萬(wàn)古霉素的塵世之旅

錢璞凡，呂萍

浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州310027

“啦啦啦啦，啦啦啦，我是破壞的小行家……”黃色葡萄球菌小黃正在他宿主小高的血漿中邊哼著小曲邊搞破壞，東拆一塊磚，西敲一片瓦，還對(duì)周圍環(huán)境中充斥著的青霉素熟視無(wú)睹。原來(lái)，這個(gè)細(xì)菌是一個(gè)技藝高超的青霉素耐藥菌，哪怕是青霉素類抗生素中最強(qiáng)勢(shì)的對(duì)甲氧苯青霉素也拿他束手無(wú)策[1]。小黃一路如入無(wú)人之境，眼看著就要突入血液-腦脊液屏障[2]，進(jìn)入大腦馳騁了。正當(dāng)小黃神游天外的時(shí)候，便迎面撞上了一個(gè)分子，莫名的危機(jī)感讓這個(gè)小小的細(xì)胞試圖閉上與外界交換物質(zhì)的嘴巴，可還是沒(méi)來(lái)得及。不過(guò)小黃安慰自己，這個(gè)分子雖然味道和以前不小心吃到的那些青霉素類抗生素不盡相同[3]，但他可是無(wú)所不能的耐藥菌。

可這次他錯(cuò)了。小黃在血管的轉(zhuǎn)彎處撞了一下血管壁，把細(xì)胞壁上的肽聚糖[4,5]撞落了一些，他這才想起來(lái)自己剛剛太貪吃，身子長(zhǎng)大了不少，細(xì)胞壁也需要更新一次了。于是他啟動(dòng)了肽聚糖的合成?？伤麉s震驚地發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)這一合成過(guò)程似乎遇到了一些阻力。仔細(xì)一看，竟是剛剛吃進(jìn)的那個(gè)外來(lái)的分子，正恰好接到了的肽聚糖鏈一端，導(dǎo)致肽聚糖層間進(jìn)一步的交聯(lián)無(wú)法正常進(jìn)行[6]。這可把小黃急壞了：細(xì)胞壁無(wú)法更新，他便失去了生長(zhǎng)和繁殖的能力，這對(duì)于一個(gè)單細(xì)胞原核生物而言，意味著生命將在幾個(gè)小時(shí)的停滯后徹底終結(jié)。他有些不甘心，便調(diào)動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)所有的酶前往肽聚糖合成出錯(cuò)的位點(diǎn)，試圖將外來(lái)的這個(gè)奇怪分子解離下來(lái)，繼續(xù)合成肽聚糖。可不一會(huì)兒，他便頹然地發(fā)現(xiàn)，自己體內(nèi)的酶，似乎都無(wú)法識(shí)別這個(gè)分子，站在這個(gè)錯(cuò)誤跟前束手無(wú)策。他絕望了。

沒(méi)過(guò)幾個(gè)小時(shí)，小黃在絕望中死去了，就像小高體內(nèi)他那些同樣進(jìn)化出對(duì)甲氧苯青霉素耐藥性的同伴們一樣。在瀕死的時(shí)刻，小黃依然想不通殺死自己的到底又是何方神圣。其實(shí)消滅他們的，便是多重耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌的天敵，萬(wàn)古霉素。

1 初次相遇

彼時(shí)，東方擬無(wú)枝酸菌還只是一種無(wú)名放線菌，小東便是出生在加里曼丹島的一個(gè)[7]。這天，他和往常一樣，懶洋洋地躺在泥土里感受太陽(yáng)的溫度。正當(dāng)他快要睡著的時(shí)候，突然感覺(jué)周圍的泥土開(kāi)始了快速地上升，嚇得小東趕緊伸出鞭毛，緊緊抓牢邊上的泥土。經(jīng)過(guò)一段漫長(zhǎng)的下落后，小東突然覺(jué)得照在自己身上的光特別冷，隨后便失去了意識(shí)。

同小東一樣，彼時(shí)的科恩菲爾德也同樣寂寂無(wú)名。1953年，從哈佛大學(xué)博士畢業(yè)的他，正帶領(lǐng)著團(tuán)隊(duì)，從各類放線菌的代謝產(chǎn)物中為禮來(lái)公司尋找新的抗生素。在顯微鏡下，科恩看到了小東。小東的樣子和從前觀察到的那些放線菌形態(tài)不同，科恩心想，這一定是一個(gè)稀有的菌種，一定會(huì)有其獨(dú)特功能。想到這，他便頗有干勁地開(kāi)始從樣本中分離小東。

和往常一樣，科恩分離了土壤樣本中的全部菌種，將他們分開(kāi)在不同的培養(yǎng)基中，嘗試培養(yǎng)他們的單菌落，進(jìn)而分離他們代謝產(chǎn)生的活性物種。在培養(yǎng)基的滋養(yǎng)下，漂洋過(guò)海的小東開(kāi)始了快速繁殖，成功培育成了一個(gè)單菌落，培養(yǎng)基中也出現(xiàn)了一些小東族群的特異代謝產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)了更加漫長(zhǎng)的分離純化過(guò)程后，科恩發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中，這種無(wú)名細(xì)菌的培養(yǎng)液中分離得到的一種編號(hào)為05865的活性成分，對(duì)葡萄球菌有著很強(qiáng)的抑制作用，甚至連對(duì)青霉素?zé)o感的金黃色葡萄球菌也有著幾乎相同的殺傷力。隨后他們又進(jìn)行了進(jìn)一步的耐藥性培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如果在含有活性成分05865的培養(yǎng)基中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，那怕是經(jīng)過(guò)了多次傳代培養(yǎng)，葡萄球菌仍然沒(méi)有被誘導(dǎo)出對(duì)于活性成分05865的顯著抗藥性[8,9]。

這一發(fā)現(xiàn)讓科恩欣喜若狂。這簡(jiǎn)直是撿到寶了??！近些年來(lái)，由于這些耐藥菌的橫行，對(duì)于那些青霉素?zé)o法治愈的病人，往往只能乞求奇跡出現(xiàn)，可05865這種活性成分的出現(xiàn)竟然打破了這一點(diǎn)。這簡(jiǎn)直是一個(gè)發(fā)大財(cái)?shù)暮脵C(jī)會(huì)呀！在科恩菲爾德的建議下，禮來(lái)公司將這種物質(zhì)命名為萬(wàn)古霉素(Vancomycin)，取自于英文單詞Vanquish，以彰顯其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的“絕對(duì)清除作用”。同時(shí)，他們也給漂洋過(guò)海的小東起了個(gè)名字：東方擬無(wú)枝酸菌。自此，默默無(wú)名的小東也終于有了他的名字[10]。

現(xiàn)在唯一橫在他們面前的問(wèn)題就是純度。對(duì)于批量生產(chǎn)，禮來(lái)公司一點(diǎn)都不擔(dān)心，畢竟只要培養(yǎng)基足夠就行?？蓶|方擬無(wú)枝酸菌的代謝產(chǎn)物實(shí)在太多，很多又難以祛除，在沒(méi)有全部確定結(jié)構(gòu)之前就貿(mào)然開(kāi)始臨床試驗(yàn)，萬(wàn)一這些副產(chǎn)物中，有一些物質(zhì)的毒性很大，那該怎么辦？

這像一桶冷水又澆滅了科恩團(tuán)隊(duì)的喜悅。他們又開(kāi)始了漫長(zhǎng)的嘗試，先是嘗試了用苦味酸進(jìn)行分離，然后在此基礎(chǔ)上對(duì)分離方法進(jìn)一步改進(jìn)，但純度一直都卡在80%左右，一直沒(méi)能越過(guò)85%的大關(guān)。雖然體外實(shí)驗(yàn)都證明了萬(wàn)古霉素的高效性，但這如果其中的雜質(zhì)對(duì)其他器官有害，可不就是對(duì)病人不負(fù)責(zé)任？如果確實(shí)能夠找到危重病人，愿意嘗試新藥，那倒也是一大幸事。

2 小試牛刀

凌晨，躺在病床上的愛(ài)德華被一陣疼痛疼醒。“哎，嗎啡的效果又過(guò)去了，今天又注定是一個(gè)不眠夜了?！睈?ài)德華望著窗外的明月，心中百感交集。一個(gè)月前，因?yàn)槟_部出現(xiàn)了一些小病灶，需要手術(shù)根除，他便住進(jìn)了這家醫(yī)院。手術(shù)非常順利，醫(yī)生說(shuō)不會(huì)有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，傷口不發(fā)生感染的話兩周就可以出院?？蓻](méi)想到命運(yùn)就是捉摸不透，第二天傷口便發(fā)生了細(xì)菌感染，而且在青霉素的作用下也絲毫沒(méi)有潰退的趨勢(shì)。有次醫(yī)生來(lái)查房的時(shí)候他問(wèn)起來(lái)，醫(yī)生猶豫半天，才支支吾吾地告訴他，可能是青霉素耐藥菌感染，不過(guò)也鼓勵(lì)愛(ài)德華不要放棄希望，一定是有辦法的。

清晨的陽(yáng)光從外面灑了進(jìn)來(lái)，新的一天又開(kāi)始了。昨天早上醫(yī)生來(lái)查房的時(shí)候通知他說(shuō)，如果感染再擴(kuò)大，細(xì)菌隨時(shí)可能進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，感染很快會(huì)擴(kuò)散到全身，到時(shí)候真地就無(wú)力回天了。事到如今，截肢或許是最保險(xiǎn)的辦法。醫(yī)生說(shuō)，現(xiàn)在還沒(méi)有對(duì)抗耐藥菌的特效藥，或許只能等待奇跡出現(xiàn)。

正在愛(ài)德華胡思亂想之際，病房的門被推開(kāi)了。醫(yī)生快步走進(jìn)來(lái)：“愛(ài)德華！我的朋友聽(tīng)說(shuō)了你的病癥，他告訴我說(shuō)，禮來(lái)公司研發(fā)了一款新藥，對(duì)于耐藥菌有奇效，目前已經(jīng)進(jìn)入了II期臨床試驗(yàn)階段。如果你愿意使用的話，我便去問(wèn)一問(wèn)，能不能給你申請(qǐng)一點(diǎn)試一試？”

愛(ài)德華簡(jiǎn)直不敢相信自己的耳朵。好像自己有救了？“好的好的，謝謝醫(yī)生！”

當(dāng)晚，禮來(lái)公司的員工便將萬(wàn)古霉素送了過(guò)來(lái)，特別囑咐說(shuō)需要每天給藥兩次，效果才比較好?？紤]到愛(ài)德華的情況特別危急，醫(yī)生決定每8小時(shí)給藥100毫克的劑量[11]，用藥一周。愛(ài)德華不會(huì)想到，第二天早上，之前青霉素一直無(wú)能為力的感染竟好了大半。一個(gè)療程還沒(méi)結(jié)束，感染便已全部被祛除，可以出院了[12]。

3 當(dāng)頭一棒

就這樣，1958年，由于萬(wàn)古霉素對(duì)于抗耐藥菌感染的奇效，禮來(lái)公司在未確定萬(wàn)古霉素結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上便將其匆匆上市了[13]。剛上市的幾年，萬(wàn)古霉素確實(shí)因?yàn)槠鋵?duì)于耐青霉素的革蘭陽(yáng)性菌都有顯著效果而受到醫(yī)生和病人們的追捧，但隨后幾年中發(fā)生的兩個(gè)不大不小的事情，卻迫使人們又重新冷靜了下來(lái)。

第一個(gè)事情是一個(gè)小小的醫(yī)療事故[14]。一家醫(yī)院在治療一位患有化膿性肌炎和骨髓炎的4歲男孩時(shí)，在使用萬(wàn)古霉素進(jìn)行治療時(shí)，出現(xiàn)了嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象。由于萬(wàn)古霉素在此之前也有腎毒性的相關(guān)報(bào)道，因此醫(yī)生選擇了停用萬(wàn)古霉素，改用了新藥進(jìn)行治療。一停用萬(wàn)古霉素，男孩持續(xù)的不明原因發(fā)熱隨即消退。而同時(shí)期，還有很多有關(guān)萬(wàn)古霉素腎毒性[15]、耳毒性[16]等副作用的報(bào)道[17]，這使得萬(wàn)古霉素的安全性受到了一些質(zhì)疑。

第二個(gè)事情出乎意料但又在情理之中。耐萬(wàn)古霉素的細(xì)菌出現(xiàn)了[18]。在長(zhǎng)久的臨床治療中，萬(wàn)古霉素一直被當(dāng)做是感染的最后一道防線。如今，這一道防線竟然破了，那該怎么辦？

這兩個(gè)問(wèn)題鞭策著化學(xué)家們對(duì)萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定，研究其致病機(jī)理，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出更多新藥，才能解決抗藥性這個(gè)問(wèn)題。

4 豁然開(kāi)朗

時(shí)間一晃而過(guò)，來(lái)到了1980年代。康斯坦斯·哈里斯正端坐在實(shí)驗(yàn)室的電腦前查閱有關(guān)萬(wàn)古霉素結(jié)構(gòu)確定的文獻(xiàn)。他正在瀏覽謝爾德里克1978年在Nature上發(fā)表的有關(guān)萬(wàn)古霉素結(jié)構(gòu)鑒定的工作[19]。其實(shí)在之前，對(duì)萬(wàn)古霉素結(jié)構(gòu)的探索，已經(jīng)有了很多階段性的成果。1965年，馬歇爾將萬(wàn)古霉素降解，嘗試分析降解所得的產(chǎn)物，初步確定了萬(wàn)古霉素的基本骨架結(jié)構(gòu)，邁出了關(guān)鍵一步[20]。1977年，威廉姆斯和卡爾曼借助核磁共振儀給萬(wàn)古霉素做了一個(gè)全身體檢，在氫核磁共振譜中分別觀察到萬(wàn)古霉素中6個(gè)肽鍵(-CONH-)和1個(gè)酰胺鍵(-CONH2)的信號(hào)；考慮到肽鏈中氮原子的螯合配位能力，他們分析了不同半徑的Eu3+和Pr3+離子與萬(wàn)古霉素結(jié)合形成的產(chǎn)物，對(duì)于萬(wàn)古霉素的骨架結(jié)構(gòu)給出了更加具體的指導(dǎo)意見(jiàn)[21]，不過(guò)后來(lái)他們又對(duì)這一結(jié)構(gòu)中芳環(huán)的構(gòu)象進(jìn)行了微小的修正[22]。謝爾德里克則在他們的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展，用X射線從不同角度給萬(wàn)古霉素降解產(chǎn)物CDP-I的單晶照了許多張照片，將各個(gè)角度的圖像疊加起來(lái)，還原了CDP-I的分子結(jié)構(gòu)，并以此為基礎(chǔ)，結(jié)合其他降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，提出了萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)[19]。

但謝爾德里克的CDP-I的結(jié)構(gòu)中并不含有酰胺鍵(-CONH2)。哈里斯在前期的工作后發(fā)現(xiàn)，似乎有更多證據(jù)支持威廉姆斯含有酰胺鍵(-CONH2)的判斷。他認(rèn)為，基于降解產(chǎn)物CDP-I結(jié)構(gòu)推斷出的萬(wàn)古霉素異天冬酰胺殘基獨(dú)特結(jié)構(gòu)實(shí)際可能是在萬(wàn)古霉素降解過(guò)程中重排造就的，而這個(gè)殘基的前體應(yīng)該就是更常見(jiàn)的天冬酰胺。

但他一直苦于沒(méi)能拿到實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

“康斯坦斯，又在想你那個(gè)萬(wàn)古霉素了？”他的同事托馬斯·哈里斯端著杯咖啡走過(guò)來(lái)問(wèn)道。

“是啊，還是沒(méi)想到該怎么設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)玫疥P(guān)鍵證據(jù)?！笨邓固顾癸@得有點(diǎn)氣餒。

“你呀，就是又把問(wèn)題復(fù)雜化了。既然你都有了猜想，那就先把它解決了，再想其他復(fù)雜的事情。先針對(duì)你的猜想，去查查有哪些反應(yīng)是天冬酰胺所獨(dú)有的，哪些反應(yīng)是異天冬酰胺殘基獨(dú)有的，要是兩者的反應(yīng)性相互印證，那結(jié)果不就顯而易見(jiàn)了嘛。”

康斯坦斯眼前一亮，當(dāng)即開(kāi)始設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。首先，相比于僅碳原子端連有基團(tuán)的酰胺鍵(-CONH2)，肽鍵(-CONH-)被碳原子和氮原子伸展出去的兩條鏈固定在中間，具有更大的位阻；倘若使用乙硼烷對(duì)這兩種位阻不同的酰胺鍵進(jìn)行還原，由于肽鍵周圍基團(tuán)更豐富，對(duì)于外來(lái)試劑的排斥更加明顯，導(dǎo)致了乙硼烷靠近時(shí)需要克服的阻力和能量要多一些、消耗的時(shí)間要長(zhǎng)一些，因此肽鍵的還原速度也就慢一些。此外，霍夫曼降解反應(yīng)只有當(dāng)酰胺的氮原子上連有兩個(gè)氫原子才能發(fā)生，因此酰胺鍵(-CONH2)可以發(fā)生霍夫曼降解而肽鍵(-CONH-)不能發(fā)生；倘若能觀測(cè)到霍夫曼降解的產(chǎn)物，則可以作為分子內(nèi)存在酰胺鍵(-CONH2)更加直接的證據(jù)，更加確鑿地證明萬(wàn)古霉素中含有天冬酰胺(含1個(gè)-CONH2基團(tuán))，而不是像謝爾德里克之前猜測(cè)的含有異天冬酰胺殘基(不含-CONH2基團(tuán))[23]。

這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都給了康斯坦斯·哈里斯預(yù)想之中的結(jié)果。他的猜想是對(duì)的。基于這些事實(shí)，他提出了萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)[24]，如圖1所示。

圖1 萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)

隨著對(duì)結(jié)晶條件的進(jìn)一步摸索，人們得到了純度更高的單晶，后續(xù)的X射線衍射實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了康斯坦斯·哈里斯所提出的結(jié)構(gòu)[25,26]。人們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)古霉素中除了氨基酸的碳中心手性之外，將肽鏈交聯(lián)起來(lái)的芳環(huán)還存在軸手性和大環(huán)阻轉(zhuǎn)面手性這兩種手性類型[27]，并隨即通過(guò)單晶衍射確定了手性軸的絕對(duì)構(gòu)型。根據(jù)這一系列結(jié)果，人們建立了萬(wàn)古霉素的的三維分子模型，完成了從一團(tuán)迷霧，到扁平圖像，再到三維具象的結(jié)構(gòu)建立。自此，萬(wàn)古霉素終于成了一個(gè)有血有肉的分子個(gè)體。

而三維結(jié)構(gòu)的建立也使得萬(wàn)古霉素的殺菌機(jī)理清晰了起來(lái)[28]。人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)古霉素恰好能夠像把“鑰匙”那樣，通過(guò)幾對(duì)氫鍵[29]，將細(xì)菌細(xì)胞中以L-賴氨酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸封端的肽聚糖[30]這把“鎖”緊密地結(jié)合在一起，形成了穩(wěn)定的萬(wàn)古霉素-肽聚糖復(fù)合物。而當(dāng)“鎖”插入“鑰匙”中后，原先肽聚糖“鎖”與“鎖”之間的進(jìn)一步交聯(lián)被抑制了，讓細(xì)菌失去了合成細(xì)胞壁的能力。為了驗(yàn)證這個(gè)作用模型，研究萬(wàn)古霉素的專家威廉姆斯和他的同事一起，在核磁共振氫譜上找到了將“鎖”和“鑰匙”拉在一起的氫鍵[31,32]；后來(lái)謝弗等人[33]又拿出給分子照相的看家本領(lǐng)，用X射線拍到了連接著萬(wàn)古霉素和肽聚糖的氫原子。

5 化身千百

“小萬(wàn)，小萬(wàn)，快醒醒，你又多了一個(gè)弟弟！”自從結(jié)構(gòu)確定、滅菌作用模型確定以來(lái)，萬(wàn)古霉素和他們家族的分子都好像憑空有了靈魂，針對(duì)前一代藥物暴露出的耐藥性、作用模式、副作用等弊端，涌現(xiàn)出一批以小萬(wàn)為骨架的新成員[34]。只不過(guò)因?yàn)槟腿f(wàn)古霉素細(xì)菌的緩慢增加，小萬(wàn)在臨床一線拋頭露面的機(jī)會(huì)少了些，也就常常無(wú)所事事，陷入沉睡。

這會(huì)兒，小萬(wàn)的家族又壯大了，兄弟姐們正在叫他起床呢。小萬(wàn)睜開(kāi)眼一看，圍在他周圍的除了替考拉寧、達(dá)巴萬(wàn)星、奧利萬(wàn)星之外，又多了一個(gè)陌生面孔。他們告訴小萬(wàn)，這個(gè)新成員叫做特拉萬(wàn)星，他除了能夠與肽聚糖前體的末端結(jié)合之外，同時(shí)還能改變細(xì)胞膜的通透性，兩大效應(yīng)協(xié)同作用，殺死革蘭氏陽(yáng)性菌[35]。

小萬(wàn)有些驚訝。這些年里，他每一次醒來(lái)，看到的新成員都會(huì)讓他感慨藥物發(fā)展的速度之快。不知道下一次醒來(lái)，身邊又會(huì)多出哪個(gè)小伙伴呢？

“大概還會(huì)有效果更強(qiáng)、毒副作用更弱的的弟弟妹妹吧?！毕胫胫?，小萬(wàn)又睡了過(guò)去……