恩諾沙星對球等鞭金藻生長及脂肪酸的影響

許燕茹 林崗

摘?要：以球等鞭金藻Isochrysis galbana為研究對象，分析不同濃度恩諾沙星（ENR）處理下，球等鞭金藻的生長和脂肪酸組成變化。通過細胞計數(shù)法和分光光度法測定球等鞭金藻的生長變化，采用氣相色譜法測定球等鞭金藻的脂肪酸組成和含量。結果表明：恩諾沙星對球等鞭金藻的生長表現(xiàn)出低促高抑的作用，當恩諾沙星處理濃度≤0.625 mg·L-1??時表現(xiàn)出促進作用，恩諾沙星處理濃度≥5 mg·L-1??時表現(xiàn)出抑制作用，但未體現(xiàn)濃度-效應關系。在恩諾沙星的脅迫下，球等鞭金藻脂肪酸組成和含量均發(fā)生變化;隨著培養(yǎng)時間的增加，球等鞭金藻脂肪酸總含量呈降低趨勢，當培養(yǎng)時間為24、96 h時，各濃度組不飽和脂肪酸含量均低于對照組（ENR濃度為0 mg·L-1??），DHA含量與對照組差異不顯著;當恩諾沙星處理濃度≥5 mg·L-1??，培養(yǎng)時間為240 h時，球等鞭金藻不飽和脂肪酸含量極顯著高于對照組，DHA含量顯著高于對照組。因此，在恩諾沙星脅迫下，球等鞭金藻中的不飽和脂肪酸占比得以提高。

關鍵詞：球等鞭金藻;恩諾沙星;脂肪酸;脅迫

中圖分類號：S 917.3?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2021）09-0008-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.09.002

Effects of Enrofloxacin on the Growth and Fatty Acids of Isochrysis Galbana

XU Yan?ru?1， LIN Gang

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Key Laboratory

of Sustainable Utilization of Featured Marine Biological Resources， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In this study， by taking Isochrysis galbana as the research object， the growth and the changes of fatty acid composition of Isochrysis galbana were analyzed under the treatments of different concentrations of enrofloxacin. The growth changes of Isochrysis galbana were measured by using the cell counting method and spectrophotometric method， and the composition and content of fatty acid in Isochrysis galbana were measured by using the gas chromatographic method. The results showed that enrofloxacin exhibited a low?promoting and high?inhibiting effect on the growth of Isochrysis galbana， namely， showing a promoting effect when the concentration of enrofloxacin was ≤0.625??mg·L-1??， and showing an inhibiting effect when the concentration of enrofloxacin was ≥5 mg·L-1??， but there was no concentration?effect relationship. Under the stress of enrofloxacin， the composition and content of fatty acid in Isochrysis galbana changed. With the increase of incubation time， the total content of fatty acid in Isochrysis galbana decreased， and when the incubation time was 24 h and 96 h， the content of unsaturated fatty acid in each concentration group was lower than that in the control group （the concentration of enrofloxacin was 0

mg·L-1??）， and the content of DHA was not significantly different from that in the control group. When the concentration of enrofloxacin was ≥5 mg·L-1?and the incubation time was 240 h， the contents of unsaturated fatty acid and DHA in Isochrysis galbana were significantly higher than those in the control group. Therefore， the proportion of unsaturated fatty acids in Isochrysis galbana was increased under the stress of enrofloxacin.

Key words： Isochrysis galbana; Enrofloxacin; Fatty acids; Stress

金藻門的球等鞭金藻Isochrysis galbana是單細胞微藻，無細胞壁，有兩條等長的鞭毛，富含色素、蛋白質、脂肪酸等營養(yǎng)物質，具有個體大小適中，易被貝類幼蟲捕捉、吞噬、消化吸收，代謝產物對貝類幼蟲無毒等餌料藻類所需條件，可作為水產養(yǎng)殖的活體餌料[1] 。球等鞭金藻富含不飽和脂肪酸，能提高水生生物幼體時期的孵化率、存活率和生長率[2] ，是廣泛使用的海產養(yǎng)殖動物幼體的理想基礎餌料。

恩諾沙星（Enrofloxacin， ENR）是第三代喹諾酮類抗菌藥物，是第一個動物專用的抗生素[3] ，也是我國目前水產養(yǎng)殖允許使用的抗生素藥物之一[4] 。ENR可以通過抑制酶的切割和連接作用，從而阻礙細菌DNA的復制，達到抗菌的目的，其具有抗菌廣譜性、抗菌活性強等特點，在水產養(yǎng)殖中得以廣泛應用[5] 。抗生素對藻類具有抑制作用和毒性，同種抗生素對不同藻類的影響不同[6-7] ，有研究表明ENR對斜生柵藻、銅綠微囊藻、小球藻等具有一定的毒性作用，對這3種微藻均存在生長抑制作用，且表現(xiàn)出濃度-效應關系[8-10] 。不同抗生素對金藻的影響亦有報道，張鶯臍等[11] 認為氟苯尼考對球等鞭金藻的生長呈“低促高抑”的作用，且引起細胞內總脂肪酸含量顯著降低;恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對球等鞭金藻的毒理危害等級分別為高毒和中毒，恩諾沙星的劑量、抑制效應關系表現(xiàn)良好[12] ;土霉素和氯霉素均減小了湛江等鞭金藻增長期的增幅，加快衰退[13] 。

低濃度的抗生素使環(huán)境中易產生耐抗生素菌和抗性基因，存在潛在的生態(tài)毒理效應[14] 。因此，為探究球等鞭金藻對ENR脅迫的響應，本研究擬在低于致死濃度的ENR處理下，研究球等鞭金藻的生物量、脂肪酸含量及組成的變化，以初步了解恩諾沙星脅迫對球等鞭金藻的生長和脂肪酸合成積累的影響。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

球等鞭金藻OA3011（GYH15 Isochrysis galbana OA3011）來自福建省微藻種質改良工程技術研究中心保種，經本實驗室擴培至一定濃度時得到試驗材料。恩諾沙星（ENR）注射液（合肥中龍神力動物藥業(yè)有限公司，獸藥字120151295，規(guī)格10 mL∶0.25 g）。試驗過程中所用器具均經121℃滅菌鍋中高溫滅菌。

1.2 ?藻類培養(yǎng)

選用F/2培養(yǎng)基，按照1∶2接種量接種藻液，海水鹽度為（29±1）‰，pH為（8.00±0.10），培養(yǎng)體積為1 L，錐形瓶瓶口使用無菌透氣封口膜封口以防污染，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，培養(yǎng)光照為4000??lx，光暗比為12L∶12D，每天定期搖藻3次，培養(yǎng)周期10 d。試驗設置對照組（ENR濃度為0 mg· L-1??）、低濃度組（ENR濃度為0.3125、0.625 mg· L-1??）、中濃度組（ENR濃度為1.25、2.5 mg· L-1??）、高濃度組（ENR濃度為5、10 mg· L-1??），每個濃度組各設3個平行。

1.3 ??生物量測定

1.3.1?細胞密度測定?取1 L原藻液稀釋成5個不同濃度梯度，通過酶標儀（INFINITE 200 PRO，TECAN）測定其在波長680 nm處的OD值，并用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下進行細胞密度的測定，建立OD-細胞密度標準曲線（y=17.399x-1.672，R?2= 0.998）;通過離心得到5個不同濃度梯度的藻泥后置于真空冷凍干燥機（LGJ12，松源華興）冷凍干燥至恒重，建立細胞密

度細?胞干重標準曲線（y=0.021x+0.005，R?2=0.997），OD值與細胞密度、細胞密度與細胞干重之間均具有良好的相關性。

培養(yǎng)期間，用酶標儀于波長680 nm處檢測對照組和各試驗組藻液的OD值，再根據(jù)OD值細?胞密度標準曲線得到細胞密度。

1.3.2?對數(shù)生長期的比生長速率?球等鞭金藻的比生長速率的計算公式[15] 如下：

μ=lnxt-lnx0t

式中：Xt、X0（×10?6個·mL-1?）為對數(shù)生長期初期和末期的細胞密度;t為對數(shù)生長期持續(xù)的時間，本試驗中t為 4 d。

1.4?脂肪酸提取及測定

1.4.1?脂肪酸的提取?在第0、24、96、168、240 h，收集不同濃度的恩諾沙星處理的藻液100 mL，12000??r·min-1??離心10 min獲得藻團細胞，用蒸餾水洗滌3次，放-80℃冰箱備用，將藻團轉至冷凍干燥機冷凍干燥48 h[16] 。先對樣品進行甲酯化，再用1 mL正己烷對獲取的脂肪酸甲酯進行萃取[17] ，充分混勻，用一次性注射器吸取上層溶液過0.22 μm有機濾膜，裝于棕色進樣瓶，準備氣相檢測。

1.4.2?脂肪酸成分的測定?氣相色譜分析：使用氣相色譜儀（7890A GC System，Agilent Technologies，USA）對藻細胞內脂肪酸含量進行檢測。色譜柱：SP2560 100M×0.2 um，色譜條件：前檢測器溫度為250℃，色譜柱加熱溫度：初始溫度為140℃，維持5 min，再以4℃·min-1?的加熱溫度加熱到250℃，再維持12.5 min，進樣量為1 uL。標品為SIGMA公司的Fatty Acid Methyl Ester，

C8～?C22，外加DHA，內標為十九酸甲酯。各主要脂肪酸含量計算，采用面積歸一化法[18] 。

1.5?數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖，運用Excel 2013軟件進行統(tǒng)計分析，經T檢驗，當P<0.05時認為具有顯著相關性，當P<0.01時認為具有極顯著相關性，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（Mean±SE）表示。

2?結果與分析

2.1?恩諾沙星對球等鞭金藻生長的影響

2.1.1?恩諾沙星對球等鞭金藻細胞密度的影響?不同濃度ENR對球等鞭金藻生長的影響見圖1。當培養(yǎng)時間為24 h時，中濃度處理組藻細胞密度在（2.51～2.78）×10?6 個·mL-1??，與對照組相比顯著增加，低、高濃度處理組與對照組差異不顯著;當培養(yǎng)時間為96 h時，低濃度處理組藻細胞密度極顯著高于對照組（P<0.01），其藻細胞密度在（6.52～6.81）×10?6個·mL-1??，中、高濃度處理組與對照組差異不顯著;當培養(yǎng)時間為168 h，處理濃度為0.3125??mg· L-1??時，其藻細胞密度為6.72×10?6個·mL-1??極顯著高于對照組（P<0.01），高濃度處理組藻細胞密度分別在（4.60～4.74）×10?6個·mL-1??顯著低于對照組（P<0.05）;當培養(yǎng)時間為240 h時，處理濃度為0.3125??mg· L-1??時，其藻細胞密度為9.83×10?6個·mL-1??極顯著高于對照組（P<0.01），高濃度處理組藻細胞密度在（6.43～6.70）×10?6個·mL-1??顯著低于對照組（P<0.05）。因此，低濃度的ENR脅迫促進了球等鞭金藻的生長，而高濃度的ENR會抑制球等鞭金藻的生長。

2.1.2?恩諾沙星對球等鞭金藻比生長速率的影響?不同濃度ENR處理后，球等鞭金藻比生長速率見圖2，低濃度處理組球等鞭金藻的比生長速率高于對照組，分別為0.323和0.312;中、高濃度處理組球等鞭金藻的比生長速率在0.246～0.257，低于對照組的0.262?。當ENR處理濃度≥1.25?mg·L-1??時，其比生長速率并未表現(xiàn)出濃度-效應關系。

2.2?恩諾沙星對球等鞭金藻細胞脂肪酸的影響

2.2.1?恩諾沙星對球等鞭金藻脂肪酸總含量的影響??20種常見混合脂肪酸的標準品溶液氣相色譜圖見圖3，球等鞭金藻提取的脂肪酸氣相色譜圖見圖4，不同濃度ENR對球等鞭金藻脂肪酸總含量影響見圖5。當培養(yǎng)時間為24 h時，高濃度組球等鞭金藻脂肪酸總含量顯著高于對照組（P<0.05），其中處理濃度為 5 mg· L-1??達到最大值（22.80±0.98）%，低、中濃度處理組與對照組相比差異不顯著;當培養(yǎng)時間為96 h時，各濃度處理組的脂肪酸含量與對照組相比差異不顯著;當培養(yǎng)時間為168 h，處理濃度為 5 mg·L-1??時球等鞭金藻脂肪酸含量為（8.93±?0.27）%，顯著低于對照組（10.54±0.70）%（P<0.05）;當培養(yǎng)時間為240 h時，各濃度處理組的脂肪酸含量與對照組相比差異不顯著。

2.2.2?恩諾沙星對球等鞭金藻脂肪酸組成成分的影響?不同濃度ENR對球等鞭金藻各脂肪酸組成和含量的影響見圖6和表1。當培養(yǎng)時間為24、96 h時，各濃度處理組飽和脂肪酸（SFA）含量均大于對照組，總不飽和脂肪酸含量均小于對照組，其中單不飽和脂肪酸（MUFAs）和多不飽和脂肪酸（PUFAs）含量均低于對照組，高濃度組不飽和脂肪酸含量分別在14.12%～15.89%和22.30%～24.55%，顯著低于對照組26.63%和27.50%（P

表1為培養(yǎng)時間240 h時，不同濃度ENR處理下，球等鞭金藻各脂肪酸占所檢測出總脂肪酸的百分比。試驗組培養(yǎng)的球等鞭金藻中富含C14∶0?、C16?系列、C18?系列、C20∶1?、C22∶1?、C22∶6?（DHA）等脂肪酸，其中以C16∶0??居多。隨著處理濃度的增加，飽和脂肪酸中的C16∶0?、C18∶0?呈下降趨勢，不飽和脂肪酸中的C18∶1?、C20∶1?呈上升趨勢，各試驗濃度組中C18∶1?含量顯著高于對照組，高濃度處理組除C18∶2?外，其他不飽和脂肪酸含量均顯著高于對照組;當處理濃度為5 mg· L-1??時DHA含量為（7.37±0.08）%極顯著高于對照組（6.67±0.08）%（P<0.01），處理濃度為10 mg·L-1??時DHA含量為（7.38±0.34）%顯著高于對照組（6.67±0.08）%（P<0.05）;高濃度處理組飽和脂肪酸含量分別為（63.48±0.37）%、（62.12±1.05）%，極顯著低于對照組（68.37±0.42）%（P<0.01），但單不飽和脂肪酸與之相反，高濃度處理組單不飽和脂肪酸含量分別為（22.27±0.35）%、（23.14±1.00）%，極顯著高于對照組（18.49±0.38 ）%（P<0.01），多不飽和脂肪酸含量分別為（14.25±0.09）%、（14.74±0.35）%，極顯著高于對照組（13.15±0.04）%（P<0.01）;總不飽和脂肪酸在處理濃度為10 mg· L-1??時達到最大值，為（37.88±1.05）%。試驗組中ENR脅迫對球等鞭金藻脂肪酸組成及含量具有明顯影響。

3?討論與結論

微藻在受脅迫時，能表現(xiàn)出毒物效應，即在低濃度下某些有毒化合物可以在一定的程度上促進細胞的某些生理活動[19] 。有研究表明，在一定范圍內乙酸乙酯粗提物對球等鞭金藻細胞生長有一定的促進作用[20] ;氨芐青霉素、鏈霉素在較低濃度時可以促進藻體生長，高于一定質量濃度則表現(xiàn)出抑制作用，且不同藻類響應程度及閾值存在較大差異[21] 。本研究中，低濃度處理組球等鞭金藻的細胞密度和比生長速率均大于對照組，但中濃度處理組球等鞭金藻的細胞密度和比生長速率與對照組差異不顯著，未表現(xiàn)出濃度依賴特征。四環(huán)素、土霉素、恩諾沙星對球等鞭金藻、三角褐指藻的活性氧（ROS）含量均具有促進作用，且隨濃度的增加，促進作用越明顯[22] 。當受到脅迫時，藻體細胞產生大量的活性氧并急劇積累，膜系統(tǒng)受到損失，能引起體內氧化脅迫，甚至引起細胞代謝紊亂，最終抑制藻體的生長發(fā)育[23] 。本研究中高濃度處理組在168 h后對球等鞭金藻的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，與上述研究結果類似。

球等鞭金藻中的不飽和脂肪酸具有較高的營養(yǎng)價值，特別是DHA，在許多水生動物幼體的生長過程中是必不可少的。有研究表明，在蝦、海水魚、軟體動物等水生動物幼體時期投喂球等鞭金藻可提高其生長和存活率[24] 。經紫外誘變的突變藻株的不飽和脂肪酸含量高于原始藻株，DHA含量也高于原始藻株[25] ;低溫誘導可以提高球等鞭金藻DHA的產量，當球等鞭金藻受到脅迫時，其DHA作為非酶促小分子抗氧化物質，與抗氧化保護酶系統(tǒng)共同作用，清除低溫誘導產生的ROS[26] 。ENR脅迫也使球等鞭金藻的DHA含量得到明顯提高，與上述結果類似。

微藻在不同的環(huán)境中，其各類脂肪酸的比例會發(fā)生改變，脂肪酸的組成也會因此產生變化[27] 。在受脅迫環(huán)境條件下，生物本身為保持其正常生理功能，通過升高其自身的不飽和度，以增加細胞膜的流動性[28] ，因此脂肪酸去飽和在受脅迫時起到重要作用[29] 。ENR脅迫下，高濃度處理組中球等鞭金藻的不飽和脂肪酸呈現(xiàn)上升趨勢，可能原因是高濃度處理組的去飽和酶的活性提高，增強了去飽和作用，使得不飽和脂肪酸的占比得以提高。因此，抗生素脅迫也許可作為篩選高不飽和脂肪酸含量藻株的一種途徑。

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（責任編輯：柯文輝）