細(xì)菌反硝化法測(cè)試硝酸鹽氮、氧同位素的研究與應(yīng)用

崔坤磊,尹希杰,李艷利,楊海麗,裴盛祥,蘇 靜

(1.河南理工大學(xué),河南 焦作454000; 2.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門361005)

隨著時(shí)代的進(jìn)步和科技的發(fā)展, 在全球范圍內(nèi), 對(duì)氮污染的關(guān)注不斷提高, 越來越多的人認(rèn)為其是繼生物多樣性減少和全球變暖之后的第三大環(huán)境問題[1]。水體生態(tài)系統(tǒng)由于活性氮的過量輸入而遭到污染, 會(huì)導(dǎo)致河口、沿海和地表水體的富營(yíng)養(yǎng)化以及季節(jié)性缺氧問題, 還會(huì)威脅到飲用水的安全[2-4]。測(cè)定水體中硝酸鹽的氮、氧同位素組成, 能夠?qū)ο跛猁}的來源進(jìn)行示蹤, 可以更準(zhǔn)確地指示其遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律, 為水體氮循環(huán)研究提供更為豐富和準(zhǔn)確的信息,從而制定出更具有針對(duì)性的應(yīng)對(duì)措施[5]。

目前國(guó)內(nèi)能夠?qū)ο跛猁}中氮、氧同位素同時(shí)測(cè)定的前處理方法有離子色譜法[6-8]、化學(xué)轉(zhuǎn)化法[9-13]和細(xì)菌反硝化法[14-19]。其中, 離子色譜法容易受到樣品中溶解性有機(jī)物的干擾, 不適用于高鹽度樣品，并且所需樣品量較大[5,8,20-22]; 化學(xué)轉(zhuǎn)化法則需要借助重金屬鎘和具有高毒性、爆炸性試劑疊氮化鈉對(duì)硝酸鹽進(jìn)行還原, 環(huán)境友好性較差[10,12,23]; 細(xì)菌反硝化法則是選用自然界中已經(jīng)存在的特定反硝化細(xì)菌[缺少氧化亞氮(N2O)還原酶], 直接對(duì)樣品進(jìn)行生物處理, 反應(yīng)過程安全高效, 成本低廉, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不涉及有毒試劑使用, 是當(dāng)前硝酸鹽氮、氧同位素同時(shí)測(cè)定的一種主要測(cè)試方法[14,18-20,22,24-25], 只是該方法在前期準(zhǔn)備期間需要涉及微生物培養(yǎng)方面的專業(yè)設(shè)備和知識(shí), 導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定的限制[20,24,26-27]。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)3種自然水體(海水、湖水和自來水), 在不同時(shí)間采用細(xì)菌反硝化法進(jìn)行了3個(gè)批次硝酸鹽氮、氧同位素的重復(fù)性分析測(cè)定, 來驗(yàn)證該方法對(duì)不同類型樣品中硝酸鹽氮、氧同位素測(cè)定的適用性, 以及較長(zhǎng)測(cè)試周期內(nèi)測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性, 希望能夠?yàn)榧?xì)菌反硝化法測(cè)定硝酸鹽氮、氧同位素技術(shù)在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種選擇與實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)所采用的試劑配制及實(shí)驗(yàn)條件主要是在前人的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)論綜合得出。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

主要實(shí)驗(yàn)儀器有MAT 253穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(Thermo Fisher公司)、Gas-Bench連續(xù)流氣體引入裝置、兩級(jí)液氮冷阱預(yù)富集裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器(CTC analytics Pal)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

主要培養(yǎng)基和試劑包括：胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、KNO3(GR)、KH2PO4(GR)、(NH4)2SO4(GR)、NH4Cl(GR)、磺胺、N-(1-萘基)乙二胺、NaOH(GR)、HCl(GR)、消泡劑(美國(guó)Sigma公司)等。

1.4 試劑配制

1%磺胺溶液：稱取磺胺1.0 g溶于100 mL 3 mol/L HCl中, 充分混勻后冷藏保存。

0.02%萘基乙二胺溶液：稱取N-(1-萘基)乙二胺0.02 g 溶于100 mL超純水中, 用棕色試劑瓶或用錫紙包裹, 冷藏保存。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

將復(fù)壯后的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 待菌液通過顯色檢驗(yàn)后, 濃縮分裝, 然后使用高純N2進(jìn)行吹掃, 將解凍后的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品用氣密性注射器加入到菌液中進(jìn)行過夜反應(yīng), 次日加入NaOH終止反應(yīng)并吸收CO2, 然后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生的N2O氣體進(jìn)行上機(jī)測(cè)定, 分析其氮、氧同位素組成。具體實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示。

圖1 細(xì)菌反硝化法實(shí)驗(yàn)流程

1.6 硝酸鹽氮氧標(biāo)準(zhǔn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液是以IAEA認(rèn)證的USGS-32(δ15NAir=+180‰, δ18OV-SMOW=+25.7‰)和USGS-34(δ15NAir=-1.8‰, δ18OV-SMOW=-27.9‰)兩種硝酸鉀同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制出母液, 再將兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)母液以體積比1∶3、2∶2和3∶1混合, 然后再加上兩種純的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液, 從而得到了5種氮氧同位素豐度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(δ15NAir分別為-1.8‰、43.65‰、89.1‰、134.55‰和180‰, δ18OV-SMOW分別為-27.9‰、-14.5‰、-1.1‰、12.3‰和25.7‰)。

2 結(jié)果與討論

2.1 建立硝酸鹽氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線

如圖2和表1所示, 2019年7月28日、8月19日、8月26日不同時(shí)間進(jìn)行的3個(gè)批次的細(xì)菌反硝化法實(shí)驗(yàn), 分別對(duì)5種不同氮氧同位素豐度的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了轉(zhuǎn)化處理和同位素分析測(cè)定, 對(duì)于每批次內(nèi)同一豐度樣品設(shè)置了5個(gè)平行對(duì)照組(n= 5), 取其平均值, 然后按照以下公式分別擬合得到了與3批次實(shí)驗(yàn)相對(duì)應(yīng)的氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線方程：

表1 3個(gè)批次硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)試結(jié)果及校準(zhǔn)方程

圖2 3個(gè)批次測(cè)定硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線

(1)

(2)

3個(gè)批次氮同位素校準(zhǔn)曲線方程的斜率均接近理論值1, 相關(guān)性系數(shù)都在0.999以上, 表明反硝化細(xì)菌在將樣品中的硝酸鹽全部還原為N2O的過程中所造成的氮同位素分餾效應(yīng)很小, 能夠準(zhǔn)確反映樣品中硝酸鹽的氮同位素組成。同樣對(duì)3個(gè)不同時(shí)間段所得到的氧同位素校準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行對(duì)比, 其斜率與理論值1之間存在0.4左右的偏差, 但3次實(shí)驗(yàn)所得到的斜率均穩(wěn)定在0.61～0.63之間, 并且相關(guān)性系數(shù)也都在0.99以上, 說明該方法在樣品中硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O的過程中所造成的氧同位素分餾效應(yīng)在每個(gè)批次間基本一致, 具有較好的穩(wěn)定性, 樣品的測(cè)試結(jié)果在經(jīng)過氧同位素校準(zhǔn)曲線的校正后, 也能夠準(zhǔn)確反映樣品中硝酸鹽的氧同位素組成。對(duì)于空白問題, 在每個(gè)批次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品上機(jī)測(cè)試的同時(shí), 均設(shè)置5個(gè)空白對(duì)照實(shí)驗(yàn), 即在吹掃完成后不加入任何樣品, 僅在上機(jī)之前加入等量的NaOH試劑進(jìn)行菌種的滅活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 每個(gè)批次空白組上機(jī)測(cè)試所得質(zhì)量為44的信號(hào)峰面積范圍為0.28～0.35, 而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品測(cè)得的信號(hào)峰面積范圍為13.00～15.00, 在此情況下空白相當(dāng)于樣品量的1.9%～2.3%, 與Sigman等(2001)[18]得到的結(jié)論相一致, 判斷在經(jīng)過2～3 h高純N2吹掃后的菌液中殘留的N2O不會(huì)對(duì)后續(xù)分析測(cè)試造成較大影響。

通過對(duì)3個(gè)批次所得到的硝酸鹽氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn), 2019年7月28日、8月19日、8月26日所對(duì)應(yīng)的氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線的斜率呈現(xiàn)出規(guī)律性遞減, 其中氮同位素校準(zhǔn)曲線的斜率由0.990 2先降低為0.985 4，再降低至0.966 6, 而氧同位素校準(zhǔn)曲線的斜率則從0.630 2降低為0.629 0，再降低至0.610 3。這可能是設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)為保證實(shí)驗(yàn)條件的相對(duì)一致, 3個(gè)時(shí)間段所選用的反硝化細(xì)菌均來自同一平板上的單克隆菌落而忽略了平板上的菌種活性, 該平板在4 ℃的條件下密封保存, 但隨著保存時(shí)間的增加該平板上細(xì)菌的菌齡不斷升高, 導(dǎo)致其活性持續(xù)下降[30]?；钚越档偷募?xì)菌在將樣品中的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O的過程中所造成的氮、氧同位素分餾效應(yīng)則逐漸增加, 從而導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線斜率隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)規(guī)律性遞減。所以, 建議應(yīng)及時(shí)重新活化菌株(每2～3周), 以此來保證反硝化細(xì)菌的活性。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品中硝酸鹽氮、氧同位素重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性分析

表2 3類水樣品中硝酸鹽氮、氧同位素組成

由于本實(shí)驗(yàn)所采用的樣品, 均在-20℃的條件下進(jìn)行密封冷凍儲(chǔ)存, 隨著樣品保存時(shí)間的增加, 可能發(fā)生了硝酸鹽和水之間的氧同位素交換作用, 從而導(dǎo)致海水、湖水和自來水3類水樣品中硝酸鹽的氧同位素的測(cè)定結(jié)果在不同時(shí)間段呈現(xiàn)出了較大差異。所以, 為防止此類情況的發(fā)生, 在樣品采集完成后應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分析測(cè)試, 從而保證測(cè)試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。另外值得注意的是, 雖然在兩個(gè)月中進(jìn)行的多次細(xì)菌反硝化法實(shí)驗(yàn)所得到的硝酸鹽氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性都很好, 但考慮到每個(gè)批次采用的菌液活性和生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)存在一些差異[22], 進(jìn)而導(dǎo)致在硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O的過程中所造成的氮、氧同位素分餾效應(yīng)的程度不同, 所以每個(gè)批次進(jìn)行測(cè)定時(shí)都應(yīng)當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液來重新建立校準(zhǔn)曲線, 從而消除這部分同位素分餾效應(yīng)所造成的測(cè)量誤差。

3 結(jié)論

(1)細(xì)菌反硝化法在不同時(shí)間段所得到的氮同位素校準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好, 在不同時(shí)間段同一樣品中硝酸鹽氮同位素的測(cè)定結(jié)果基本相同, 說明反硝化細(xì)菌將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O的過程中幾乎沒有產(chǎn)生氮同位素分餾效應(yīng), 在長(zhǎng)時(shí)間周期內(nèi)細(xì)菌反硝化法能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中硝酸鹽的氮同位素組成。

(2)細(xì)菌反硝化法在不同時(shí)間段所得到的氧同位素校準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好, 單個(gè)批次內(nèi)海水、湖水和自來水3類樣品的測(cè)定結(jié)果也比較穩(wěn)定, 但同一樣品在不同時(shí)間段所得到的氧同位素測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)了較大偏差。鑒于氧同位素校準(zhǔn)曲線的良好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性, 以及單批次內(nèi)同一樣品測(cè)定結(jié)果的一致性, 推測(cè)這可能是由于在儲(chǔ)存過程中樣品所含硝酸鹽和水之間發(fā)生了氧同位素的交換作用, 從而導(dǎo)致在不同時(shí)間段的測(cè)定結(jié)果之間存在差異。

(3)本研究通過對(duì)2019年7月28日、8月19日、8月26日3個(gè)時(shí)間段所得到的氮、氧同位素校準(zhǔn)曲線方程以及3類水樣品的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)比, 驗(yàn)證了細(xì)菌反硝化法對(duì)海水、湖水和自來水3類水樣品中硝酸鹽氮、氧同位素測(cè)定的適用性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。

(4)考慮到水樣品保存時(shí)間和菌種生長(zhǎng)狀態(tài)的差異性, 采樣完成后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分析測(cè)定, 并且在每個(gè)處理批次內(nèi)單獨(dú)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行校正, 以確保所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。