分泌型Klotho蛋白抑制腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究

孟凡航?陳秋源?顧世杰?崔瑞文?曹榮華

【摘要】目的 研究分泌型Klotho蛋白抑制腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，為治療慢性腎臟病提供理論基礎(chǔ)和新思路。方法 通過單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)C57BL/6小鼠腎纖維化，并分5組處理：假手術(shù)[Sham+磷酸鹽緩沖液（PBS）]組、模型（UUO+PBS）組、UUO+Klotho組、UUO+Klotho+胰島素組、UUO+Klotho+胰島素樣生長因子-1（IGF-1）組。檢測小鼠左腎組織活性氧水平，并用HE及Masson染色評估腎臟病理改變及纖維化程度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法以及免疫熒光化學(xué)檢測腎組織中超氧化物歧化酶2 （SOD2）、纖連蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)水平，此外用蛋白免疫印跡法檢測磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、AKT、磷酸化磷脂酰肌醇（-3）激酶（p-PI3K）、PI3K、胰島素受體底物-1（IRS-1）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 成功建立了UUO小鼠模型。與UUO+PBS組比較，UUO+Klotho組小鼠腎組織的纖維化緩解（P

【關(guān)鍵詞】Klotho蛋白;胰島素受體底物-1/磷脂酰肌醇（-3）激酶/蛋白激酶B信號通路;腎間質(zhì)纖維化;慢性腎臟病

Soluble Klotho attenuates unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis in mouse models Meng Fanhang， Chen Qiuyuan， Gu Shijie， Cui Ruiwen， Cao Ronghua. Department of Organ Transplantation， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China Corresponding author， Meng Fanhang， E-mail： mmandcc123@126.com

【Abstract】Objective To investigate the mechanism of soluble Klotho in inhibiting renal interstitial fibrosis， and provide theoretical evidence and novel ideas for the treatment of chronic kidney disease. Methods C57BL/6 mouse models with renal fibrosis were established by unilateral ureteral obstruction （UUO） and divided into five groups： Sham+PBS， UUO+PBS， UUO+Klotho， UUO+Klotho+insulin， and UUO+Klotho+insulin-like growth factor （IGF）-1 groups. The reactive oxygen species （ROS） level in the left kidney was detected. The renal pathological changes and fibrosis were assessed by HE and Masson staining. The expression levels of superoxide dismutase 2 （SOD2）， fibronectin and α-smooth muscle actin （α-SMA） in the renal tissues were measured by qRT-PCR， Western blot and immunofluorescence assay， respectively. In addition， the expression levels of p-AKT， AKT， p-PI3K， PI3K and IRS proteins were also assessed by Western blot. Results The UUO mouse models were successfully established. Compared with the UUO+PBS group， the renal fibrosis was significantly alleviated， the expression levels of fibronectin and α-SMA mRNA and proteins were significantly down-regulated （all P < 0.001）， whereas those of SOD2 mRNA and protein were considerably up-regulated （both P < 0.001） in the UUO+Klotho group. Insulin and IGF-1 treatment activated the IRS-1/PI3K/Akt signaling pathway in the renal tissues and impaired the protective role of Klotho upon the UUO-induced renal fibrosis （both P < 0.001）. Conclusion Klotho can alleviate renal fibrosis by inhibiting the IRS-1/PI3K/Akt signaling pathway in the UUO-induced mouse models.

【Key words】Klotho protein; IRS-1/PI3K/Akt signaling pathway; Renal interstitial fibrosis;?Chronic kidney disease

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟?。–KD）發(fā)展到終末尿毒癥期的共同途徑[1]。它以過量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征[2]。因此，抑制成纖維細(xì)胞增生、分化以及腎小管上皮細(xì)胞重塑是治療CKD的重要途徑[3]。腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的分泌型Klotho是一種激素樣物質(zhì)，可以進(jìn)入血液循環(huán)作為體液因子調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能[4]。有研究表明，敲除Klotho小鼠的腎臟出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化[5]。Satoh等（2012年）報(bào)道Klotho可以保護(hù)腎臟功能，延緩腎臟衰老。但在CKD中，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探明[6]。有報(bào)道胰島素/胰島素樣生長因子-1（IGF-1）信號通路參與CKD進(jìn)展[7-8]。Bartke等（2006年）明確Klotho可通過抑制胰島素/IGF-1信號通路增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，發(fā)揮抗衰老特性。Klotho能否通過抑制胰島素/IGF-1信號通路減輕CKD尚需進(jìn)一步研究。本研究旨在闡明這一機(jī)制，為腎纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供新的理論。

對象與方法

一、試劑及儀器

1.主要試劑

包括：重組小鼠Klotho（aa 35-982）蛋白（純度 > 90%）和重組小鼠IGF-1蛋白（純度 > 97%），購自美國R&D公司;胰島素，購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司。組織活性氧（ROS）檢測試劑盒購自百奧萊博公司;HE染色試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司;Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;抗體蛋白激酶B（AKT）、磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）、胰島素受體底物-1（IRS-1）、磷酸化AKT（p-AKT）均購自美國CST公司;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體購自博士德生物工程有限公司;纖連蛋白（Fibronectin）抗體購自美國Sigma公司;p-PI3K抗體購自美國Bioworld公司;超氧化物歧化酶2（SOD2）抗體購自美國Abcam公司;GAPDH抗體購自美國Proteintech公司;RNA提取試劑Trizol購自荷蘭MRC公司; M-MLV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司;高靈敏性染料法熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） 檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BeyoECL Plus （超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒）、DAPI均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白免疫印跡法二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG （H+L）及辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠（H+L）均購自美國Jackson公司;免疫熒光二抗Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自美國Invitrogen公司。

2.主要儀器

包括：HemaTGL-16R冷凍高速離心機(jī)，ABI StepOne Plus Real-time Quantitative PCR儀，Diatek DR-200Bs酶標(biāo)儀，Tanon EPS-300蛋白電泳儀、VE-180蛋白電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽，其林貝爾TS-2000A脫色搖床。

二、動(dòng)物造模及取材

25只8周齡的雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)前于無特定病原體（SPF）級環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。參照王利華等（2007年）與Kurosu等（2008年）的方法進(jìn)行單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠造模及相應(yīng)的處理。小鼠隨機(jī)分為5組，每組各5只：假手術(shù)[Sham+磷酸鹽緩沖液（PBS）]組、模型（UUO+PBS）組、UUO+Klotho組、UUO+Klotho+胰島素組、UUO+Klotho+IGF-1組。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣州永諾醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，并取得該中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn) （批件號IACUC

-G16038）。UUO+PBS組小鼠用1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）

腹腔注射麻醉后，右側(cè)臥位固定、靠近背部切1.5 cm左右切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層以暴露左側(cè)輸尿管，并用用眼科彎鑷托起左側(cè)輸尿管中段部位并固定，在左側(cè)輸尿管的兩端用絲線結(jié)扎2次，于近腎盂段處剪斷，最后將輸尿管送回腹腔，止血后關(guān)腹，待小鼠蘇醒后，腹腔注射200 μl PBS，此后每隔48 h注射1次，持續(xù)2周。Sham+PBS組小鼠僅進(jìn)行麻醉、腹部切口和游離左側(cè)輸尿管，不進(jìn)行輸尿管的結(jié)扎和剪斷，手術(shù)后與模型組在同一時(shí)間予腹腔注射PBS。UUO+Klotho組小鼠在UUO手術(shù)造模后，在同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射0.01 mg/kg的Klotho。UUO+Klotho+胰島素組小鼠在UUO手術(shù)造模后，在同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射0.01 mg/kg的Klotho與0.5 U /kg的胰島素。UUO+Klotho+IGF-1組小鼠在UUO手術(shù)造模后，在同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射0.01 mg/kg的Klotho外，每日于同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射1083 ng/kg的IGF-1。2周后處死小鼠，取左側(cè)梗阻腎臟，沿冠狀面縱行剖開，平均分成4份，分別用于以下檢測：1/4新鮮組織用于測腎組織中ROS含量;1/4新鮮組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片并進(jìn)行HE、Masson及免疫熒光化學(xué)染色;1/4 新鮮組織提取蛋白并進(jìn)行蛋白免疫印跡法檢測;1/4新鮮組織用于qRT-PCR檢測。

三、ROS檢測

根據(jù)ROS試劑盒說明書檢測各組小鼠（每組n = 5）左腎組織中的ROS水平。

四、HE染色

根據(jù)ROS結(jié)果選擇3個(gè)樣本進(jìn)行石蠟包塊并切片（厚4 μm），然后用HE試劑進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察10個(gè)視野的組織形態(tài)。

五、Masson染色

將腎組織的石蠟包塊進(jìn)行切片，用Masson染色試劑盒進(jìn)行Masson染色并拍照。Masson染色藍(lán)色區(qū)域?yàn)槟z原纖維，用以評價(jià)腎臟纖維化嚴(yán)重程度。采用Mizuguchi等（2004年）與左川等（2009年）描述的方法，將Masson染色的每例切片選取10個(gè)不重復(fù)的200倍視野，以藍(lán)色膠原沉積為陽性信號，計(jì)算藍(lán)染面積占整個(gè)視野的百分比，從而得出腎間質(zhì)膠原面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積（去除腎小管管腔）的比值，取其平均值為每例切片的腎間質(zhì)相對面積。

六、qRT-PCR

首先通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索SOD2、纖連蛋白、α-SMA和內(nèi)參GAPDH的序列，然后設(shè)計(jì)并于上海生工生物有限公司合成引物，引物序列見表1。然后根據(jù)TRIzol試劑說明書提取左腎組織的總RNA，并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA。再根據(jù)qPCR試劑盒說明書于StepOne Plus儀上檢測左腎組織中上述基因的Ct值（每組n = 5），根據(jù)2-△△Ct法得到各基因的相對表達(dá)量。

七、蛋白免疫印跡法

蛋白免疫印跡法檢測左腎組織中SOD2、纖連蛋白、α-SMA、IRS-1、p-Akt、AKT、p-PI3K、PI3K的蛋白表達(dá)量（每組n = 5混樣檢測）?？贵w稀釋比例分別為：GAPDH（1∶8000），AKT（1∶2000），PI3K（1∶2000），纖連蛋白（1∶1000），α-SMA（1∶1000），IRS-1（1∶1000），p-AKT（1∶2000），p-PI3K（1∶1000），SOD2（1∶5000）。用Image J 1.8.0軟件分析蛋白條帶的光密度值，以GAPDH的光密度值作為內(nèi)參照，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)相對值。

八、免疫熒光化學(xué)檢測（IF）

IF分析SOD2、纖連蛋白、α-SMA的表達(dá)，具體如下：將制作好經(jīng)石蠟包埋的小鼠左腎組織切片，分別與SOD2、纖連蛋白、α-SMA抗體在4 ℃過夜孵育。 然后將玻片用相應(yīng)的二抗染色，在37℃下孵育1 h，并使用DAPI進(jìn)行核染色，用顯微鏡上將載玻片可視化。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad 6.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并做圖。連續(xù)正態(tài)分布數(shù)據(jù)以? 表示，采用單因素方差分析與Bonferroni檢驗(yàn)分析各組間（UUO+PBS組與Sham+PBS組相比，UUO+Klotho組與UUO+PBS組相比，UUO+Klotho+胰島素組與UUO+PBS組相比，UUO+Klotho+IGF-1組與UUO+PBS組相比，UUO+Klotho+胰島素組與UUO+ Klotho組相比，UUO+Klotho+IGF-1組與UUO+ Klotho組相比） 差異。P值或校正P值< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié)果

一、Klotho表達(dá)對UUO模型小鼠ROS水平的影響

5組小鼠左腎組織中的ROS水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 36.840，P < 0.001）。與Sham+PBS組相比，UUO+PBS組的ROS上調(diào)（t = 10.860，校正P < 0.001）。UUO+Klotho組、UUO+ Klotho+胰島素組與UUO+Klotho+IGF-1組ROS水平均比UUO+PBS組降低（t = 10.540，校正P < 0.001;t = 7.836，校正P < 0.001;t = 7.613，校正P

二、Klotho對UUO誘導(dǎo)小鼠腎臟纖維化的影響

5組小鼠腎纖維化評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 238.000，P < 0.001）。造模后14 d，與Sham+PBS組相比，UUO+PBS組小鼠左側(cè)腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的腎小管擴(kuò)張萎縮、上皮細(xì)胞變性壞死，腎間質(zhì)膠原沉積增多（t = 25.390，校正P <

0.001）。與UUO+PBS組相比，UUO+ Klotho、UUO+Klotho+IGF-1組小鼠左腎組織病變及膠原沉積現(xiàn)象明顯改善（t = 15.990，校正P < 0.001;t = 4.179，校正P = 0.011）;而UUO+ Klotho +胰島素組與UUO+PBS組相比，雖然左腎組織病變（圖2A）及膠原沉積（圖2B）情況減弱，但不明顯（t = 1.567，校正P = 0.889）。UUO+Klotho+胰島素組和UUO+Klotho+ IGF-1組小鼠左側(cè)腎臟病變及膠原沉積相比UUO+Klotho組增高（t = 14.420，校正P < 0.001;t = 11.810，校正P

三、Klotho對UUO誘導(dǎo)小鼠纖連蛋白、α-SMA和SOD2的影響

5組左腎組織中纖連蛋白（mRNA F = 14.630，P < 0.001;蛋白F = 603.200，P < 0.001）、α-SMA（mRNA F = 29.330，P < 0.001;蛋白F = 1164.000，P < 0.001）及SOD2（mRNA F = 15.670，P < 0.001;蛋白F = 1334.000，P < 0.001）的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與Sham+PBS組相比，UUO+PBS組纖連蛋白（mRNA t = 5.007，校正P < 0.001;蛋白t = 45.290，校正P < 0.001）與α-SMA（mRNA t = 8.884，校正P < 0.001;蛋白t = 60.300，校正P < 0.001）表達(dá)上調(diào)，SOD2表達(dá)降低（mRNA t = 7.273，校正P < 0.001;蛋白t = 41.040，校正P < 0.001），見圖3、4。

與UUO+PBS組相比，UUO+ Klotho組α-SMA mRNA表達(dá)水平下調(diào)（t = 6.746，校正P < 0.001），SOD2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（t = 5.276，校正P < 0.001）。纖連蛋白（t = 32.000，校正P < 0.001）、α-SMA（t = 33.180，校正P < 0.001）蛋白表達(dá)水平下調(diào)，SOD2蛋白表達(dá)水平上調(diào)（t = 21.390，校正P < 0.001），見圖3、4。

與UUO+ Klotho組相比，UUO+ Klotho +胰島素組纖連蛋白（t = 3.363，校正P = 0.024）與α-SMA（t = 5.415，校正P < 0.001）mRNA表達(dá)水平上調(diào)，SOD mRNA基因表達(dá)水平下調(diào)（t = 3.049，校正P = 0.046）。纖連蛋白（t = 11.400，校正P < 0.001）、α-SMA（t = 17.320，P < 0.001）蛋白表達(dá)水平下調(diào)，SOD2蛋白表達(dá)水平上調(diào)（t = 23.340，校正P < 0.001），見圖3、4。

與UUO+ Klotho組相比，UUO+ Klotho +IGF-1組纖連蛋白（t = 4.003，校正P = 0.006）與α-SMA（t = 4.415，校正P = 0.002）mRNA表達(dá)水平上調(diào)。纖連蛋白（t = 18.850，校正P < 0.001）和α-SMA（t = 26.090，校正P < 0.001）蛋白表達(dá)水平下調(diào)，SOD2蛋白表達(dá)水平上調(diào)（t = 48.660，校正P < 0.001） ，見圖3、4。

與Sham+PBS組相比，UUO+PBS組的纖連蛋白與α-SMA熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而SOD2熒光強(qiáng)度減弱。與UUO+PBS組相比，UUO+Klotho減弱了纖連蛋白與α-SMA熒光強(qiáng)度，但增加了SOD2熒光強(qiáng)度。與UUO+Klotho相比，UUO+Klotho+

胰島素與UUO+Klotho+IGF-1組的纖連蛋白與α-SMA熒光強(qiáng)度增加，而SOD2熒光強(qiáng)度減弱，見圖5。

四、Klotho對IRS-1/PI3K/Akt信號通路的影響

5組小鼠p-AKT/AKT（F = 2310.000，P < 0.001）、p-PI3K/PI3K（F = 31.230，P < 0.001）和IRS（F =?620.300，P < 0.001）比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Sham+PBS組相比，UUO+PBS組p-AKT/AKT（t = 63.130，校正P < 0.001）、p-PI3K/PI3K（t = 46.530，校正P < 0.001）、IRS（t = 6.721，校正P

討論

UUO模型是一種腎纖維化體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚9-10]。本研究先根據(jù)文獻(xiàn)建立了UUO誘導(dǎo)腎纖維化小鼠模型。UUO小鼠腎臟明顯損傷，表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張萎縮、上皮細(xì)胞變性壞死，腎纖維化明顯;然后采用qRT-PCR、蛋白免疫印跡法及IF檢測關(guān)鍵腎纖維化因子α-SMA及纖連蛋白，結(jié)果顯示子α-SMA及纖連蛋白表達(dá)均明顯增高，抗氧化因子SOD2的表達(dá)明顯下降。SOD2的高表達(dá)反映了較好的線粒體功能和抗ROS能力，UUO模型中SOD2的表達(dá)降低，說明腎臟的線粒體功能及抵抗氧化應(yīng)激能力下降[19]。上述結(jié)果說明成功建立了UUO誘導(dǎo)腎纖維化小鼠模型。

本研究顯示Klotho可以抑制腎纖維化的進(jìn)展，減緩CKD進(jìn)展，降低纖維化因子α-SMA、纖連蛋白的表達(dá)，促進(jìn)抗氧化性因子SOD2的表達(dá)，說明Klotho對腎臟的保護(hù)機(jī)制，與既往報(bào)道一致[11]。

IRS-1是胰島素信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，胰島素和IGF-1均可以激活下游IRS/PI3K/Akt通路參與腎臟纖維化的進(jìn)程[13-14]。為了驗(yàn)證Klotho是否通過這一條通路發(fā)揮保護(hù)功能，本研究進(jìn)一步檢測了該通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示Klotho處理的UUO小鼠模型的腎臟p-AKT、p-PI3K及IRS的表達(dá)水平降低，胰島素與Klotho同時(shí)處理UUO模型的小鼠腎臟相比Klotho單獨(dú)處理的UUO小鼠腎臟p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、IRS水平升高，說明胰島素激活了腎臟中的IRS-1/PI3K/Akt信號通路，IGF-1與Klotho同時(shí)處理UUO模型的小鼠腎臟相比Klotho單獨(dú)處理的UUO小鼠p-AKT/AKT和IRS水平升高，說明胰島素激活了腎臟中的IRS-1/Akt信號通路，胰島素與IRS-1都導(dǎo)致明顯的小鼠腎臟損傷，而Klotho抑制IRS-1/PI3K/Akt信號通路減輕腎臟的損傷。本研究證實(shí)Klotho可能通過抑制IRS-1/PI3K/Akt信號通路實(shí)現(xiàn)對腎臟的保護(hù)作用。為進(jìn)一步明確該機(jī)制，后續(xù)將在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中加入IRS-1/PI3K/Akt信號通路的抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究成功建立UUO小鼠腎損傷模型，并證實(shí)Klotho可能通過抑制UUO小鼠模型腎臟中胰島素下游IRS-1/PI3K/Akt信號通路從而緩解腎臟的纖維化，實(shí)現(xiàn)其對腎臟的保護(hù)作用。由此可見，Klotho可作為腎纖維化中IRS-1/PI3K/Akt信號通路上的潛在治療手段。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-03-23）

（本文編輯：林燕薇）