王不留行炭納米類成分發(fā)現(xiàn)及其對(duì)小鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用

趙亞芳，李郁茹，陳玉民，趙玉升，羅 娟，張一凡，孔 慧，趙 琰*，屈會(huì)化

王不留行炭納米類成分發(fā)現(xiàn)及其對(duì)小鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用

趙亞芳1，李郁茹2，陳玉民1，趙玉升1，羅 娟1，張一凡1，孔 慧1，趙 琰1*，屈會(huì)化3*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029

以王不留行為碳源，從中發(fā)現(xiàn)了王不留行炭納米類成分（nano-components，VSC-NCs），并評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。利用馬弗爐高溫煅燒出王不留行炭，并從中提取分離出VSC-NCs。利用透射電子顯微鏡、紫外-可見分光光譜、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、熒光光譜、X射線光電子能譜（XPS）分析對(duì)其進(jìn)行表征鑒定。采用小鼠酒精性肝損傷模型，對(duì)肝臟進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，同時(shí)檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）的含量以及肝勻漿液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛的水平來評(píng)價(jià)VSC-NCs的保肝作用。表征分析結(jié)果顯示VSC-NCs為類球型，粒徑分布在1.20～5.10 nm，晶格間距為0.23 nm，其主要由C、N、O 3種元素組成，表面含有羰基、羥基等基團(tuán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VSC-NCs可以顯著降低酒精誘導(dǎo)的肝損傷小鼠ALT、AST、TBA和ALP含量，同時(shí)顯著提高SOD水平和降低丙二醛的水平，表明VSC-NCs可以提高機(jī)體清除氧自由基的能力，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而達(dá)到保肝作用。首次從王不留行炭中發(fā)現(xiàn)了VSC-NCs，并證實(shí)了其對(duì)酒精所造成的肝損傷有明顯保護(hù)作用，這不僅表明了VSC-NCs可以作為治療酒精性肝損傷的一種潛在藥物，也為研究中藥物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一種全新思維方式。

王不留行炭；納米類成分；酒精性肝損傷；保肝作用；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；谷草轉(zhuǎn)氨酶；堿性磷酸酶；總膽汁酸；超氧化物歧化酶；丙二醛

酒精是僅次于高血壓和吸煙造成疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，全球飲酒人群數(shù)量高達(dá)20億，其中濫用酒精超過750萬人，據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床中有4%～25%的疾病與飲酒有關(guān)[1]，長期飲酒或者短期大量飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精性肝損傷，甚者會(huì)引發(fā)脂肪肝、肝炎、肝硬化甚至肝癌[2]，嚴(yán)重威脅人們的健康。酒精性肝損傷主要是乙醇及其衍生物代謝過程中直接或間接誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎性介質(zhì)和營養(yǎng)失衡等多種因素相互作用的結(jié)果。其中一個(gè)重要原因是酒精會(huì)導(dǎo)致活性氧的增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡和免疫紊亂，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞[3-4]。治療酒精性肝損傷常規(guī)藥物如糖皮質(zhì)激素、美它多辛，有助于改善酒精中毒癥狀和行為異常，但長期使用這些藥物會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)，加快病情惡化[5]。目前臨床上尚無有效方法來阻止或者逆轉(zhuǎn)由于酒精造成的肝損害，因此開發(fā)一種安全、有效的治療藥物是很有必要的。

納米材料中的碳點(diǎn)是直徑為1～10 nm類球形納米顆粒，具有水溶性、低毒性、良好的生物相容性等優(yōu)越的性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如生物成像[6]、藥物遞送[7]、納米探針[8]等。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同前體（或制備方法不同）所制備出的碳點(diǎn)在尺寸和結(jié)構(gòu)上存在一定差異[9-11]，且同一種前體制備的碳點(diǎn)因其表面基團(tuán)的豐度不同導(dǎo)致其有不同的生物活性，包括抗癌[12]、止血[13]、抗驚厥[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、抗氧化[17]、降糖[18]等。中藥炭藥高溫炭化過程與碳點(diǎn)制備工藝有很大的相似性，不同的中藥制備前體、炮制溫度不同，提取分離出的碳點(diǎn)粒徑存在差異，可能影響生物活性，如荊芥穗碳點(diǎn)因炮制溫度的不同而止血活性強(qiáng)弱有差異[19]，不同溫度下制備的荷葉碳點(diǎn)粒徑大小、表面基團(tuán)不同對(duì)其止血作用有影響[20]。前期本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行炭藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，炭藥中有一種尺寸和元素組成類似于碳點(diǎn)的新物質(zhì)，將其命名為納米類成分（nano-components）。根據(jù)已出版文獻(xiàn)，中藥的碳點(diǎn)往往具有較好的活性，如綿馬貫眾碳點(diǎn)具有止血作用[21]、機(jī)油高溫?zé)峤馊税l(fā)合成的碳點(diǎn)具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[22]、黃柏碳點(diǎn)可以改善銀屑病樣炎癥[23]。因此，猜測(cè)納米類成分極可能是王不留行炭藥中的起效物質(zhì)基礎(chǔ)。

王不留行（VS）為石竹科麥藍(lán)菜屬植物麥藍(lán)菜(Neck.) Garcke的干燥成熟種子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血通經(jīng)、下乳消腫、利尿通淋的功效。古有“逢子必炒”的說法，且炮制方法多為清炒法，《金匱要略》記載王不留行炮制方法為“燒灰存性”，用于金瘡的治療，后世乃至現(xiàn)在卻很少用王不留行燒炭治療金瘡，而在臨床實(shí)踐以及治療肝病的專利中有關(guān)于王不留行或炒王不留行的相關(guān)應(yīng)用[24-27]，同時(shí)之前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示無論是生王不留行[28]亦或是炒王不留行均具有抗氧化活性，且炮制后活性更佳[29]，而酒精性肝損傷能夠引起機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，這一點(diǎn)已經(jīng)被大量的臨床及藥理實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。

有研究認(rèn)為“燒灰”是炭藥最早的炮制標(biāo)準(zhǔn)，“存性”是炭藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[30]，為王不留行炭用提供了依據(jù)?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，本研究從王不留行炭水溶液中發(fā)現(xiàn)并分離出新物質(zhì)，將其命名為王不留行炭納米類成分（nano-components，VSC-NCs）。利用低分辨透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）獲取其形態(tài)大小、粒徑分布及晶格間距等特征；利用紫外光譜（ultraviolet-visible spectroscopic spectra，UV-vis）、傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）與熒光光譜（fluorescence spectroscopy，F(xiàn)L）等光學(xué)方法來分析該量子點(diǎn)的光學(xué)特征、表面化學(xué)基團(tuán)信息；利用X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析獲得碳量子點(diǎn)的表面組成和元素分析。通過建立小鼠酒精性肝損傷模型觀察肝損傷生化指標(biāo)、測(cè)定肝臟抗氧化能力來評(píng)價(jià)其對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TecnaiG220透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司；JEN-1230高分辨透射電子顯微鏡（HR-TEM），日本電子光學(xué)實(shí)驗(yàn)室；CECIL紫外分光光度計(jì)，英國Cambridge公司；ESCALAB 250X射線光電子能譜分析儀（XPS），美國Thermo Fisher Scientific公司；F-4500熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；JEN-1230傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；AU-480全自動(dòng)生化分析儀，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 材料

王不留行飲片，產(chǎn)地河北，批號(hào)200502005，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)趙琰教授鑒定，為石竹科麥藍(lán)菜屬植物麥藍(lán)菜(Neck.) Garcke的干燥成熟種子，購自北京仟草中藥飲片有限公司；透析膜，截留相對(duì)分子質(zhì)量1000，購自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；無水乙醇購自北京化學(xué)試劑公司；聯(lián)苯雙酯滴丸，批號(hào)H11020980，規(guī)格1.5 mg，北京協(xié)和藥廠；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20210407）、丙二醛試劑盒（批號(hào)20210408）購自南京建成生物工程研究所；生理鹽水購自石家莊四藥有限公司；本實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠36只，體質(zhì)量為（30.0±2.0）g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證書編號(hào)SYXK（京）2020-0033。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±1）℃左右，空氣濕度55%～65%，環(huán)境安靜，動(dòng)物隨意進(jìn)食水。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 VSC-NCs的制備

稱取王不留行干燥藥材350 g，放入坩堝中，用錫箔紙密封，加蓋放入馬弗爐中燒制，馬弗爐程序升溫如下：第1階段5 min內(nèi)升溫到70 ℃，保持30 min，第2階段25 min升溫到350 ℃，保持1 h。燒制完成后，待冷卻到室溫后取出，并放入粉碎機(jī)中打成粉末。取60 g粉末，加入1800 mL去離子水，煎煮3次，每次1 h，放置室溫后，先用濾紙粗濾，再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜精濾，合并3次濾液，濃縮，然后將濃縮液透析72 h以上，直至透析膜內(nèi)的溶液顏色無明顯變化，將獲取的VSC-NCs透析液放于4 ℃保存，待用。

2.2 VSC-NCs的表征

TEM觀察VSC-NCs的外貌形態(tài)和粒徑分布，HR-TEM觀察其晶格間距和超微結(jié)構(gòu)，紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)分析VSC-NCs的光學(xué)特征；紅外分光光度計(jì)分析VSC-NCs表面的官能團(tuán)信息；XPS分析VSC-NCs中所含有元素及其配位信息。

結(jié)果表明（圖1-a）VSC-NCs形狀為類球形，在水中具有良好的分散度。（圖1-b）顯示，粒徑分布在1.20～5.10 nm，主要集中在2.50 nm左右，HR-TEM的結(jié)果（圖1-c）顯示，VSC-NCs的晶格大小分布清晰可見，晶格間距為0.23 nm。

VSC-NCs的紫外吸收光譜（圖1-d）所示，該納米類成分在200 nm左右有微弱的紫外吸收，這可能是由于π-π*躍遷所導(dǎo)致。VSC-NCs的紅外光譜（圖1-e）顯示，吸收峰分別為3439、2921、2360、1634、1033 cm?1，分析可知3439 cm?1峰可能為-O-H鍵，2921 cm?1可能為-C-H伸縮振動(dòng)峰，2360 cm?1吸收峰可能為-C≡N鍵。1634 cm?1吸收峰可能為 -C＝O鍵，1384 cm?1的強(qiáng)吸收可能為-C-N鍵，1033 cm?1的吸收可能為-C-O-C鍵伸縮振動(dòng)引起的，可以得出VSC-NCs含有羰基、羥基等官能團(tuán)。從VSC-NCs的熒光光譜圖（圖1-f）中可以看出，該納米類成分的最大激發(fā)波長在371 nm左右，最大發(fā)射波長在460 nm左右。以硫酸奎寧作為參照物，計(jì)算VSC-NCs的熒光量子產(chǎn)率為2.08%。

利用XPS進(jìn)一步研究VSC-NCs的元素組成及其配位情況。如圖2-a所示，284.94、399.67、531.8 eV處有明顯的峰，表明VSC-NCs主要由C（65.31%）、O（30.67%）和少量N（4.02%）元素組成。C1s譜帶（圖2-b）顯示，284.28、285.85、287.61 eV 3個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于C-C/C＝C、C-N、C＝O鍵[14-15,31]。O1s譜帶（圖2-c）所示，530.83、532.28 eV 2個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)于C-O、C＝O鍵[14-15]。N1s譜帶（圖2-d）顯示，399.24、399.75 eV 2個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)于C-N-C、C=N鍵[21-22]。

a-TEM b-粒徑分布 c-HR-TEM d-紫外光譜 e-紅外光譜 f-熒光光譜

a-VSC-NCs元素峰圖 b-碳 c-氧 d-氮

2.3 熒光量子產(chǎn)率（fluorescence quantum yield，F(xiàn)QY）

以硫酸奎寧[32]為參比物質(zhì)，計(jì)算VSC-NCs的FQY[33]，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的FQY為VSC-NCS的相對(duì)量子產(chǎn)率。熒光光譜掃描時(shí)激發(fā)波長（EX）與發(fā)射波長（EM）狹縫寬度均為10 nm，利用公式FQYNCs＝FQYRNCsRNCs2/(RNCsR2)進(jìn)行計(jì)算，其中表示發(fā)射光譜下的峰下面積，表示371 nm時(shí)的吸光度值，表示溶劑的折射率，NCs和R表示VSC-NCs和對(duì)照品。為了使重吸收效應(yīng)最小化，R和NCs應(yīng)該保證在0.05以下。

2.4 VSC-NCs對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用研究

2.4.1 造模及給藥 雄性昆明小鼠36只，隨機(jī)分成6組，每組6只，分別為對(duì)照組、模型組、陽性藥（聯(lián)苯雙酯滴丸，用時(shí)將滴丸研成細(xì)粉后配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的水溶液）組和VSC-NCs高、中、低劑量（5.00、2.50、1.25 mg/kg）組。高、中、低劑量組分別給予相對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的VSC-NCs，陽性藥組給予聯(lián)苯雙酯，劑量為150 mg/kg，給藥體積均為0.01 mL/g，給藥1 h后，除對(duì)照組給予去離子水外，其余各組按體質(zhì)量0.01 mL/g劑量ig 50%酒精溶液，以上所有操作每天進(jìn)行1次，連續(xù)給藥21 d后取材，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，小鼠眼眶取血后,立即摘取肝組織，放入?80 ℃冰箱備用。

2.4.2 肝臟組織病理切片觀察 小鼠處死后，取肝左葉同一部位組織塊，立即置入4%多聚甲醛中固定留待病理檢測(cè)，乙醇梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋與HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)特點(diǎn)。各組肝臟組織病理形態(tài)的結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列規(guī)則，肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞，未出現(xiàn)變形和壞死；酒精模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列紊亂，中心區(qū)域周圍有明顯大小不一的脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤；VSC-NCs中劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列較整齊，肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞、脂肪滴空泡較模型組有很大減輕；VSC-NCs高、低劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，肝細(xì)胞排列相對(duì)整齊，炎性細(xì)胞、脂肪滴空泡較模型組顯著減輕。病理切片結(jié)果表明，VSC-NCs高、中、低劑量組均可以一定程度上減輕酒精造成的肝損傷。

2.4.3 血清中生化指標(biāo)檢測(cè) 眼眶取血后，全血在室溫下靜置2 h，離心（3000 r/min、15 min），取血清，測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）的含量。VSC-NCs對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清肝功指標(biāo)的影響如表1所示，與對(duì)照組小鼠相比，酒精干預(yù)21 d后模型組小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA含量均極顯著性升高（＜0.01），表明酒精性肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功。與模型組小鼠相比，陽性藥組和VSC-NCs高、中、低劑量組能極顯著性的降低模型小鼠血清中ALT、AST、TBA水平（＜0.01）；陽性藥組和VSC-NCs高、中、低劑量組對(duì)ALP水平的降低也有一定的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05、0.01）。結(jié)果表明，VSC-NCs能夠減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷，有較好的肝保護(hù)作用，其中中劑量效果最好。

a-對(duì)照組 b-模型組 c-陽性藥組 d-高劑量 e-中劑量 f-低劑量組 →炎性細(xì)胞 →脂肪空泡

表1 VSC-NCs對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA水平的影響(, n = 6)

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，表2同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as table 2

2.4.4 抗氧化水平的研究 剪取肝組織，用0.9%氯化鈉溶液漂洗，濾紙吸干表面水分，置于10 mL的離心管中，加入9倍0.9%氯化鈉溶液（肝組織質(zhì)量與0.9%生理鹽水溶液體積比為1∶9），用勻漿機(jī)打碎，離心（3000 r/min，15 min），取上清液，按照試劑盒說明測(cè)定肝勻漿中SOD和丙二醛的含量，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

氧化應(yīng)激是酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，通過進(jìn)一步測(cè)定SOD和丙二醛的水平來評(píng)價(jià)VSC-NCs抗氧化能力。各組肝組織中SOD和丙二醛水平的比較如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中SOD的水平極顯著性降低（＜0.01），丙二醛含量極顯著性升高（＜0.01）；與模型組相比，VSC-NCs高、中、低劑量組、陽性藥組肝組織中SOD水平極顯著性升高（＜0.01），丙二醛含量極顯著性降低（＜0.01），結(jié)果表明，VSC-NCs能顯著性地提高酒精性肝損傷小鼠肝臟中SOD水平，降低丙二醛的含量，具有很好的抗氧化能力。

表2 VSC-NCs對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟中SOD和丙二醛水平的影響(,n = 6)

3 討論

王不留行作為一種傳統(tǒng)中藥，有著悠久的應(yīng)用歷史，現(xiàn)代研究主要從原始植物中所含刺桐堿、黃酮苷等小分子來解釋它的抗炎[34]、保肝[35]的生物活性?？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)銀納米粒子尺寸對(duì)抗菌活性有一定影響[36]，同時(shí)關(guān)于納米粒子尺寸、結(jié)構(gòu)對(duì)生物活性的影響也引起了業(yè)內(nèi)深入探討[37-38]，而中藥炭藥因其制備方法不同，其粒徑尺寸和官能團(tuán)的不同，也會(huì)導(dǎo)致其生物活性的多樣性，如黃柏炭制備的納米顆粒不僅可以改善銀屑病樣炎癥[23]，也可以保護(hù)尖吻蝮蛇毒導(dǎo)致的急性腎損傷[39]。

本實(shí)驗(yàn)從納米材料角度出發(fā)，首次從王不留行炭中發(fā)現(xiàn)納米類成分，通過建立酒精性肝損傷的模型來評(píng)價(jià)VSC-NCs對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，通過TEM鑒定為VSC-NCs。紫外光譜和熒光光譜結(jié)果顯示VSC-NCs有熒光現(xiàn)象，QY為2.08%，F(xiàn)T-IR和XPS顯示VSC-NCs發(fā)現(xiàn)其主要由C、O、N 3種元素組成，含有-C≡N鍵、-C=O鍵、-C-N鍵和 -C-O-C鍵，同時(shí)表面官能團(tuán)豐富，如羰基、羥基等官能團(tuán)，本研究中VSC-NCs豐富的官能團(tuán)可能有利于增加生物活性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果[40]表明酒精性肝損傷模型中動(dòng)物血清ALT、AST、ALP活性升高及TBA含量增加，病理組織分析顯示肝組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，甚至有肝細(xì)胞壞死。血清ALT、AST活性高低可以間接反映肝損傷程度，是目前最常用的肝功能生化指標(biāo)。ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞破壞、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)，血清ALT活性升高，AST活性增強(qiáng)[41-42]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的VSC-NCs干預(yù)能夠顯著降低小鼠血清ALT和AST的水平（＜0.05），推測(cè)VSC-NCs能夠減少肝細(xì)胞以及肝細(xì)胞線粒體的破壞，恢復(fù)細(xì)胞膜的通透性使血清ALT和AST含量減少，從而保護(hù)肝細(xì)胞。ALP是膽汁淤積的重要指標(biāo)，當(dāng)膽汁的生成或排出障礙時(shí)會(huì)損傷肝細(xì)胞[43]，可評(píng)估肝損傷的嚴(yán)重程度。膽汁酸濃度的升高可促進(jìn)ALP合成，無論肝內(nèi)或者肝外膽道阻滯時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致ALP含量升高[44]。TBA也是反應(yīng)肝損傷的重要指標(biāo)，且對(duì)肝損傷比較敏感。健康人TBA的含量極微，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生病變或患膽管疾病時(shí)可引起膽汁的代謝障礙，使進(jìn)入血中的膽汁酸含量顯著升高[45]，在膽汁淤積的情況下，肝臟的抗氧化能力下降，有研究表明膽汁酸可通過破壞線粒體的呼吸功能產(chǎn)生過量的活性氧直接造成肝細(xì)胞的氧化損傷[46]，而肝臟氧化應(yīng)激損傷在膽汁淤積的狀態(tài)下加重，氧化應(yīng)激損傷是肝內(nèi)膽汁淤積的重要病理損傷環(huán)節(jié)[47]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酒精誘導(dǎo)后血清中ALP和TBA的含量顯著增加，而在給藥后發(fā)現(xiàn)ALP和TBA的含量顯著降低，推測(cè)在酒精誘導(dǎo)下肝細(xì)胞受損造成肝內(nèi)膽汁淤積以致肝損傷，VSC-NCs可能通過抗氧化應(yīng)激保護(hù)肝細(xì)胞從而減輕膽汁淤積所造成的肝損傷。

肝臟是乙醇主要的代謝場(chǎng)所之一，肝細(xì)胞代謝乙醇時(shí)產(chǎn)生大量活性氧，氧化應(yīng)激水平增高，SOD的消耗增加，造成脂質(zhì)過氧化，引起肝損傷[48]。SOD活力的高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，丙二醛是生物體脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，也是終級(jí)脂質(zhì)過氧化物，能間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度，華寶玉等[5]和魏芳等[49]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過藥物治療后，肝組織中SOD水平升高、丙二醛水平降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)降低，肝損傷程度減輕。本研究給藥組小鼠SOD的活力顯著提高，而丙二醛的水平則顯著下降，說明VSC-NCs通過抗氧化應(yīng)激的作用改善肝損傷。

綜上，本研究利用高溫?zé)峤夥ǔ晒χ苽洳⒎蛛x出了VSC-NCs，而且發(fā)現(xiàn)VSC-NCs能夠通過抗氧化發(fā)揮對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用，未來可能成為一種綠色、安全的治療酒精性肝損傷的潛在藥物。本研究為中藥治療酒精性肝損傷的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥，尤其是炭藥的相關(guān)研究提供了一種全新的思維方式。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Rehm J, Mathers C, Popova S,.Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders [J]., 2009, 373(9682): 2223-2233.

[2] 張紅陽, 李雪溦, 姚雪蓮, 等.肝損傷的分子機(jī)制及其中藥藥理研究進(jìn)展 [J].中藥新藥與臨床藥理, 2016, 27(3): 448-455.

[3] 邱萍, 李相, 孔德松, 等.酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究的新進(jìn)展 [J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(2): 160-163.

[4] Albano E.Free radical mechanisms in immune reactions associated with alcoholic liver disease [J]., 2002, 32(2): 110-114.

[5] 華寶玉, 陳津, 汪永夫, 等.風(fēng)柜斗草醇提物對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用 [J].龍巖學(xué)院學(xué)報(bào), 2021, 39(2): 61-65.

[6] Zhao S, Lan M, Zhu X,.Green synthesis of bifunctional fluorescent carbon dots from garlic for cellular imaging and free radical scavenging [J]., 2015, 7(31): 17054-17060.

[7] Feng T, Ai X, An G,.Charge-convertible carbon dots for imaging-guided drug delivery with enhancedcancer therapeutic efficiency [J]., 2016, 10(4): 4410-4420.

[8] Zhang J L, Zhao X W, Xian M,.Folic acid-conjugated green luminescent carbon dots as a nanoprobe for identifying folate receptor-positive cancer cells [J]., 2018, 183: 39-47.

[9] Li Y, Bi J R, Liu S,.Presence and formation of fluorescence carbon dots in a grilled hamburger [J]., 2017, 8(7): 2558-2565.

[10] Veltri F, Alessandro F, Scarcello A,.Porous carbon materials obtained by the hydrothermal carbonization of orange juice [J]., 2020, 10(4): E655.

[11] Sahu S, Behera B, Maiti T K,.Simple one-step synthesis of highly luminescent carbon dots from orange juice: Application as excellent bio-imaging agents [J]., 2012, 48(70): 8835-8837.

[12] Vasanth K, Ilango K, MohanKumar R,.Anticancer activity ofmediated silver nanoparticles on human cervical carcinoma cells by apoptosis induction [J]., 2014, 117: 354-359.

[13] Yan X, Zhao Y, Luo J,.Hemostatic bioactivity of novel-derived carbon quantum dots [J]., 2017, 15(1): 60.

[14] Zhang M L, Cheng J J, Zhang Y,.Green synthesis of-based carbon dots attenuates chemical and thermal stimulus pain in mice [J]., 2020, 15(9): 851-869.

[15] Wang X K, Zhang Y, Kong H,.Novel mulberry silkworm cocoon-derived carbon dots and their anti-inflammatory properties [J]., 2020, 48(1): 68-76.

[16] Yang J J, Zhang X D, Ma Y H,.Carbon dot-based platform for simultaneous bacterial distinguishment and antibacterial applications [J]., 2016, 8(47): 32170-32181.

[17] Wei X J, Li L, Liu J L,.Green synthesis of fluorescent carbon dots fromfor bioimaging and antioxidant in zebrafish [J]., 2019, 11(10): 9832-9840.

[18] Sun Z W, Lu F, Cheng J J,.Hypoglycemic bioactivity of novel eco-friendly carbon dots derived from traditional Chinese medicine [J]., 2018, 14(12): 2146-2155.

[19] 張美齡.荊芥炭止血物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制的研究 [D].北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[20] 羅娟, 趙琰, 成金俊, 等.荷葉炭納米顆粒的發(fā)現(xiàn)及其止血作用的研究 [J].西北藥學(xué)雜志, 2019, 34(4): 499-504.

[21] 熊威, 趙琰, 成金俊, 等.綿馬貫眾炭中新型碳點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及其止血作用研究 [J].中草藥, 2019, 50(6): 1388-1394.

[22] 趙玉升, 侯婷婷, 趙金莉, 等.以機(jī)油為分散劑高溫?zé)峤馊税l(fā)合成新型碳點(diǎn)及其生物效應(yīng)研究 [J].中草藥, 2020, 51(14): 3663-3669.

[23] Zhang M L, Cheng J J, Hu J,.Green-based carbon dots for ameliorating imiquimod-induced psoriasis-like inflammation in mice [J]., 2021, 19(1): 105.

[24] 肖利平.治療肝炎、肝硬化、肝壞死中藥沖劑: 中國, CN1043458C [P].1999-05-26.

[25] 耿全好.一種可以修復(fù)損傷的肝細(xì)胞的藥物: 中國, CN108371702A [P].2018-08-07.

[26] 李紹華.一種治療肝炎和肝硬化的藥物組合物: 中國, CN103736022A [P].2014-04-23.

[27] 黎俊民, 李敏峰.加味榮肝湯治療慢性乙型肝炎肝纖維化50例 [J].中醫(yī)雜志, 2009, 50(9): 815-816.

[28] Yuan X H, Fu L N, Gu C B,.Microwave-assisted extraction and antioxidant activity of vaccarin from the seeds of[J]., 2014, 133: 91-98.

[29] 李翠芹, 王喆之, 張麗燕.生、炒王不留行抗氧化活性的比較研究 [J].中藥材, 2008, 31(6): 820-822.

[30] 劉曉曼.從黃柏炭止血作用及其機(jī)制研究探討“炒炭止血”與“燒灰存性” [D].北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[31] Han Y W, Chen Y, Wang N,.Magnesium doped carbon quantum dots synthesized by mechanical ball milling and displayed Fe3+sensing [J]., 2019, 34(6): 336-342.

[32] Yang L, Jiang W H, Qiu L P,.One pot synthesis of highly luminescent polyethylene glycol anchored carbon dots functionalized with a nuclear localization signal peptide for cell nucleus imaging [J]., 2015, 7(14): 6104-6113.

[33] Ding C P, Cao X, Zhang C L,.Rare earth ions enhanced near infrared fluorescence of Ag2S quantum dots for the detection of fluoride ions in living cells [J]., 2017, 9(37): 14031-14038.

[34] 蔡維維, 侯豹, 陳旭紅, 等.王不留行中刺桐堿的分離鑒定及抗炎活性研究 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2018, 30(4): 616-620.

[35] 雷月月.王不留行黃酮苷改善肝臟糖脂代謝紊亂的作用及其機(jī)制研究 [D].無錫: 江南大學(xué), 2019.

[36] Bruna T, Maldonado-Bravo F, Jara P,.Silver nanoparticles and their antibacterial applications [J]., 2021, 22(13).

[37] Yaqoob A A, Umar K, Ibrahim M N M.Silver nanoparticles: Various methods of synthesis, size affecting factors and their potential applications-a review [J]., 2020, 10(5): 1369-1378.

[38] Jo D H, Kim J H, Lee T G,.Size, surface charge, and shape determine therapeutic effects of nanoparticles on brain and retinal diseases [J]., 2015, 11(7): 1603-1611.

[39] Zhang M L, Cheng J J, Sun Z W,.Protective effects of carbon dots derived fromagainst deinagkistrodon acutus venom-induced acute kidney injury [J]., 2019, 14(1): 377.

[40] 葉木榮, 長尾由紀(jì)子, 李楚源, 等.消炎利膽片防治大鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中成藥, 2006, 28(11): 1616-1619.

[41] 谷大為, 陳志敏, 周明, 等.果蔬發(fā)酵液對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及氧化應(yīng)激機(jī)制 [J].營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2015, 37(4): 366-371.

[42] 牛佳卉, 袁靜, 張慧芳, 等.王漿酸對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用 [J].食品工業(yè)科技, 2020, 41(3): 291-296.

[43] Kosters A, Karpen S J.The role of inflammation in cholestasis: Clinical and basic aspects [J]., 2010, 30(2): 186-194.

[44] 朱維平, 張民, 李瑋.現(xiàn)代肝臟病診療學(xué) [M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社, 2010.

[45] 張成順.總膽汁酸與血清酶聯(lián)合檢測(cè)在肝損害診斷中的臨床應(yīng)用 [J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2011, 15(8): 1376-1377.

[46] Yerushalmi B, Dahl R, Devereaux M W,.Bile acid-induced rat hepatocyte apoptosis is inhibited by antioxidants and blockers of the mitochondrial permeability transition [J]., 2001, 33(3): 616-626.

[47] 曾惠芬, 戴衛(wèi)波, 歐煥嬌.素馨護(hù)肝方對(duì)ANIT誘導(dǎo)的大鼠膽汁淤積肝損傷的保護(hù)作用 [J].海南醫(yī)學(xué), 2019, 30(13): 1633-1638.

[48] Louvet A, Mathurin P.Alcoholic liver disease: Mechanisms of injury and targeted treatment [J]., 2015, 12(4): 231-242.

[49] 魏芳, 許瑞杰, 蔡詩怡, 等.石榴多酚對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用 [J].中國中藥雜志, 2014, 39(14): 2721-2725.

Discovery ofnano-components and their hepatoprotective effect in mice with alcoholic liver injury

ZHAO Ya-fang1, LI Yu-ru2, CHEN Yu-min1, ZHAO Yu-sheng1, LUO Juan1, ZHANG Yi-fan1, KONG Hui1, ZHAO Yan1, QU Hui-hua3

1.School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2.School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3.Institute of Chinese Medicine Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Nano-components were discovered from(VSC) and explored their hepatoprotective effect on alcoholic liver injury in mice.The VSC was calcinated by muffle furnace at a high temperature.By filtration, extraction and dialysis of the decoction, a new water-soluble substance was obtained and named as VSC nano-components (VSC-NCs).The VSC-NCs were characterized by using transmission electron microscopy (TEM), UV-Vis spectroscopy (UV-Vis), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), fluorescence spectroscopy, X-are ray photoelectron spectroscopy (XPS) and other instruments and methods.According to the alcoholic liver injury model, performing hematoxylin-eosin (HE) staining on the liver and measuring alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), total bile acid (TBA) and the levels of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) in liver homogenate are to evaluate protective effect on liver injury of VSC-NCs.Characterization results showed that VSC-NCs were spherical, uniformly distributed in particle size between 1.20—5.10 nm, with a lattice spacing of 0.23 nm.The VSC-NCs were mainly composed by C, N, O and the surface contained carbonyl and hydroxyl groups.The animal experiment results showed that VSC-NCs significantly reduced the content of ALT, AST, TBA and ALP in mice with alcohol-induced liver injury, and significantly increased the level of SOD and reduced the level of MDA.The results indicated that VSC-NCs can improve the body’s ability to scavenge oxygen free radicals and reduce the production of lipid peroxides, thereby protecting liver cells.The VSC-NCs were discovered fromfor the first time and proved that they have a significant protective effect on liver damage caused by alcohol.This not only shows that VSC-NCs can be used as a potential drug for the treatment of alcoholic liver injury, but also provides a new way of thinking for the qualitative basis of traditional Chinese medicine in research.

; nano-components; alcoholic liver injury;hepatoprotective effect; alanine aminotransferase; aspartate aminotransferase; alkaline phosphatase; total bile acid; superoxide dismutase; malondialdehyde

R283.6

A

0253 - 2670(2021)22 - 6825 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.007

2021-06-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（2019-JYB-TD-001）

趙亞芳，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幪克幍奈镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: zyf2640594023@163.com

通信作者：趙 琰（1973—），女，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)榻?jīng)典方劑的配伍與應(yīng)用及中藥炭藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn

屈會(huì)化（1966—），男，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹兴幪克幍奈镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (010)64286705 E-mail: quhuihuadr@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]