survival rate of patients.Thirty active ingredients of traditional Chinese medicine, such as betulinic acid, vincristine, and tanshinone, etc., that may be targeted for the treatment of gastric cancer have been further unearthed.Ten core genes that may be closely related to the pathogenesis of gastric cancer are screened out, and the correlation of these core genes with the prognosis of gastric cancer patients and immune cell infiltration are analyzed, and 30 active ingredients of traditional Chinese medicine for targeted therapy of gastric cancer are screened out.This study can provide ideas and references for the prevention and prognosis of gastric cancer.

gastric cancer; differentially expressed genes; bioinformatics; active components of traditional Chinese medicine; immune cell infiltration; prognosis analysis; betulinic acid; vincristine; tanshinone

R284

A

0253 - 2670(2021)22 - 6939 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.020

2021-06-20

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81703920）；湖湘青年科技創(chuàng)新人才項目（2021RC3101）；湖南省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（2019JJ50442）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（2020XJJJ012）；湖南省教育廳科研一般項目（19C1426）

宋厚盼（1988—），博士，副教授，主要從事中醫(yī)藥防治脾胃病和眼底病研究。Tel: (0731)88459435 E-mail: hpsong2015@126.com

通信作者：曾梅艷（1989—），講師，主要從事方劑配伍規(guī)律研究。Tel: (0731)88458206 E-mail: zengmy2018@126.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]