迷迭香酸通過AMPK/mTOR通路減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷研究

趙玉霞，陳鶯倩

迷迭香酸通過AMPK/mTOR通路減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷研究

趙玉霞，陳鶯倩

駐馬店市中心醫(yī)院 兒童康復科，河南 駐馬店 463000

探討迷迭香酸對新生大鼠缺血缺氧腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的影響，及其對單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的調控作用，初步探討其腦保護機制。取7 d齡SD新生大鼠，隨機分為對照組、模型組、迷迭香酸（300 mg/kg）組、AMPK/mTOR激動劑MT6378（10 mg/kg）組、AMPK抑制劑GSK-690693（30 mg/kg）組和迷迭香酸（300 mg/kg）＋MT6378（10 mg/kg）組，每組20只。建立HIE模型，給予相應藥物進行干預，采用TTC染色法檢測大鼠腦梗死情況；透射電鏡（TEM）觀察大鼠海馬神經元結構損傷及自噬狀況；免疫熒光法檢測大鼠海馬神經元自噬標記物微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）陽性表達；TUNEL法檢測大鼠海馬神經元凋亡率；免疫組化法檢測大鼠海馬神經元磷酸化AMPK（p-AMPK）陽性表達；Western blotting檢測大鼠海馬組織活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、mTOR及其磷酸化蛋白（p-mTOR）、Unc-51樣自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1，Ulk1）及其磷酸化蛋白（p-Ulk1）、LC3B表達。與對照組相比，模型組大鼠腦梗死嚴重，海馬神經元結構損傷及自噬空泡形成較多，細胞自噬及凋亡水平升高，AMPK/mTOR通路活化（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠腦梗死、海馬神經元結構損傷、凋亡及自噬減弱，AMPK/mTOR通路被抑制（＜0.05）；MT6378組海馬組織AMPK/mTOR通路進一步激活，大鼠腦梗死、海馬神經元結構損傷、凋亡及自噬進一步加重（＜0.05）；MT6378可逆轉迷迭香酸的上述作用（＜0.05）。迷迭香酸可能通過抑制AMPK/mTOR通路激活，降低海馬神經元自噬及凋亡進程，發(fā)揮抗HIE腦損傷作用。

迷迭香酸；缺血缺氧性腦損傷；AMPK/mTOR通路；新生大鼠；自噬；凋亡

新生兒缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）為圍產期因窒息缺氧而引起腦神經損傷性疾病[1]。HIE具有較高的致死率及致殘率，嚴重影響新生兒的生命健康[2]。尋找安全有效的藥物及治療方法，來保護HIE并促進HIE神經系統(tǒng)康復，一直是臨床研究的重點任務之一。迷迭香酸為酚酸類物質，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等多種植物中，為薄荷、丹參、迷迭香、紫蘇葉等多種藥材中的有效活性成分[3]。研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸能通過抗氧化、抗炎、抗凋亡途徑，緩解腦缺血再灌注損傷[4]。但迷迭香酸是否也能在HIE疾病過程中發(fā)揮腦保護作用尚未見報道。自噬在缺血缺氧性神經元損傷、凋亡、神經膠質活化等生理活動過程中發(fā)揮重要調控作用，并越來越受到HIE研究的重視[5]。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）可抑制下游調控因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白激活，抑制Unc-51樣自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1，Ulk1）磷酸化，來誘導自噬復合體的形成，并參與自噬調控過程[6]，且已有研究證實，AMPK在HIE大鼠腦組織中處于持續(xù)激活狀態(tài)[7-8]，提示AMPK/mTOR通路可能在HIE神經元凋亡及自噬過程中發(fā)揮重要調控作用。本研究建立HIE大鼠模型，考察迷迭香酸是否能通過AMPK/mTOR介導的自噬途徑來緩解HIE腦損傷，以期為迷迭香酸的開發(fā)及應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠120只，7 d齡，體質量10～12 g，購自福州海王福藥制藥有限公司，動物許可證號SCXK（閩）2020-0001。動物于駐馬店市中心醫(yī)院動物房常規(guī)飼養(yǎng)，動物實驗經駐馬店市中心醫(yī)院動物使用倫理委員會批準（批準號IACUC-101093），符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

迷迭香酸對照品（批號20190312003，質量分數(shù)≥98%）購自上海寶曼生物科技有限公司；AMPK抑制劑GSK-690693（批號20190419001）、AMPK/mTOR激動劑MT6378（批號20190329002）購自美國MCE公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色試劑盒（批號20190321001）購自上海瓦蘭生物科技有限公司；TUNEL染色試劑盒（批號20190227004）購自北京伊塔生物科技有限公司；DAPI染色試劑盒（批號20190225006）購自北京百奧萊博科技有限公司；微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein1light chain3，LC3B）抗體、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體、活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）抗體、mTOR抗體、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體、β-actin抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體、FITC標記的羊抗兔IgG抗體（批號分別為20190124001、20190222001、20190303002、20190403002、20190208004、20190302001、20190314005、20190204008）購自美國Abcam公司；Ulk1抗體（批號20190223002）購自武漢博歐特生物科技有限公司；磷酸化Ulk1（p-Ulk1）抗體（批號20190131001）購自上海邦景實業(yè)有限公司。

1.3 儀器

Q250型透射電鏡（TEM，美國Thermo Fisher Scientific公司）；LF200型熒光顯微鏡（廣州萊特光電技術有限公司）；JS-1070P型化學發(fā)光成像儀（上海向帆儀器有限公司）；Hettich MIKRO220型離心機（德國Hettich公司）；PowerPac HV Power Supply高電壓電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 大鼠HIE模型的建立、分組與給藥

新生SD大鼠麻醉，手術暴露左側頸主動脈并結扎縫合傷口后，放回原飼養(yǎng)環(huán)境，恢復3 h，置于常壓缺氧艙內（溫度37 ℃、濕度45%～55%、8%氧氣-92%氮氣）缺氧處理2.5 h，若大鼠出現(xiàn)左旋即為造模成功[9]，共造模成功100只，隨機分為模型組、迷迭香酸（300 mg/kg）[10]組、AMPK/mTOR激動劑MT6378（10 mg/kg）組、AMPK抑制劑GSK-690693（30 mg/kg）[11-12]組和迷迭香酸（300 mg/kg）＋MT6378（10 mg/kg）組，每組20只；另取20只大鼠，相同方法暴露左側頸主動脈，但不結扎，常規(guī)飼養(yǎng)后作為對照組。于造模成功后，各給藥組ig迷迭香酸（10 mL/kg），尾iv MT6378或GSK-690693（10 mL/kg）；對照組及模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)3d。

2.2 TTC法檢測大鼠腦梗死面積

給藥結束后，各組隨機取6只大鼠，斷頭處死，取左腦，用切片機由前往后切成厚度為5 μm的組織切片。取切片，于2% TTC溶液中室溫孵育35 min，PBS溶液洗滌、10%中性甲醛固定后，用數(shù)碼相機采集圖片，梗死部分為白色，正常為紅色，用Image J軟件分析并計算梗死面積百分比。

梗死面積百分比＝梗死部分面積/總面積

2.3 TEM觀察大鼠海馬神經元超微結構

給藥結束后，各組隨機取6只大鼠，斷頭取左腦，于冰上用解剖鏡迅速剝離取完整海馬組織，剪下組織塊（0.3 cm×0.3 cm），于2.5%戊二醛及1%鋨酸溶液中固定后，送于電鏡室鏡檢。剩余組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)透明、浸蠟、包埋后切成5 μm切片，備用。

2.4 免疫熒光法檢測大鼠海馬神經元自噬標記物表達情況

取“2.3”項下海馬組織石蠟切片，脫蠟、水化、曲拉通透化后，加入LC3B抗體（1∶400），4 ℃孵育過夜；避光加入FITC標記的羊抗兔IgG抗體（1∶200），DAPI染核、甘油封片后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Pro Plus 5.0軟件分析。

2.5 TUNEL法檢測大鼠海馬神經元凋亡

取“2.3”項下海馬組織石蠟切片，按TUNEL染色液說明書方法染色、封片后，于顯微鏡下觀察并拍照，凋亡細胞被染成棕黃色，用Image-pro plus軟件檢測凋亡細胞數(shù)目，計算細胞凋亡率。

細胞凋亡率＝凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)

2.6 免疫組化法檢測大鼠海馬組織p-AMPK表達

取“2.3”項下海馬組織石蠟切片，復溫、透化及抗原修復后，加入p-AMPK抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的羊抗兔抗體（1∶500），室溫孵育1 h，DAB顯色、蘇木精復染封片后，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image Pro Plus 5.0軟件分析。

2.7 Western blotting法檢測海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達

取剩余大鼠，斷頭處死，于冰上解剖取左半球海馬組織，加入裂解液，于冰上勻漿后提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后分別加入cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1抗體（1∶800）以及β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體（1∶1000），室溫孵育2.5 h，加入化學發(fā)光試劑顯色，采用化學發(fā)光成像儀曝光條帶并拍照，Image J軟件分析。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 迷迭香酸對HIE大鼠腦梗死面積的影響

如圖1和表1所示，與對照組相比，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加（＜0.05）；與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠腦梗死面積顯著減少（＜0.05），MT6378組腦梗死面積進一步增加（＜0.05）；與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組腦梗死面積顯著增加（＜0.05），GSK-690693組腦梗死面積差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 迷迭香酸對HIE大鼠腦梗死面積的影響

表1 迷迭香酸對HIE大鼠腦梗死面積的影響(, n =6)

與對照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05；與迷迭香酸組比較：▲＜0.05，下表同

#< 0.05control group;*< 0.05model group;▲< 0.05rosmarinic acid group, same as below tables

3.2 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元超微結構及自噬標記物表達的影響

LC3B是自噬形成的標記物，其表達高低可反映自噬通量的強弱。如圖2和表2所示，對照組大鼠海馬組織神經元結構正常，線粒體、高爾基體及內質網結構清晰，有少量溶酶體形成；LC3B在海馬神經元胞質中弱陽性表達。與對照組相比，模型組及迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬神經元胞質及胞核固縮，線粒體腫脹，高爾基體及內質網結構模糊甚至消失，泡狀自噬體及自噬溶酶體形成較多，部分自噬泡中包裹有未消化的細胞質，海馬神經元胞質中LC3B陽性染色，LC3B陽性表達顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠海馬神經元核固縮減少，線粒體腫脹緩解，自噬空泡及自噬溶酶體形成減少，LC3B陽性表達顯著減少（＜0.05）；MT6378組可見自噬空泡及自噬融酶體形成進一步增加，LC3B陽性表達進一步升高（＜0.05）。

白色箭頭：自噬小體；黑色箭頭：自噬溶酶體

表2 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元LC3B陽性表達的影響(, n = 6)

3.3 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元凋亡的影響

如圖3和表3所示，對照組海馬神經元少量細胞呈棕黃色，與對照組相比，模型組大鼠細胞染色加深，細胞凋亡率顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組細胞凋亡率顯著降低（＜0.05）；MT6378組細胞凋亡率進一步升高（＜0.05）。與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬神經元凋亡率顯著升高（＜0.05），GSK-690693組海馬神經元凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。

3.4 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元p-AMPK表達的影響

如圖4和表4所示，p-AMPK在對照組大鼠海馬神經元胞質中呈弱陽性表達。與對照組相比，模型組大鼠海馬神經元胞質中p-AMPK陽性表達升高（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠海馬神經元p-AMPK陽性表達降低（＜0.05）。與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬神經元p-AMPK陽性表達升高（＜0.05），GSK-690693組p-AMPK陽性表達差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元凋亡的影響 (×200)

表3 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元凋亡率的影響(, n = 6)

3.5 迷迭香酸對HIE大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達的影響

如圖5和表5所示，與對照組相比，模型組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B-II/I蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B-II/I蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B-II/I蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），GSK-69063組上述蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。

圖4 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元p-AMPK表達的影響(×200)

表4 迷迭香酸對HIE大鼠海馬神經元p-AMPK表達的影響(, n = 6)

4 討論

據流行病學分析，發(fā)展中國家每1000個新生兒中，有8～26個罹患HIE[2]。HIE是新生兒危害最大的常見疾病之一，目前臨床上尚無有效的治療方法[13]。新生兒腦組織對缺血缺氧最為敏感，本研究采用7日齡大鼠建立HIE模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死面積增加，海馬神經元腫脹、核固縮壞死嚴重，神經元細胞凋亡率升高，提示造模成功。大鼠ig迷迭香酸后，迷迭香酸在腦、心臟等多個臟器中均有分布[14]；姚潤心等[15]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可通過抗炎、抗氧化應激、抗凋亡途徑發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予迷迭香酸干預后，大鼠腦梗死面積下降20%，海馬神經元細胞凋亡率顯著降低，神經元腫脹及壞死明顯緩解，提示迷迭香酸可減輕HIE腦損傷及神經元凋亡癥狀，在HIE領域有潛在的應用價值。

A-對照組 B-模型組 C-迷迭香酸組 D-GSK-690693組 E-MT6378組 F-迷迭香酸＋MT6378組

表5 迷迭香酸對HIE大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達的影響(, n = 8)

細胞自噬可清除受損的細胞器，降解并再利用相關細胞器、蛋白質等維護細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、避免細胞凋亡，產生能量以避免離子失衡和細胞壞死，從而發(fā)揮神經保護作用[16]。但細胞內分子和細胞器損傷及功能損害進一步增強，自噬過度活化后，神經細胞難以通過自噬使細胞回歸正常狀態(tài)而誘導神經細胞死亡，發(fā)揮神經破壞作用[17]。自噬在HIE過程中的調控作用一直是臨床研究的熱點之一，但自噬激活在HIE過程中發(fā)揮神經保護作用，還是神經破壞作用，還一直存在爭議[5]。Li等[18]用氯喹抑制腦缺血缺氧24 h的新生10日大鼠自噬后，腦損傷加重，神經元凋亡增加，推測自噬激活在HIE過程中發(fā)揮保護作用。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)抑制HIE大鼠腦皮質神經自噬后，大鼠腦損傷及神經元凋亡減少，推測HIE過程中存在自噬過度激活，損害神經。本研究發(fā)現(xiàn)HIE大鼠海馬神經元中自噬體及自噬溶酶體形成較多，自噬標記蛋白LC3B表達升高，提示HIE大鼠海馬神經元中存在自噬激活現(xiàn)象；迷迭香酸組大鼠海馬神經元中自噬溶酶體及自噬標記蛋白表達降低，提示迷迭香酸發(fā)揮抗HIE腦損傷作用，可能與抑制自噬有關，與Wang等[19]研究結果一致。

AMPK及mTOR均可直接磷酸化Ulk1，調控自噬。研究證實，缺血缺氧條件下，腦組織糖氧消耗量增大，而腦組織糖元儲備不足，神經元能量耗竭嚴重時，AMPK激活，一方面能抑制能量消耗，刺激能量產生來降低腦部能量消耗[20]，另一方面能抑制mTOR活化，減輕Ulk1磷酸化，促進AMPK-Ulk1相互作用而激活自噬，清除受損細胞器來發(fā)揮腦保護作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織神經元胞質中p-AMPK表達升高，p-Ulk1、p-mTOR表達異常降低；MT6378進一步激活AMPK后，p-AMPK表達升高，p-Ulk1、p-mTOR表達進一步降低，大鼠死亡及腦梗死嚴重，神經元自噬及凋亡進一步加重，與容志惠等[7]報道的AMPK過度激活會促進Caspase-3蛋白表達而加重腦損傷觀點相一致，也與Wang等[19]報道的激活自噬加重HIE腦損傷觀點相一致。迷迭香酸與AMPK抑制劑GSK-690693組作用一致，p-AMPK表達降低，p-Ulk1、p-mTOR表達升高，自噬及凋亡降低，提示迷迭香酸抑制HIE海馬神經元自噬及凋亡作用，可能與抑制AMPK/mTOR通路激活有關，而MT6378可逆轉迷迭香酸的上述作用。

綜上所述，迷迭香酸可能通過抑制AMPK/mTOR通路激活，降低海馬神經元自噬及凋亡進程，發(fā)揮抗HIE腦損傷作用。但HIE海馬神經元凋亡及損傷的調控網絡復雜，涉及多種途徑多條調控機制，迷迭香酸發(fā)揮抗HIE腦損傷的其他機制還有待深入探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Rosmarinic acid attenuates hypoxic-ischemic encephalopathy in neonatal rats through AMPK/mTOR pathway

ZHAO Yu-xia, CHEN Ying-qian

Children’s Rehabilitation Department, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China

To investigate the effect of rosmarinic acid on neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy (HIE) and regulation on adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway, and preliminarily explore its brain protection mechanism.Seven-day-old SD neonatal rats were randomly divided into control group, model group, rosmarinic acid (300 mg/kg) group, AMPK/mTOR agonist MT6378 (10 mg/kg) group, AMPK inhibitor GSK-690693 (30 mg/kg) group and rosmarinic acid (300 mg/kg) + MT6378 (10 mg/kg) group, with 20 rats in each group.HIE model was established, corresponding drugs were given for intervention, TTC staining method was used to detect cerebral infarction; Transmission electron microscope (TEM) was used to observe the structure damage and autophagy of hippocampal neurons; Immunofluorescence method was used to detect the positive expression level of autophagy marker protein microtubule-associated protein 1 light chain 3B (LC3B); TUNEL method was used to detect neuronal cell apoptosis rate; Immunohistochemistry was used to detect the positive expression level of phosphorylated AMPK (p-AMPK); Western blotting was used to detect the expressions of cleaved Caspase-3, mTOR and its phosphorylated protein (p-mTOR), uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1 (Ulk1) and its phosphorylated protein (p-Ulk1), LC3B in hippocampal tissue.Compared with control group, rats in model group had severe cerebral infarction, hippocampal neuron structure damage and autophagy vacuoles were more formed, autophagy and apoptosis levels were increased, AMPK/mTOR pathway was activated (< 0.05).Compared with model group, rats in rosmarinic acid group and GSK-690693 group had cerebral infarction, hippocampal neuron structural damage and apoptosis and autophagy were weakened, and AMPK/mTOR pathway was inhibited (< 0.05); AMPK/mTOR pathway was further activated in hippocampal tissue of rats in MT6378 group, cerebral infarction, hippocampal neuron structural damage, apoptosis and autophagy were further aggravated (< 0.05); MT6378 reversed the above effects of rosmarinic acid (< 0.05).Rosmarinic acid may play an anti-HIE brain injury effect through inhibiting the activation of AMPK/mTOR pathway and reducing the autophagy and apoptosis of hippocampal neurons.

rosmarinic acid; hypoxic-ischemic encephalopathy; AMPK/mTOR pathway; neonatal rats; autophagy; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)22 - 6897 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.015

2021-06-29

趙玉霞（1983—），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事兒童康復方面研究。E-mail: zyx09871@163.com

[責任編輯 李亞楠]