一株蚯蚓腸道固氮菌的分離及鑒定

梁 珍，李林輝

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002)

氮素是土壤中利于植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)元素之一，氮素缺乏將會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素、蛋白質(zhì)、酶等化合物合成減少，抑制光合作用并影響植物生長(zhǎng)[1]。土壤中可利用的氮素十分有限，不能最大限度滿足作物的高產(chǎn)需求。施用化學(xué)氮肥是目前提高土壤含氮量最普遍的方法，但其過多的施用會(huì)導(dǎo)致地下及地表水污染，破壞河流生態(tài)環(huán)境，還會(huì)使得土壤酸化，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分大量流失，除此之外還會(huì)通過反硝化作用增加N2O的量，加劇溫室效應(yīng)[2]。與施用化學(xué)氮肥相比，生物固氮的安全性及有效性更高，有利于土壤的安全性及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。目前生物固氮微生物類群很多，除了根瘤菌依賴于豆科作物外[4]，其他固氮菌的固氮能力嚴(yán)重依賴于環(huán)境條件，環(huán)境不適宜時(shí)，很難有預(yù)期的效果。然而動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如果有固氮能力，效果是可預(yù)期的。蚯蚓作為“土壤生態(tài)系統(tǒng)工程師”，不僅對(duì)土壤生物修復(fù)及物質(zhì)循環(huán)有重要作用，其腸道獨(dú)特的厭氧狀態(tài)和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也為厭氧和兼性厭氧菌提供了有利的微環(huán)境。有研究報(bào)道蚯蚓腸道內(nèi)含有固氮菌[5]，但對(duì)其種類、固氮效果等鮮有報(bào)道。因此研究蚯蚓腸道固氮菌，對(duì)蚯蚓腸道內(nèi)固氮微生物的開發(fā)與利用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蚯蚓來源 采集自西華師范大學(xué)校園。

1.1.2 培養(yǎng)基Ashby無氮培養(yǎng)基參考《一株固氮菌的篩選、鑒定及混菌發(fā)酵制備復(fù)合型菌糠菌肥的研究》[6]。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓腸道固氮菌的分離 參考李森楠等人的操作方法[7]。略有改動(dòng)，獲得蚯蚓腸道內(nèi)容物后將其接種于Ashby無氮培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑取生長(zhǎng)最旺盛的單菌落繼續(xù)純化培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)接四次，最終獲得一株純化菌株，將其命名為006。

1.2.2 固氮菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：在培養(yǎng)基中觀察菌株菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察菌株菌體形態(tài)。

生理生化鑒定：對(duì)分離出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)，接觸酶實(shí)驗(yàn)，甲基紅試驗(yàn)，含碳化合物(甘露醇，鼠李糖，麥芽糖，半乳糖)的利用試驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，纖維素分解實(shí)驗(yàn)[8]。

分子鑒定：提取分離菌株006全基因組DNA，以其為模板，用引物27F(5-’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)擴(kuò)增16SrDNA，用引物P1(5’-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG-3‘)和P2(5’-CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC-3’)擴(kuò)增固氮酶nifH基因[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

固氮酶基因nifH檢測(cè)：將引物P1、P2擴(kuò)增到的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)。

固氮菌16SrDNA 片段序列分子系統(tǒng)學(xué)分析：將引物27F、1492R擴(kuò)增到的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，并選取相似度高的菌株以及同一菌群內(nèi)知名度高的菌株作為參考菌株，用 MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育建樹，其分析方法采用鄰接法(NJ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌的經(jīng)典鑒定

形態(tài)學(xué)特征：細(xì)菌006在Ashby無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、白色、半透明、光滑、濕潤(rùn)、易挑取，光學(xué)顯微鏡下菌體呈短桿狀，單個(gè)排列。

生理生化特性分析：見表1。

表1 生理生化特征分析

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]，初步鑒定該菌屬于克雷伯氏菌屬。

2.2 nifH基因檢測(cè)

以細(xì)菌006總DNA為模板，擴(kuò)增nifh基因，擴(kuò)增出大約300bp的片段，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該片段序列與Klebsiella sp. TD153S 固氮酶還原酶基因(nifH)相似性達(dá)100%，可以確定該菌含固氮酶nifH基因，該菌屬于固氮菌。

2.3 固氮菌16SrDNA 片段序列分子系統(tǒng)學(xué)分析

用引物擴(kuò)增固氮菌006 16SrDNA序列，擴(kuò)增出1300bp左右的片段，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與Klebsiella variicola(NR_025635.1)親緣關(guān)系最近，其相似性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析及生理生化特征分析， 將該固氮菌鑒定為變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 固氮菌16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

蚯蚓作為生態(tài)系統(tǒng)中的分解者及消費(fèi)者，與土壤密切相關(guān)，土壤為蚯蚓提供棲息地，而蚯蚓的日?；顒?dòng)改善土壤的結(jié)構(gòu)、滲透性、能量流動(dòng)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[10]。蚯蚓腸道菌在維持蚯蚓的新陳代謝、對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和污染物的轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。Biswas等人從蚯蚓腸道中分離出的巨大芽孢桿菌菌株、地衣芽孢桿菌菌株和溶血葡萄球菌菌株能通過使重金屬離子和磷酸鹽形成復(fù)合物來降低Cu2+和Zn2+的毒性[11]。Huerta等人則發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道內(nèi)含有可分解微塑料的細(xì)菌，如厚壁菌門細(xì)菌、芽孢桿菌和放線菌，它們通過將微塑料當(dāng)做碳源來代謝低密度聚乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯[12]，從而對(duì)微塑料污染物進(jìn)行降解。而本文從校園土壤蚯蚓腸道中獲得的固氮菌——變棲克雷伯氏菌，歸屬于變形菌門克雷伯氏菌屬，兼性厭氧，具有固氮作用。該類細(xì)菌屬于聯(lián)合固氮菌，不僅在固氮方面發(fā)揮重要作用，在溶磷、解鉀、生物防治、作為鐵載體及環(huán)境污染物降解等方面都有重要作用[13]，并被廣泛應(yīng)用于甘蔗[14]、禾麥苗[15]的聯(lián)合固氮中。此前也有從環(huán)境中分離得到變棲克雷伯氏菌[16]的例子，但環(huán)境的不穩(wěn)定會(huì)對(duì)細(xì)菌的活力和聯(lián)合固氮力有影響。本文的固氮菌是從蚯蚓腸道中分離得到的，我們驗(yàn)證了它的固氮能力并確定了它的分類學(xué)地位，為以后將固氮菌回植到蚯蚓腸道中，使其發(fā)揮穩(wěn)定的固氮能力打下了基礎(chǔ)。今后我們還需進(jìn)一步探索變棲克雷伯氏菌的固氮能力以及將其回植到蚯蚓腸道內(nèi)的可行性、最佳接種量、最佳接種條件等。