永生化人肝細胞中TNK1介導(dǎo)細胞凋亡的機制研究*

黃金羽，韓小瑩，閆 駿，蔣 媛，雷 蕾，林榮團△

(1.Lady Davis Institute,McGill University,Montreal,Canada,H3T 1E2；.天津市第一中心醫(yī)院病理科 300192；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)護理學(xué)院，重慶 400038)

眾所周知，原發(fā)性肝癌是全球第六常見的癌癥類型[1]，但其惡性程度較高，易早期轉(zhuǎn)移，病死率高居第2位，應(yīng)重點關(guān)注。原發(fā)性肝癌最常見的類型為肝細胞癌，有資料顯示約占總病例數(shù)的80%[2]。細胞凋亡是機體為維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主死亡的主動調(diào)控方式，是機體抑制細胞癌變的重要機制之一。在癌細胞中細胞凋亡機制多被破壞，其生長不再受限制，從而形成腫瘤。前期研究已證實，內(nèi)源性途徑是細胞凋亡的主要機制，其關(guān)鍵步驟之一是由B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因調(diào)節(jié)的線粒體外膜通透性增加導(dǎo)致細胞色素C釋放，從而激活下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)，該通路在誘導(dǎo)細胞凋亡過程中至關(guān)重要[3]。酪氨酸激酶非受體1(tyrosine kinase non-receptor 1，TNK1)是目前已被發(fā)現(xiàn)的首個具有抑制腫瘤特性的酪氨酸激酶，TNK1能促進細胞凋亡，并在人胚胎腎細胞HEK293中獲得初步證實，在人胰腺癌細胞中被發(fā)現(xiàn)具有致癌作用，TNK1在不同細胞類型中的功能和作用尚需進行個體化精準研究[4-7]。目前，對TNK1在肝癌細胞中介導(dǎo)細胞凋亡的機制尚少見文獻報道，對該領(lǐng)域的深入研究必要而迫切。但由于前期研究已發(fā)現(xiàn)，人肝癌細胞中TNK1的表達受到明顯抑制，極可能導(dǎo)致其引發(fā)的細胞凋亡途徑無法激活，故本研究選擇同一種屬、同一器官的正常細胞系——人永生化肝細胞作為研究對象進行了實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人永生化肝細胞系IHH購于美國AcceGen Biotechnology公司；人胚胎腎細胞系HEK293、人肝細胞癌細胞系HepG2、Huh7、Huh7.5均購于美國菌種保藏中心。鹽酸多西環(huán)素粉末(#D9891)購于美國Sigma-Aldrich公司；依托泊苷粉末(#E1383)購于美國Sigma-Aldrich公司；線粒體蛋白分離試劑盒 (#89874)購于美國Thermo Fisher Scientific公司；人體組織標本由天津第一中心醫(yī)院病理科閆駿博士提供，免疫組織化學(xué)法試劑盒購于美國Cell Signaling Technology公司，使用的抗體和染色包括anti-Glypican-3 (#ab216606;Abcam)、anti-TNK1 (#PA5-14795;Thermo Fisher Scientific)、H&E Staining Kit (#ab245880;Abcam)等；一抗[anti-TNK1(#4507)、anti-cleaved-PARP(Asp214;#5626S)、anti-caspase-3(#9662)、anti-cleaved-caspase-3(Asp175;#9661S)、anti-caspase-9(#9502)、anti-cleaved-caspase-9(Asp315;#20750S)、anti-Cytochrome c(#11940S)、anti-Bax(#5023S)、anti-Bak(#12105S)、anti-Bcl-2(#15071S)、anti-Bcl-xL(#2764S)、anti-Mcl-1(#94296S)]均購于美國Cell Signaling Technology公司；anti-微管蛋白(sc-5286)購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；anti-β-actin (ABT264)購于美國Millipore公司；Annexin V APC、SYTOXTMGreen試劑盒(#V35113)購于美國Thermo Fisher Scientific公司，BD Fortessa流式細胞分析儀購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1建立IHH rtTA-TNK1細胞模型

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由pTight-TNK1、pMLV-gag-pol、pVSV-G質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)染于HEK293細胞中包裝完成；IHH rtTA-TNK1細胞模型由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染IHH細胞制成。具體步驟：在100 mm細胞盤中鋪入2×106HEK293細胞并培養(yǎng)24 h后用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(#L3000015；Invitrogen)轉(zhuǎn)染6 μg pTight-TNK1、6 μg pMLV-gag-pol、2 μg pVSV-G質(zhì)粒并培養(yǎng)48 h后過濾并收集上清液。在6孔細胞板中鋪入3×105IHH細胞后培養(yǎng)24 h，加入上清液和10 μg/mL Polybrene(#638133；Millipore)并培養(yǎng) 24 h。將細胞轉(zhuǎn)移至100 mm細胞盤中并用 2 μg/mL Puromycin (#A1113803;Thermo Fisher)篩選2周。收集儲存被檢驗多西環(huán)素激活TNK1表達陽性后的存活細胞。

1.2.2多西環(huán)素處理

將多西環(huán)素粉末溶于水中制成多西環(huán)素溶液(1 mg/mL)。將多西環(huán)素溶液加入新鮮培養(yǎng)基至100 ng/mL(或其他指定質(zhì)量濃度)后加入細胞板中，37 ℃處理24 h。

1.2.3依托泊苷處理

將依托泊苷粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成依托泊苷溶液(50 mmol/L)。將依托泊苷溶液加入新鮮培養(yǎng)基至100 μmol/L(或其他指定濃度)后加入細胞板中，37 ℃處理24 h。

1.2.4線粒體分離

收集2×107細胞并在常溫3 000 r/min離心2 min后移除上清液，加入800 μL 試劑A并以中速振蕩5 s后置于冰上處理2 min，加入10 μL 試劑B并以高速振蕩5 s后置于冰上處理5 min且高速振蕩1次，加入800 μL 試劑C來回晃動混勻后4 ℃、2 500 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中于4 ℃、10 000 r/min離心15 min后分離并保存上清液(細胞質(zhì)部分)，用500 μL 試劑C洗滌沉淀(線粒體部分)后10 000 r/min離心5 min移除上清液。分離后樣品加入2×十二烷基硫酸鈉(twelve alkyl sodium sulfate,SDS)上樣緩沖液并進行免疫印跡法處理。

1.2.5免疫組織化學(xué)法

對組織切片進行預(yù)處理，以3%過氧化氫去離子水孵育10 min，用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗；滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS浸泡沖洗3 min，重復(fù)5次；滴加enhancer增強劑，37 ℃處理30 min后PBS浸泡沖洗3 min，重復(fù)5次；滴加通用型免疫球蛋白G抗體，室溫孵育1 h，PBS沖洗3 min，重復(fù)5次；使用二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色；蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明后封片，拍照。

1.2.6免疫印跡法

(1)細胞蛋白制備，收集細胞后以PBS洗滌1次，加入RIPA裂解液50 μL 后置于冰上30 min，并且每10分鐘振蕩破碎1次。4 ℃、13 200 r/min離心15 min后吸取上清液，轉(zhuǎn)入滅菌離心管，測定蛋白濃度并標記，計算上樣量與上樣濃度后用PBS將樣品稀釋至統(tǒng)一濃度并置于-80 ℃保存待用。(2)SDS-聚丙稀酰胺(polyacrylamide，PAGE)電泳，解凍樣品后按已計算出的各樣品1/2體積加入2×SDS上樣緩沖液，充分混勻，在金屬加熱混樣器上將蛋白樣品進行99 ℃加熱處理10 min。按測定的蛋白相對分子質(zhì)量大小制備10%的SDS-PAGE膠，沖洗上樣孔2次后上樣，80 V恒壓電泳，待樣品中溴酚藍條帶遷移到凝膠底部時，終止電泳。(3)電泳轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，預(yù)先制備電泳轉(zhuǎn)移緩沖液，將其放置于4 ℃預(yù)冷，將已完成電泳后的蛋白膠根據(jù)Marker指示按需要切取適當(dāng)大小貼于硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)上，以三明治法兩面覆蓋3層濾紙、趕盡氣泡后使用半干轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)進行半干印跡轉(zhuǎn)移。(4)抗原抗體反應(yīng)，將NC膜浸泡于封閉液[含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBST)液]中，于垂直搖床上室溫封閉1 h后用PBST洗滌5 min，將待檢測蛋白的一抗以1∶1 000比例稀釋于封閉液中并覆蓋在NC膜上，搖床4 ℃過夜孵育。將已完成一抗孵育處理的NC膜用PBST在水平搖床上洗滌3次，每次10 min。將相應(yīng)二抗以1∶3 000(鼠抗)或1∶5 000(兔抗)比例稀釋于封閉液中，覆蓋在NC膜上并置于垂直搖床上室溫孵育1 h后洗膜3次，進行蛋白顯影檢測。

1.2.7流式細胞術(shù)

收集細胞后用PBS洗滌1次，加入1×Annexin V結(jié)合緩沖液后于常溫以4 200 r/min離心3 min并吸走上清液，向底部細胞加入1×Annexin V結(jié)合緩沖液重懸浮并將濃度調(diào)至1×106/mL。取1 mL樣品加入5 μL APC-Annexin V和1 μL SYTOX?Green染色劑，于37 ℃處理15 min，并采用流式細胞儀進行測定。

2 結(jié) 果

2.1 TNK1在人肝細胞癌組織和細胞中的表達均明顯下降

3例患者肝細胞癌組織免疫組織化學(xué)法檢測顯示，蘇木精-伊紅染色標記的細胞核呈藍色，細胞外基質(zhì)呈粉色，顯示了組織切片中細胞的分布趨勢；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC-3) 抗體染色標記的肝細胞癌細胞呈黃褐色，從而區(qū)分了組織切片中的癌組織和正常組織；TNK1抗體染色標記的TNK1蛋白呈淺紅色，癌組織區(qū)域中TNK1表達明顯低于周邊正常組織，見圖1A。免疫印跡法檢測結(jié)果也同樣證實，TNK1在人肝細胞癌細胞系Huh7、Huh7.5、HepG2中的表達程度均明顯低于人肝細胞系IHH對照組，見圖1B。

2.2 多西環(huán)素誘導(dǎo)IHH rtTA-TNK1細胞模型中的細胞凋亡和TNK1表達升高

IHH rtTA-TNK1細胞以0、25、50、100 ng/mL多西環(huán)素處理48 h后行流式細胞測試顯示，細胞凋亡現(xiàn)象(Annexin-V信號陽性)的細胞比例分別為6.4%、24.2%、52.7%、74.7%，見圖2。IHH rtTA-TNK1細胞由100 ng/mL多西環(huán)素處理24 h后經(jīng)細胞裂解處理并進行免疫印跡法檢測TNK1和細胞凋亡相關(guān)蛋白(c-PARP、caspase-3、c-caspase-3、caspase-9、c-caspase-9)表達水平；IHH細胞由100 μmol/L依托泊苷予以相同處理作為陽性對照。結(jié)果顯示，在IHH rtTA-TNK1細胞模型中多西環(huán)素能誘導(dǎo)TNK1表達升高；同時，多西環(huán)素誘導(dǎo)還引起了細胞凋亡相關(guān)c-PARP、c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表達水平提高，見圖3。

A：人肝細胞癌組織免疫組織化學(xué)法檢測；B：免疫印跡法檢測IHH、Huh7、Huh7.5、HepG2細胞系中TNK1和β-actin表達水平。

圖2 多西環(huán)素誘導(dǎo)IHH rtTA-TNK1細胞產(chǎn)生細胞凋亡現(xiàn)象

圖3 在IHH rtTA-TNK1細胞中多西環(huán)素激活生產(chǎn)的TNK1誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)蛋白

2.3 IHH rtTA-TNK1細胞模型中多西環(huán)素誘導(dǎo)表達的TNK1導(dǎo)致Cytochrome C轉(zhuǎn)移

IHH rtTA-TNK1細胞被多西環(huán)素處理后分別通過全細胞溶解和線粒體分離處理，免疫印跡法檢測顯示，在全細胞溶解標本中多西環(huán)素促進TNK1表達而不影響微管蛋白和Cytochrome C的表達。經(jīng)線粒體分離處理后微管蛋白集中在細胞質(zhì)部分而多西環(huán)素處理不影響微管蛋白的分布；多西環(huán)素使TNK1大量出現(xiàn)于線粒體部分，少量出現(xiàn)于細胞質(zhì)部分；未經(jīng)多西環(huán)素處理時Cytochrome C集中在線粒體部分，而多西環(huán)素處理使線粒體和細胞質(zhì)中均檢測到Cytochrome C，見圖4。在IHH rtTA-TNK1細胞模型中多西環(huán)素處理誘導(dǎo)TNK1表達，并使部分Cytochrome C從線粒體轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中。

wcl：全細胞裂解產(chǎn)物;m：線粒體分離產(chǎn)物;c：細胞質(zhì)分離產(chǎn)物。

2.4 IHH rtTA-TNK1細胞模型中多西環(huán)素誘導(dǎo)表達的TNK1能介導(dǎo)Bcl-2家族蛋白水平變化

IHH rtTA-TNK1細胞由100 ng/mL多西環(huán)素處理0、24、48 h后經(jīng)細胞裂解處理并用免疫印跡法檢測Bcl-2家族蛋白(Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)表達水平；IHH細胞由100 μmol/L依托泊苷予以相同處理作為陽性對照。結(jié)果顯示，在IHH rtTA-TNK1細胞模型中多西環(huán)素誘導(dǎo)的TNK1在促進Bak蛋白表達的同時降低了Bcl-xL和Mcl-1蛋白水平，而對Bax和Bcl-2的蛋白表達水平無顯著影響，見圖5。

圖5 在IHH rtTA-TNK1細胞中多西環(huán)素激活生產(chǎn)的TNK1調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達

3 討 論

TNK1是被發(fā)現(xiàn)的首個具有抑癌作用的酪氨酸激酶，通過同源重組生產(chǎn)的TNK1+/-和TNK1-/-小鼠均會自發(fā)地形成腫瘤，另外在患有彌漫性大B細胞淋巴瘤的小鼠中TNK1表達水平顯著下降[4]。然而，TNK1也可幫助腫瘤形成。LIERMAN等[6]使用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變掃描鑒定TNK1為致癌基因。另外也有研究證明，TNK1對霍奇金淋巴瘤細胞和胰腺癌細胞的生存和生長至關(guān)重要[7-8]。因此，確認TNK1在人肝細胞癌細胞中具有抑癌或致癌作用是必要的。本研究免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法檢測均證明了TNK1在人肝細胞癌細胞和組織中的表達水平明顯低于正常細胞組織(圖1)，證實TNK1在人肝組織中應(yīng)扮演著抑癌角色，另外TNK1也據(jù)此可能作為未來診斷早期人肝細胞癌的重要生物標志物。

多西環(huán)素屬常見四環(huán)素類抗菌藥物，具有抗感染、抗腫瘤等作用，其機制主要為抑制磷酸化哺乳動物雷帕霉素(phosphorylated mammalian target of rapamycin，P-mTOR)水平[9]。本研究構(gòu)建了IHH rtTA-TNK1細胞系，多西環(huán)素可激活其tet-on基因表達系統(tǒng)，從而使細胞表達TNK1。依托泊苷可與DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ結(jié)合，使DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的瞬間鏈的斷裂難以修復(fù)，導(dǎo)致細胞產(chǎn)生依托泊苷劑量依賴性DNA損傷，促進細胞凋亡[10]。因此，本研究將依托泊苷作為誘導(dǎo)劑，促使細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象，從而作為陽性對照。本研究流式細胞法和免疫印跡法檢測均證明，在人肝細胞中TNK1過表達能使Annexin V信號呈陽性并誘導(dǎo)產(chǎn)生c-caspase-3和c-PARP，因此，TNK1可激活人肝細胞的凋亡程序(圖2、3)，鑒于細胞凋亡是抑制腫瘤產(chǎn)生和治療癌癥的重要機制之一，結(jié)合免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果，作者認為TNK1在人肝組織中具有抑癌作用的結(jié)論成立，未來可通過過表達TNK1激活細胞凋亡程序抑制肝癌細胞增殖。但本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)含IHH基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的正常IHH肝細胞TNK1表達無法通過蛋白印跡法被檢測出來(圖3)，同樣未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的正常肝細胞TNK1表達也未能順利被檢出來(圖5)，作者認為這是由于激活TNK1后IHH細胞出現(xiàn)凋亡，導(dǎo)致收樣細胞的總量大幅下降、樣品蛋白濃度較低，為保持上樣量的統(tǒng)一，圖3、5的對照組上樣蛋白總量相對圖1組織蛋白總量較低所致。

內(nèi)源性通路和外源性通路是激活細胞凋亡的主要機制[3,11]，其中內(nèi)源性通路的核心機制是由Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)的線粒體外膜通透性提高導(dǎo)致線粒體中促凋亡酶被釋放進細胞質(zhì)，最終激活caspase-9并形成c-caspase-9[3,12-13]。本研究為確認TNK1是否通過內(nèi)源性通路激活細胞凋亡，檢測了TNK1對內(nèi)源性通路內(nèi)重要蛋白的影響：(1)TNK1表達激活并切割了caspase-9從而產(chǎn)生了內(nèi)源性通路的重要終產(chǎn)物——c-caspase-9(圖3)；(2)TNK1促使線粒體中Cytochrome C被釋放到細胞質(zhì)中(圖4)；(3)TNK1上調(diào)了Bak并下調(diào)了Bcl-xL和Mcl-1蛋白水平，而不影響B(tài)ax和Bcl-2的表達(圖5)。在Bcl-2家族蛋白中促凋亡的Bax和Bak與抗凋亡的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1相互平衡，進而調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性[14]。

綜上所述，在人肝細胞中TNK1通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白中Bak、Bcl-xL和Mcl-1的平衡，提高了線粒體外膜通透性，進而使Cytochrome C轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)并激活caspase-9，最終導(dǎo)致細胞凋亡。2015年常虹等[15]研究表明，三氧化二砷聯(lián)合丹參酮膠囊能通過明顯抑制細胞增殖、提高凋亡率、顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2等表達、上調(diào)c-caspase-9等促凋亡蛋白表達等機制影響肝癌細胞的增殖和凋亡，TNK1在人肝細胞中通過內(nèi)源性通路激活細胞凋亡上述機制研究也或可為新型抗肝癌藥物的開發(fā)提供一種新思路。