水產(chǎn)飼料中真菌產(chǎn)毒關(guān)鍵環(huán)境因素及毒素種類的研究

李曉娜 田慧勇 楊曉夏 陳明山 曹濤 李森

摘要：為探明水產(chǎn)飼料中真菌產(chǎn)毒的關(guān)鍵因素和毒素種類，采用真菌菌種接種不同水產(chǎn)飼料培養(yǎng)基在不同溫度、濕度、光照條件下，觀察其生長、產(chǎn)毒情況。結(jié)果表明：從不同環(huán)境因素下南美白對蝦飼料中真菌毒素的產(chǎn)生情況可以看出，在實驗環(huán)境條件下有五種毒素檢出，分別為玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A。該試驗中15天時4種不同水產(chǎn)飼料中黃曲霉毒素B1的含量與飼料中賴氨酸含量關(guān)聯(lián)度最大，其次為粗蛋白、粗灰分、粗纖維和水分。水產(chǎn)飼料中不同真菌毒素的發(fā)生條件不盡相同，飼料儲存需根據(jù)當(dāng)?shù)丶竟?jié)及氣候條件選擇適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件來避免或盡可能降低真菌毒素帶來的污染。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)飼料;真菌毒素;環(huán)境影響;污染防控

中圖分類號：S963? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

水產(chǎn)飼料業(yè)的成長基于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展改革開放之后，上世紀(jì)80年代，以對蝦、河鰻、甲魚等為代表的名優(yōu)水產(chǎn)品養(yǎng)殖迅猛發(fā)展引人注目，為了與我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展進(jìn)程相匹配，上世紀(jì)90年代，我國水產(chǎn)飼料產(chǎn)業(yè)逐步成型，水產(chǎn)飼料商品已成為我國飼料行業(yè)發(fā)展的亮點。2018年中國水產(chǎn)飼料產(chǎn)量達(dá)2211萬噸，較2017年增加了131.2萬噸，同比增長6.31%，但2019年起中國水產(chǎn)飼料產(chǎn)量開始下滑，2020年中國水產(chǎn)飼料產(chǎn)量為2123.6萬噸，較2019年減少了79.3萬噸，同比減少3.60%[1]。

到目前為止，廣東省水產(chǎn)飼料中真菌毒素污染情況的報道非常少，由此以廣東省的水產(chǎn)飼料霉變情況作為研究對象更加具有代表性。水產(chǎn)飼料被真菌毒素污染大致可分為兩種情況，一是制造飼料的植物性原料被污染，二是成品飼料在儲存過程中被真菌污染后產(chǎn)生毒素[2，3]。成品飼料霉變過程往往是內(nèi)因與外因共同作用的結(jié)果[4，5]。當(dāng)環(huán)境條件適合真菌活動時，飼料霉變會在短期內(nèi)發(fā)生[6-8];當(dāng)常規(guī)儲藏條件下飼料本身因素適合真菌生長時，飼料霉變也會發(fā)生[9-10]。探明水產(chǎn)飼料中真菌產(chǎn)毒的關(guān)鍵因素將為真菌毒素在水產(chǎn)飼料中污染防控及進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)。

1? 實驗材料及方法

1.1? 菌種

本實驗采用的菌種為購自廣東省菌種保藏中心的木賊鐮孢，編號：GIM3.506，其他編號：無;鮮綠青霉，編號：GIM3.505，其他編號：AS3.4517;寄生曲霉，編號：GIM3.395，其他編號：AS3.124;三線鐮孢菌，編號：GIM3.491，其他編號：AS3.4731;實驗室自分離菌株：黃曲霉;分離來源：霉變馬友魚干。

菌種的復(fù)蘇與培養(yǎng)：用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，將凍干管尖端放在火焰上加熱，滴少量無菌水至加熱處使之破裂，用銼刀或鑷子輕輕敲下安瓿管頂端，并將凍干管開口處在火焰上過1遍，并保持在火焰旁操作。用無菌吸管吸取0.2 mL無菌水，滴入管內(nèi)，待安瓿管內(nèi)的牛奶菌粉溶解呈懸浮狀，再用無菌吸管吸取全部菌懸液接在2個馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板培養(yǎng)基上，并在28℃培養(yǎng)3～5天。觀察PDA平板，使用接種針將單一的目標(biāo)菌落接種至50 mL PDA肉湯中，在培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為100 rpm的搖床培養(yǎng)8天。

1.2? 試劑

甲醇：色譜純;乙腈：色譜純;超純水由arium 611VF超純水機(jī)制備;氯化鉀、氯化鈉、硫酸鉀、正己烷、乙酸、氨水、乙醇均為分析純試劑;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），青島海博公司。

1.3? 實驗器材

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：TSQ Quantum Access，THERMO Fisher;電子分析天平：XS205，METTELER TOLEDO;可溫控超聲波提取器：HU-3120B，天津恒奧科技發(fā)展有限公司;旋渦混合器：VTX-3000L，vortex;漩渦震蕩器：Multi Reax，Heidolph;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Hei-VAP Value G3，Heidolph;離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;氨基酸自動分析儀：L-8900，HITACHI;冰箱：AQ-16L，先科;溫濕度計：9014，得力;低溫恒溫培養(yǎng)箱：LTI-700W;LED隨身燈。

1.4? 不同環(huán)境因素對水產(chǎn)飼料中真菌產(chǎn)毒的影響

選擇南美白對蝦配合顆粒飼料作為實驗飼料，將培養(yǎng)良好的菌株P(guān)DA肉湯接種至實驗飼料中。分別設(shè)置不同環(huán)境條件，考察真菌產(chǎn)毒情況。

1.4.1? 儲藏濕度的選擇

設(shè)置28℃條件下濕度為75%、84%、98%三個濕度區(qū)系，分別采用NaCl、KCl、K2SO4的飽和鹽溶液來維持環(huán)境的相對濕度。12小時光照，12小時避光儲藏。

1.4.2? 儲藏溫度的選擇

分別設(shè)置18℃、23℃、28℃三個溫度區(qū)系，濕度為84%，12小時光照，12小時避光儲藏。

1.4.3? 儲藏光照條件的選擇

設(shè)置1天內(nèi)光照時長分別為24小時、12小時、0小時，溫度28℃，濕度84%儲藏。

1.4.4? 儲藏時間的選擇

分別于15天、30天、45天、60天、90天后將上述條件下儲藏的飼料取樣，按3.1方法檢測其中目標(biāo)毒素含量。

1.5? 不同基質(zhì)飼料中主要毒素種類

選擇南美白對蝦配合飼料、金鯧魚配合飼料、魚蝦混合全效配合飼料、草蝦配合飼料4種不同的水產(chǎn)配合飼料作為實驗飼料，接種3.3.1.1菌種后在溫度28℃，濕度84%條件下，12天光照，12天避光儲藏90天，分別于15天、30天、45天、60天、90天取樣，然后檢測其中目標(biāo)毒素含量。

飼料典型成分分析方法：飼料中水分含量的測定參照GB/T6435-2014《飼料中水分的測定》;粗灰分參照GB/T6437-2007《飼料中粗灰分的測定》;粗蛋白參照GB/T6432-1994《飼料中粗蛋白測定方法》;賴氨酸參照GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測定》中酸提取法;粗纖維參照GB/T6434-2006《飼料中粗纖維的含量測定過濾法》。

2? 結(jié)果分析與討論

2.1? 不同環(huán)境因素對水產(chǎn)飼料中真菌產(chǎn)毒的影響

從不同環(huán)境因素下南美白對蝦飼料中真菌毒素的產(chǎn)生情況（表1）可以看到，在實驗環(huán)境條件下，在對目標(biāo)毒素的檢測中有5種毒素檢出，分別為玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A。玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1及赭曲霉毒素A從第一次取樣（儲存15天）開始就檢出陽性，并且含量較高，說明在設(shè)置的實驗條件下，這三種毒素在短期內(nèi)非常容易產(chǎn)生。T-2毒素和HT-2毒素則是在儲存90天后才檢出陽性，也就是說在設(shè)置的實驗環(huán)境下這兩種毒素的產(chǎn)生需要一定時間。赭曲霉毒素A在45天后的目標(biāo)毒素檢測中結(jié)果為陰性，可能的原因是儲存過程中環(huán)境中其他微生物的作用將其降解或是產(chǎn)毒菌株在前期產(chǎn)生赭曲霉毒素A，后期產(chǎn)生或轉(zhuǎn)化為赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C等其他次生代謝產(chǎn)物。玉米赤霉烯酮（圖1）和黃曲霉毒素B1（圖2）的發(fā)生規(guī)律有些相似，均是在30～60天達(dá)到峰值后開始下降，這并不符合預(yù)想的遞增規(guī)律，可能原因是飼料在儲存過程中當(dāng)水分和熱量在局部蓄積到一定程度，曲霉、青霉等適于中等水分和溫度的真菌開始增多并產(chǎn)毒，但進(jìn)一步儲存過程中嗜熱型、濕生性的細(xì)菌、放線菌、霉菌就開始大量繁殖，這些微生物共同作用使得不同菌種間有一定的競爭抑制作用。加上在后期可能出現(xiàn)能夠降解真菌毒素的細(xì)菌或是產(chǎn)毒真菌被抑制后環(huán)境條件如光照等將產(chǎn)生的真菌毒素降解。但從飼料中菌落狀況來看，霉變程度隨著時間遞增越來越嚴(yán)重，雖然實驗條件下部分目標(biāo)毒素有降低趨勢，但并不代表飼料品質(zhì)可逆，因為檢測的目標(biāo)毒素種類有限，微生物間作用機(jī)理復(fù)雜，目標(biāo)毒素轉(zhuǎn)化為其他有毒物質(zhì)或產(chǎn)生其他有毒次生代謝產(chǎn)物也是極有可能的。

當(dāng)濕度為84%，溫度28℃，光照時長為12小時或24小時時，產(chǎn)生大量玉米赤霉烯酮所需時間最短，而當(dāng)飼料儲存30天后產(chǎn)量處于峰值時的環(huán)境因素中毒素產(chǎn)量最高的條件分別為濕度75%，溫度23℃，光照時長12小時（圖1）。黃曲霉毒素B1產(chǎn)量處于峰值時的環(huán)境因素中產(chǎn)量最高的條件為濕度98%，溫度28℃，光照時長0小時（圖2）。

選擇玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1在45天，T-2毒素、HT-2毒素在90天，赭曲霉毒素A在30天時的產(chǎn)毒量進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析（表2～表6）。其中玉米赤霉烯酮與溫度條件關(guān)聯(lián)度最大，黃曲霉毒素B1與濕度條件關(guān)聯(lián)度最大，T-2毒素、HT-2毒素和赭曲霉毒素A與光照時長關(guān)聯(lián)度最大。所以不同毒素在水產(chǎn)飼料中的產(chǎn)毒條件并不相同，即水產(chǎn)飼料在儲存過程中應(yīng)該根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂蜻x擇適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件來避免飼料中真菌毒素的發(fā)生。

2.2? 不同基質(zhì)飼料中主要毒素種類

選擇90天內(nèi)水產(chǎn)飼料中各毒素含量較大時的值作為參考數(shù)列xa，飼料的典型性狀作為比較數(shù)列xi（i=1，2，…，n）進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析（表7）。在進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析時，按公式（1）進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，計算得到參考數(shù)列ya（k），比較數(shù)列yi（k）（k=1，2，…，m;i=1，2，…，n）。和S分別代表數(shù)列的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)公式（2）求參考數(shù)列與比較數(shù)列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。其中ρ為分辨系數(shù)，一般取值為0.5，為ya（k）與yi（k）的差值絕對值的最小值，為ya（k）與yi（k）的差值絕對值的最大值，按公式（3）計算關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見表8。

從表7和表8可以看到，15天時4種不同水產(chǎn)飼料中黃曲霉毒素B1的含量與飼料中賴氨酸含量關(guān)聯(lián)度最大，其次為粗蛋白、粗灰分、粗纖維和水分，這與75天時玉米赤霉烯酮含量與飼料典型性狀間的關(guān)聯(lián)次序一致。即在溫濕度較高情況下一種飼料一旦被產(chǎn)毒真菌污染，就很可能同時被黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染。并且賴氨酸和蛋白含量高的飼料更容易被這兩種毒素污染。與T-2毒素與HT-2毒素含量關(guān)聯(lián)度最大的均為粗纖維含量，其次為水分含量。說明T-2毒素與HT-2毒素的發(fā)生規(guī)律與飼料中粗纖維和水分含量息息相關(guān)。而赭曲霉毒素A與飼料中粗灰分含量關(guān)聯(lián)度最大。所以不同毒素在同一環(huán)境條件下與飼料中典型性狀的相關(guān)性不盡相同，即不同飼料在儲存過程中易感真菌毒素種類有差異，防治工作需要針對性的進(jìn)行。

3? 結(jié)論

水產(chǎn)飼料一旦被產(chǎn)毒真菌污染，在本實驗設(shè)置環(huán)境條件下赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮及黃曲霉毒素B1會在短期內(nèi)迅速發(fā)生，T-2毒素及HT-2毒素的發(fā)生則需要一定時間。赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮及黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生在30～60天達(dá)到最大值，之后有所下降甚至消失，其原因可能為目標(biāo)毒素被其他微生物或環(huán)境條件降解，也可能是產(chǎn)毒菌株自身作用轉(zhuǎn)化為其他次生代謝產(chǎn)物。

水產(chǎn)飼料中不同真菌毒素的發(fā)生條件不盡相同，飼料儲存需根據(jù)當(dāng)?shù)丶竟?jié)及氣候條件選擇適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件來避免或盡可能降低真菌毒素帶來的污染。不同水產(chǎn)飼料易感真菌毒素種類有差異，但黃曲霉毒素B1與玉米赤霉烯酮發(fā)生規(guī)律相似，高含量賴氨酸及蛋白的飼料更易感染這兩種真菌毒素。T-2毒素與HT-2毒素發(fā)生規(guī)律相似，粗纖維含量高的飼料易感染。赭曲霉毒素A則與飼料中粗灰分含量最相關(guān)。所以飼料在儲存階段真菌毒素的防治工作需有針對性的進(jìn)行。

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