不同狀態(tài)紅樹和鹽沼植物樣品的脂肪酸組成比較研究

謝麗梅, 吳志強(qiáng), 陳 彬, 陳順洋, 陳光程*

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門361005; 2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003; 3.福建省海洋生態(tài)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

作為濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，濕地植物為生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)和其毗鄰區(qū)域的生物提供食物來源和棲息繁衍場(chǎng)所，并構(gòu)成復(fù)雜的食物鏈和食物網(wǎng)關(guān)系[1]。脂肪酸作為細(xì)胞膜脂的主要成分，又是機(jī)體重要的能源物質(zhì)，是植物必不可少的成分[2]。植物脂肪酸隨著食物鏈傳遞到消費(fèi)者體內(nèi)，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖具有重大意義[3]，通過對(duì)比物種脂肪酸的組成，可以確定物種間的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，指示食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)組成[4]。

目前我國(guó)對(duì)濱海濕地植物脂肪酸的報(bào)道較少，多集中在某一植物物種或者常見物種的脂肪酸組分的研究[5]。紅樹和鹽沼植物是我國(guó)南方河口常見的濕地植物類型，它們通常具有相似的生態(tài)位，可同時(shí)分布在河口的一些岸段[6]，因此都可能構(gòu)成濕地底棲動(dòng)物的食物來源。本研究分析了九龍江口紅樹植物秋茄(Kandeliaobovata)和桐花樹(Aegicerascorniculatum)，以及鹽沼植物互花米草(Spartinaalterniflora)和短葉茳芏(Cyperusmalaccensis)這4種濕地植物成熟、衰老和腐爛植物樣品中的脂肪酸組成，以期為了解濕地植物在維系底棲食物網(wǎng)的重要性提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與前處理

植物樣品采集于福建省龍海市浮宮鎮(zhèn)草埔頭村沿岸(24°23′28.82″N, 117°54′32.50″E)。采集紅樹植物葉片和鹽沼植物地上部分，因?yàn)樗鼈兎謩e代表這兩類植物輸出的有機(jī)碳的形式。隨機(jī)摘取秋茄、桐花樹的新鮮成熟葉片，搖晃樹干獲取凋落的葉片，收集林地地表腐爛的葉片。同時(shí)，隨機(jī)采集互花米草、短葉茳芏的成熟和衰老的(死亡枯黃)地上部分生物量，收集地面腐爛的莖稈等樣品。每種類型的植物分別采集4份重復(fù)樣品。樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后用蒸餾水洗凈，于-40 ℃冷凍干燥后研磨成粉，待測(cè)。

1.2 脂肪酸提取

脂肪酸的提取參考崔瑩(2012)的方法[7]，稱取50 mg樣品于15 mL具蓋玻璃試管中，加入6 mL二氯甲烷∶甲醇混合溶液(體積比為2∶1)于80 ℃條件下水浴加熱2 h。水浴結(jié)束后迅速冷卻至室溫，將試管中的液體轉(zhuǎn)移到25 mL空試管中，60 ℃水浴蒸干，再向試管中加入4 mL鹽酸∶甲醇混合溶液(體積比為1∶3)，于60 ℃條件下水浴4 h后將試管迅速冷卻。再加入1 mL正己烷溶液，渦旋混勻后靜置分層，必要時(shí)可加入蒸餾水助分層，重復(fù)提取兩次。將正己烷層轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，用氮?dú)獯蹈蓾饪s，再加入正己烷定容至1 mL，待測(cè)。

1.3 脂肪酸測(cè)定

利用氣相色譜儀(GC7890A)測(cè)定脂肪酸的組成和含量，自動(dòng)進(jìn)樣器每次注入分析樣品量為1 μL。所用色譜柱為極性毛細(xì)管柱(HP-88, 長(zhǎng)60 m×直徑0.25 mm×膜厚0.2 μm)，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，火焰檢測(cè)器溫度為300 ℃，分流比為10∶1。氣相色譜運(yùn)行時(shí)的升溫程序是：初始溫度100 ℃，維持3 min，然后以10 ℃/min的速度升溫到210 ℃，維持1 min，然后以1.5 ℃/min的速度升到240 ℃，保持3 min；氮?dú)鉃檩d氣，流速為3 mL/min。定性使用的脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)為37種脂肪酸甲酯混標(biāo)、二十六烷酸甲酯、二十八烷酸甲酯(No.47885，No.52203，No.74701，Sepulco.)與三十烷酸甲酯(No.T0812，Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中脂肪酸的表達(dá)寫為CA:BnXt/CA:BnXc，A表示脂肪酸碳鏈的碳數(shù)，B表示雙鍵的數(shù)量，X表示第一個(gè)雙鍵離甲基端的碳數(shù)，t表示反式脂肪酸，c表示順式脂肪酸。采用峰面積歸一化法，得到各脂肪酸成分的相對(duì)百分含量?；跇悠返闹舅峤M成，采用聚類分析對(duì)樣品進(jìn)行分組，再用相似性分析(ANOSIM)和相似性百分比分析(SIMPER)檢驗(yàn)植物樣品處理組之間的相似性，同一物種不同狀態(tài)樣品中脂肪酸組成的差異用主成分分析(PCA)和SIMPER分析(Primer 6)；用單因素方差分析比較不同樣品脂肪酸含量的差異(SPSS 23.0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品脂肪酸的組成

在12種植物樣品中共檢測(cè)出20種脂肪酸(表1、2)，其中月桂酸(C12：0)、肉豆蔻酸(C14：0)、棕櫚酸(C16：0)、十七酸(C17：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1n9)、亞油酸(C18：2n6)、花生酸(C20：0)和二十碳烯酸(C20：1n9)等9種脂肪酸在所有樣品中均被檢測(cè)到。樣品的偶數(shù)碳原子脂肪酸含量均高于96%。樣品中檢測(cè)到13種飽和脂肪酸(SFA)，含量最高的均為C16：0(21.76%～39.55%)，其次是C18：0(4.98%～29.88%)。樣品中檢測(cè)到不飽和脂肪酸(UFA)7種，其中單不飽和脂肪酸(MUFA)4種，主要包括C18：1n9(2.04%～12.90%)和C20：1n9(1.64%～40.45%)；多不飽和脂肪酸(PUFA)3種，包括C18：2n6、C18：3n6和C20：4n6，其中含量最高的為C18：2n6(8.25%～24.69%)。UFA/SFA值在4種植物的新鮮成熟樣品中最高，衰老樣品次之，腐爛樣品則最低。

4種植物在葉片衰老和分解過程中飽和脂肪酸含量增加，鹽沼植物的單不飽和脂肪酸含量在衰老過程中顯著降低(p<0.05)，互花米草的多不飽和脂肪酸含量在衰老過程中顯著降低(p<0.05，圖1)。C20：1n9含量在除秋茄外的3種植物葉片衰老過程中顯著降低，C18：0在鹽沼植物葉片衰老過程中含量增加(表1、2)。

表1 紅樹植物葉片的脂肪酸組成及相對(duì)含量

表2 鹽沼植物樣品的脂肪酸組成及相對(duì)含量

圖1 不同植物樣品脂肪酸的組成

2.2 樣品脂肪酸組成的差異

聚類分析將植物樣品脂肪酸組成在80%相似水平下分成3組，其中6種紅樹樣品為第1組，兩種鹽沼植物成熟樣品為第2組，兩種鹽沼植物的衰老樣品和腐爛樣品同為第3組(圖2)?；诰垲惙治龇纸M情況的One-way Anosim分析結(jié)果表明，紅樹樣品組(第1組)和第2、3組之間均存在顯著差異(R=0.99，p=0.036；R=0.996，p=0.005)，兩組鹽沼樣品間脂肪酸組成差異不顯著。SIMPER分析結(jié)果表明第1組和第2、3組的組間差異貢獻(xiàn)最大的脂肪酸是C30:0，第1組的6種紅樹樣品均檢測(cè)出C30:0，鹽沼植物樣品均未檢出。

圖2 基于樣品脂肪酸組成的聚類分析結(jié)果

PCA分析結(jié)果顯示，在4種植物樣品脂肪酸的組成上，不同狀態(tài)的樣品分處在不同的組(圖3)。基于不同狀態(tài)樣品的PCA分析結(jié)果進(jìn)行SIMPER分析，結(jié)果表明，紅樹植物成熟樣品和衰老、腐爛樣品間差異貢獻(xiàn)最大的是C20：1n9，鹽沼植物成熟樣品和衰老、腐爛樣品間差異貢獻(xiàn)最大的是C20：1n9和C18：0。

圖3 基于樣品脂肪酸組成的PCA分析結(jié)果

2.3 討論

本研究在樣品中共檢測(cè)出20種脂肪酸，奇數(shù)碳原子含量較低，含量較高的為C16：0、C18：0、C18：1n9、C18：2n6和C20：1n9。C16：0和C18：2n6已被證實(shí)通常是紅樹和鹽沼植物葉片中的主要脂肪酸[5, 8-9]。4種植物成熟樣品中的UFA含量均高于SFA，其中互花米草成熟葉片UFA/SFA最高。兩種紅樹成熟葉片的UFA/SFA值(1.20和1.46)與盧昌義等(1997)在九龍江口的報(bào)道相近[10]，鹽沼植物的UFA/SFA值也落在前人報(bào)道的區(qū)間內(nèi)[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，紅樹和鹽沼植物樣品中的UFA/SFA值在衰老和腐爛樣品中低于成熟樣品，脂肪酸的組成以SFA為主。C16:0在葉片衰老和腐爛過程中相對(duì)含量有所增加，是4種植物腐爛葉片中含量最高的脂肪酸，這有可能是其他脂肪酸含量減少導(dǎo)致的[9]。

由于不同生物對(duì)脂肪酸的合成和改造能力存在差異，某些脂肪酸只能由特定的生物合成，且脂肪酸在生物代謝中具有保守性，因此脂肪酸被認(rèn)為是一種合適的生物標(biāo)志物，已經(jīng)被廣泛用于水生動(dòng)物食物來源的研究[13-14]。此前的研究已經(jīng)篩選出了一些特征脂肪酸用于示蹤食物網(wǎng)中有機(jī)質(zhì)的傳遞，例如C20：5n3被認(rèn)為是硅藻的特征脂肪酸，甲藻含有較高的C22：6n3和C18：4n3[15]。碳鏈長(zhǎng)度大于24的長(zhǎng)鏈脂肪酸，如C26：0、C28：0和C30：0則是紅樹植物的特征脂肪酸，在一些河口濕地底棲動(dòng)物食源和食物網(wǎng)的研究中被用來示蹤紅樹植物的貢獻(xiàn)[13-14]。本研究中C30：0在6種紅樹葉片中被檢出(3.37%～7.47%)，但樣品中未檢出C26：0和C28：0。前人的研究表明紅樹植物的特征脂肪酸組成存在明顯的種間差異和地區(qū)差異，其長(zhǎng)鏈脂肪酸的組成和含量存在很大的不確定性，在一些物種中可能存在兩種及以上的長(zhǎng)鏈脂肪酸，因此在利用特征脂肪酸進(jìn)行食源和食物網(wǎng)研究時(shí)需測(cè)定該研究區(qū)域內(nèi)紅樹的脂肪酸組成[16]。本研究中兩種鹽沼植物樣品中檢測(cè)到的脂肪酸在紅樹樣品中也存在，說明鹽沼植物無特征脂肪酸，與之前的研究相符[12]。因此，在河口地區(qū)，當(dāng)紅樹植物和鹽沼植物共存時(shí)，單獨(dú)使用脂肪酸示蹤法無法直接證實(shí)這兩類植物是否都構(gòu)成了底棲動(dòng)物的食物來源，需要結(jié)合其它方法，如胃含物法、穩(wěn)定同位素法[16]等全面分析底棲動(dòng)物的食物來源及貢獻(xiàn)。

本研究結(jié)果表明不同狀態(tài)的葉片脂肪酸組成存在明顯差異(圖3)。在植物的衰老過程中，植物體內(nèi)的膜脂過氧化作用加劇，不飽和脂肪酸含量降低，膜脂的脂肪酸飽和程度逐漸增高[17]。這與本研究的結(jié)果總體相似。衰老的植物樣品相比新鮮成熟樣品，所檢測(cè)到的20種脂肪酸中，僅有C20：1n9在4種植物之間表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，其含量在衰老的樣品中出現(xiàn)明顯的下降。但兩種鹽沼植物的C20：1n9含量則下降更快，在衰老的樣品的脂肪酸中所占比例未超過3%，與腐爛葉片的含量也相似；相應(yīng)的，它們的C18：0比例則出現(xiàn)明顯的增加。Huynh等(2007)認(rèn)為動(dòng)物體內(nèi)C20：1n9的水平可以反映出它們的食物來源[18]，但在本研究中鹽沼和紅樹植物的C20：1n9在腐爛過程中發(fā)生明顯變化，因此利用C20：1n9的水平是否可以準(zhǔn)確指示濱海濕地植物對(duì)底棲動(dòng)物食源的貢獻(xiàn)還需要驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)腐爛樣品中USF/SFA的比值低于新鮮成熟葉和衰老葉片，這可能是因?yàn)橹参镌诜纸膺^程不飽和脂肪酸首先被利用[19]。紅樹葉片分解過程中，長(zhǎng)鏈的脂肪酸能夠保持穩(wěn)定的水平，多不飽和脂肪酸也不被降解[8]。盡管之前的研究表明葉片腐爛過程中C16:0的水平會(huì)出現(xiàn)明顯的下降[8, 20]，可從～70%下降到～20%，但是本研究未發(fā)現(xiàn)紅樹和鹽沼植物樣品中C16:0受到腐爛過程的影響，腐爛樣品中的C16:0均維持在>30%的水平。Rajendran等(2000)的研究[9]中，紅樹植物葉片腐爛過程中C16:0的水平的變化量也遠(yuǎn)低于Mfilinge等(2003)的研究[8]，或者未發(fā)生變化。這可能是這些研究中衰老的樣品中脂肪酸含量的組成差異造成的?？紤]到同一物種的脂肪酸在不同地區(qū)存在差異以及植物物種之間的差異[5, 21]，我們認(rèn)為今后的研究中還需要進(jìn)一步探究植物凋落物在分解過程脂肪酸的變化過程及機(jī)制。

包括C18：2n6和C18：3n3在內(nèi)的必需脂肪酸[22]，在海洋動(dòng)物的生長(zhǎng)、膜運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用[23]。底棲動(dòng)物在攝食消化紅樹植物凋落物中主要是利用其中的必需脂肪酸[24]。紅樹林中植食性的蟹類，如相手蟹科動(dòng)物通常對(duì)腐爛的葉片具有較強(qiáng)的攝食偏好，這是因?yàn)樵诩t樹葉片腐爛過程中微生物的作用使葉片的氮含量增加、碳氮比相應(yīng)降低，可以提供更好的營(yíng)養(yǎng)比[25]。盡管九龍江口褶痕相手蟹(Sesarmaplicata)對(duì)秋茄和桐花樹的腐爛葉片的攝食偏好強(qiáng)于新鮮和衰老葉片[26]，本研究未發(fā)現(xiàn)紅樹腐爛葉片中的必需脂肪酸含量高于其他兩種狀態(tài)樣品，飽和脂肪酸含量甚至升高，而互花米草的腐爛樣品中的水平則遠(yuǎn)低于成熟樣品。Mfilinge等也發(fā)現(xiàn)秋茄葉片在腐爛過程中必需脂肪酸含量未出現(xiàn)增加的現(xiàn)象[8]。因此，為維持其正常生長(zhǎng)，濕地中的底棲動(dòng)物通常需要通過其它的食物來源，如其他底棲動(dòng)物或底棲藻類，來補(bǔ)充所需的營(yíng)養(yǎng)[25]。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)比較九龍江口紅樹和鹽沼植物不同狀態(tài)下樣品中的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)4種植物新鮮成熟葉片中不飽和脂肪酸比例高于飽和脂肪酸，但它們衰老和腐爛葉片中飽和脂肪酸比例升高。紅樹和鹽沼植物脂肪酸組成存在顯著差異，紅樹具有特征脂肪酸C30：0，鹽沼植物未發(fā)現(xiàn)有特征脂肪酸。但腐爛過程中，脂肪酸組成的變化特征因物種和植被類型而異，植物凋落物在分解過程中脂肪酸的變化過程及機(jī)制還需要進(jìn)行深入討論。本研究也表明，與其他兩種狀態(tài)相比，腐爛的植物樣品中脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，尤其是必需脂肪酸比例并未得到改善，因此今后還需要進(jìn)一步結(jié)合濕地底棲動(dòng)物的食源分析、脂肪酸的利用效率、生長(zhǎng)和生理等研究討論濕地植物對(duì)底棲動(dòng)物的維持作用。