Cry1B抗獨特型單鏈抗體的定點突變及生物活性分析

仲建鋒 李興奎 徐重新 張霄 劉賢金

（1. 江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標準重點實驗室 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，南京 210014；2. 鄭州職業(yè)技術(shù)學院，鄭州 450121）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種廣泛存在于各類環(huán)境中的昆蟲病原菌，對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有殺蟲活性［1］。Cry1B是Bt Cry毒素的一種，其對鱗翅目昆蟲的靶標位點包括中腸刷狀緣膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、鈣粘蛋白（cadherin）［2-3］， 以 及 ABC 轉(zhuǎn) 運 蛋 白［4］等。APN屬于鋅結(jié)合金屬蛋白酶家族蛋白，它的碳端結(jié)合部位富含N-乙酰氨半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc），這些區(qū)域是Cry毒素的結(jié)合位點［5］。煙芽夜蛾（Heliothis virescens）的170 kD的APN可與Cry1Aa、Cry1Ab 和 Cry1Ac結(jié)合［6］。卷葉蛾（Epiphyas postvittana）BBMV上的120 kD的APN可與Cry1Ac和Cry1Ba結(jié)合［7］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Cry1B抗獨特型（anti-idiotypic，anti-Id）單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）C7可以模擬Cry1B的結(jié)構(gòu)和功能［8］，因此推測C7與昆蟲BBMV上的APN可能存在結(jié)合關(guān)系。但是C7的結(jié)合和生物活性跟原毒素Cry1B相比有差距，需要改進提升。

單鏈抗體由重鏈可變區(qū)（heavy chain variable，VH）和輕鏈可變區(qū)（light chain variable，VL）通過一條單一肽鏈（linker）組成，大小為完整抗體分子的1/6，制備流程較簡單，易進行分子改造［9-10］。然而，基因工程抗體一般存在親和力低等問題，以計算機模擬為基礎(chǔ)的定點突變可以預(yù)測分子間結(jié)合區(qū)域并確定關(guān)鍵氨基酸殘基［11］，關(guān)鍵氨基酸的有利突變可以提高抗體的親和力，在體外通過定點突變等基因工程手段可以構(gòu)建限定性突變抗體庫，進而篩選到高親和力抗體［12］。Barderas等［13］在研究人類抗胃泌素TA4 scFv親和力成熟的過程中，在限定性突變的基礎(chǔ)上采取定點突變等方法，最終得到將TA4的親和力提高了454倍的突變scFv。Zhang等［14］在構(gòu)建了抗成纖維細胞活化蛋白scFv E3突變庫的前提下，對CDR區(qū)進行了定點突變，其中重鏈33位氨基酸Asp變?yōu)镚ly，107位Tyr變?yōu)镠is效果最好，此E3 Mut2親和力提高了4倍。此方法目的明確，避免了隨機突變編碼可變區(qū)基因片段法隨意性大的缺點。

分子模擬技術(shù)在抗體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系分析、蛋白質(zhì)分子設(shè)計與改造等過程中得到了廣泛開發(fā)與應(yīng)用。本研究通過計算機輔助設(shè)計指導抗體親和力成熟，借助分子模擬技術(shù)獲得對接復(fù)合物的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域并預(yù)測熱點，利用熱點構(gòu)建飽和突變抗體庫，篩選出親和力和生物活性提高的突變體。以期進一步對基因工程抗體結(jié)合區(qū)域改造指明方向。

1 材料與方法

1.1 材料

抗Cry1B毒素Ab2β 型scFv-C7來源于本實驗室，使用噬菌體展示技術(shù)從Tomlinson I+J庫中篩選獲得，具殺蟲活性［10］，還得到了與C7結(jié)構(gòu)相似的scFv-D5，但無殺蟲活性（圖1）。CrylB購于上海佑隆生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）TG1購自英國劍橋MRC實驗室；輔助噬菌體M13K07、Nco I酶、Not I酶、T4 DNA連接酶和Dpn I酶均購于NEB公司；使用的其余試劑均為分析純。

圖1 CrylB毒素的anti-Id scFv C7和D5的氨基酸序列分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment of anti-Id scFv C7 and D5 against Cry1B toxin

稻 縱 卷 葉 螟（Cnaphalocrocis medinalis） 源自揚州綠源生物化工有限公司。試蟲飼養(yǎng)溫度為（27±1）℃，相對濕度80%±5%，光照時間14 h，以水稻（Oryza sativa）葉片續(xù)代飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 ScFv-C7與稻縱卷葉螟APN的同源建模和分子對接 ScFv-C7的同源建模從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫分別搜索VH、VL的同源序列，根據(jù)一致性確定模板。在分別構(gòu)建VH和VL的同源模型后，通過最小二乘法對蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)重疊以構(gòu)建C7三維結(jié)構(gòu)。稻縱卷葉螟APN（CmAPN，NCBI登錄號：ADZ05466.1）的建模則從PDB數(shù)據(jù)庫搜索一致性較高的模板即可。采用Ramachandran plot對C7和APN三維結(jié)構(gòu)進行評估，評價其合理性。建模采用的Modeller程序由EasyModeller 4.0軟件［15］完成，Ramachandran plot分析由PROCHECK模塊評估（https：//saves.mbi.ucla.edu）完成，蛋白三維結(jié)構(gòu)輸出使用 PyMOL 1.3 軟件［16］。

使用ZDOCK在線程序（http：//zdock.umassmed.edu/）對scFv-C7和CmAPN進行蛋白對接。采用KFC熱點預(yù)測（http：//kfc.mitchell-lab.org/）計算分析scFv-C7和CmAPN對接復(fù)合物，獲得二者接觸界面上互作的熱點殘基。

1.2.2 ScFv-C7定點突變抗體庫的構(gòu)建 采用大引物PCR法（megaprimer PCR）［17-18］進行飽和突變，分析scFv-C7位于對接界面上的熱點殘基，選擇了scFv- C7的 H-CDR3區(qū) A123、Y124和 L-CDR2區(qū)S204、S207作為突變位點。LMB3和pHENseq是用來擴增全長序列的引物；NNK_VH是引入H-CDR3區(qū)A123、Y124飽和突變的引物；NNK_VL是引入L-CDR2區(qū)S204、S207飽和突變的引物（表1）。所有引物均由上海生工生物合成。

表1 飽和突變抗體庫構(gòu)建使用的引物序列Table 1 Primer sequences for the construction of sitedirected mutagenesis library

普通 PCR 擴增條件：95℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，72oC 延伸10 min。“大引物”PCR 擴增條件：95℃ 5 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)，72℃ 延伸10 min。為去除PCR產(chǎn)物中未突變的的模板質(zhì)粒，使用Dpn I酶消解處理。

分別將載體pIT2質(zhì)粒與定點飽和突變產(chǎn)物使用Nco I、Not I雙酶切處理，再用T4 DNA連接酶連接。使用BTX ECM 830電轉(zhuǎn)儀（Harvard Apparatus公司）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物快速加入1 mL 2×TY培養(yǎng)基，37℃，200 r/min復(fù)蘇1 h；10倍梯度稀釋后涂布于TYE-AG平板，置于37℃過夜培養(yǎng)，計算庫容；然后將剩余復(fù)蘇產(chǎn)物離心后用100 μL 2×TY重懸沉淀，并均勻涂布于TYE-AG平板，37℃過夜培養(yǎng)。次日，隨機挑取10個單克隆，并用菌落PCR驗證突變庫的準確性，然后向TYEAG平板中加入1 mL 2×TY，用涂布棒刮起平板上的菌體細胞，并徹底混勻，所得即為定點飽和突變抗體庫。

1.2.3 定點飽和突變抗體庫的篩選

1.2.3.1 突變抗體庫的擴增 取500 μL飽和突變庫加入到200 mL 2×TY-AG培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600=0.4），將2×1011PFU M13KO7輔助噬菌體加入到上述50 mL培養(yǎng)液中，37℃孵育30 min。剩余的150 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，10 800× g離心10 min，去上清，并重懸至10 mL的2×TY（含15%甘油）中，最后分裝保存至超低溫冰箱。含輔助噬菌體的飽和突變庫菌液孵育后，3 000 × g離心10 min，棄上清，再用100 mL 2×TY-AKG將菌體沉淀重懸，30℃過夜培養(yǎng)。次日，3 300 × g離心30 min，上清加入1/4體積的PEG/NaCl并充分混勻，冰浴1 h。3 300× g離心30 min，再用4 mL PBS重懸沉淀，最后11 600× g離心10 min，上清即為擴增好的飽和突變抗體庫，可用于后續(xù)篩選。

1.2.3.2 稻縱卷葉螟BBMV對突變抗體庫的富集和篩選 使用稻縱卷葉螟4齡末期幼蟲的中腸提取BBMV，采用Mg-EGTA沉降法制備［19］。篩選策略參考課題組前期方法［20］，略有改動。采用逐漸降低包被濃度的固相篩選方法對擴增好的飽和突變抗體庫進行3輪篩選，稻縱卷葉螟BBMV（CmBBMV）的濃度分別是 100 μg/mL、50 μg/mL 和 25 μg/mL，以每孔4 mL包被6孔板。經(jīng)過3輪“吸附-洗脫-擴增”的篩選，使特異性結(jié)合的噬菌體得到有效富集。

1.2.3.3 單克隆ELISA鑒定 參考劍橋MRC和課題組前期的方法［20］，稍有改動，從第3輪篩選后的平板中隨機挑取單菌落轉(zhuǎn)接至96孔板中培養(yǎng)；次日，從中取2 mL菌液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，培養(yǎng)2 h后，每孔加入25 mL滴度為109的輔助噬菌體M13KO7，培養(yǎng)、離心、去上清，每孔加入200 mL 2×TY-AKG重懸細胞，培養(yǎng)過夜；次日離心，取上清液備用。取30 mg/mL CmBBMV包被96孔板，每孔100 mL。次日封閉后加入每孔100 mL單克隆表達上清。其余均為ELISA標準操作步驟，使用酶標儀（Thermo）測定OD450值，陽性/陰性值大于2.1，即可判斷為陽性克隆。

1.2.4 突變抗體基因的測序與分析 選取在上述單克隆噬菌體ELISA分析中OD450值高于野生型scFv-C7的突變單克隆，按標準流程培養(yǎng)后提取質(zhì)粒、酶切、PCR鑒定和測序。序列比對分析使用ClustralW 2.0.10程序，圖像輸出使用Jalview 2.11軟件。

1.2.5 突變單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合能力分析 表面等離子體子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種快速監(jiān)測生物分子互作的方法。各樣品菌液的制備方法同抗體庫擴增方法一致，使用20 mL 2×TY-AG培養(yǎng)體系，次日PEG/NaCl充分混勻后冰浴、離心后棄上清，再用10 mL PBS重懸沉淀，最后11 600 × g離心10 min，上清即為待測樣品，滴度為3.2×107CFU/mL。陽性對照Cry1B毒素濃度20 μg/mL。

使用BIAcore X100 實驗平臺（GE Healthcare），所用材料購自GE公司。CmBBMV先用PBS稀釋至500 mg/L待用，進樣反應(yīng)再用NaAc稀釋到50 mg/L。各待測樣品均使用HBS-EP稀釋到指定濃度。

CmBBMV作為受體蛋白，通過氨基偶聯(lián)法固定到CM5傳感芯片上。將CM5傳感芯片F(xiàn)C1通道設(shè)為對照通道，F(xiàn)C2通道設(shè)為反應(yīng)通道?；罨疐C2通道待基線平穩(wěn)封閉，確定固定CmBBMV至芯片上的蛋白量。然后確定芯片再生反應(yīng)所需再生緩沖液Glycine-HCl的最適pH值。所有待測樣品勻速連續(xù)流過芯片表面，最后的傳感圖顯示FC2-FC1的響應(yīng)值（RU）。

1.2.6 突變單鏈抗體對稻縱卷葉螟的殺蟲活性 采用浸葉法，生測樣品的制備同SPR分析一致，最終得到PEG/NaCl沉淀的上清（滴度3.2×107CFU/mL），Cry1B濃度也是20 μg/mL。將新鮮水稻葉片分別放入各種生測材料中浸漬后取出晾干，用于實驗。將處理后的水稻葉片分別放入培養(yǎng)皿，每皿接入20頭3齡幼蟲，24、48、72 h后分別記錄試蟲狀態(tài)，每處理3次重復(fù)。試蟲死亡率采用Abbott公式進行校正，并以平均數(shù)±標準誤表示。各處理時間樣品間采用單因素方差分析和Tukey顯著性比較，使用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 ScFv-C7與CmAPN三維結(jié)構(gòu)的同源建模及合理性評估

CrylB毒素anti-Id scFv C7的VH選取人類生殖細胞抗體3-23/B3（PDB：3QOS）作為同源建模的模板［21］，序列一致性為89%。C7的VL模板選取人類抗體Vκ域（PDB：2BX5）［22］，序列一致性達到了98%。分別構(gòu)建VH和VL的同源模型后，通過蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)重疊獲得C7的結(jié)構(gòu)模型（圖2-A）。CmAPN的模板選擇人類 APN Cd13（PDB：4FYQ）［23］，序列一致性為31%，CmAPN的三維結(jié)構(gòu)模型則如圖2-B所示。

通過Ramachandran 圖對C7和CmAPN結(jié)構(gòu)模型主鏈構(gòu)型的Φ-Ψ二面角的分布進行檢查。結(jié)果C7的98.5% 殘基落在最佳區(qū)域（圖2-C）；CmAPN中97.3%殘基落在最佳區(qū)域（圖2-D），說明模型結(jié)構(gòu)合理可信。

圖2 ScFv-C7和CmAPN三維結(jié)構(gòu)的同源建模Fig. 2 Three-dimensional structure models of scFv-C7 and CmAPN

2.2 ScFv-C7與CmAPN的分子對接及熱點預(yù)測

ScFv-C7和CmAPN對接后的空間結(jié)構(gòu)如圖3-A所示，使用KFC2熱點預(yù)測系統(tǒng)分析得到scFv-C7上 的 熱 點 有 ：Y54、A123、Y124、Y186、Y203、S204、S207。一般來說，單鏈抗體氨基酸序列變化主要發(fā)生在VH和VL的CDR2、CDR3區(qū)，按照Kabat規(guī)則，上述預(yù)測的熱點殘基位于H-CDR3區(qū)（A123、Y124）和 L-CDR2 區(qū)（S204、S207）（圖 3-B），可以選擇這兩個區(qū)域進行飽和突變。

圖3 scFv-C7和CmAPN的分子對接及互作熱點分析Fig. 3 Molecular docking and the interaction hot spot analysis between scFv-C7 and CmAPN

2.3 ScFv-C7飽和突變抗體庫的構(gòu)建

使用大引物PCR法對scFv-C7模板進行突變，以LMB3和NNK_VH為引物擴增引入H-CDR3區(qū)A123、Y124的飽和突變（圖4-A），并當做下一輪PCR的上游引物（大引物1），加下游引物pHENseq擴增即為帶有H-CDR3飽和突變位點的PCR產(chǎn)物（圖4-B）。再以scFv-C7作為模板，NNK_VL和pHENseq為引物，引入VL區(qū)S204、S207的飽和突變（圖4-C），作為下一輪的PCR下游引物（大引物2），與上游引物LMB3和模板（H-CDR3區(qū)突變位點的PCR產(chǎn)物）進行擴增，本次擴增的PCR產(chǎn)物即為引入H-CDR3和L-CDR2的飽和突變區(qū)域（圖4-D）。

圖4 基于scFv-C7對接界面熱點氨基酸的飽和突變Fig. 4 Saturation mutagenesis of hot spot amino acids on docking interface based on scFv-C7

將scFv-C7飽和突變的PCR產(chǎn)物純化后克隆至pIT2噬菌粒載體，隨后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于TYE-AG平板，構(gòu)建定點飽和突變抗體庫，經(jīng)菌落計數(shù)法計算庫容為2×103。

為了驗證突變抗體庫所含基因是否正確，隨機挑取10個單克隆并利用噬菌體載體pIT2自帶引物LMB3和pHENseq進行PCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個克隆在950 bp左右有目的條帶（圖5），符合噬菌?；虼笮。挥?個突變克隆PCR未成功。構(gòu)建的飽和突變抗體庫基因正確率90%，可見適合后續(xù)篩選工作。

圖5 構(gòu)建的飽和突變抗體庫正確性驗證Fig.5 Verification of correction from constructed saturation mutant antibody library

2.4 ScFv-C7定點突變抗體庫的篩選

分析每輪篩選之后整體次級庫的親和力變化趨勢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)出/投入隨著篩選輪數(shù)而增高，第3輪比第1輪的產(chǎn)出/投入提高了12倍（表2），可見篩選3輪后特異性突變株得到了有效富集。

表2 scFv-C7突變抗體庫的富集和篩選Table 2 Enrichment and screening of scFv-C7 mutant antibody library

2.5 單克隆ELISA篩選陽性重組噬菌體

隨機挑取第3輪篩選的單菌落用于單克隆噬菌體ELISA鑒定，從OD450值大于C7的陽性克隆中選取了3個最高的單克?。?A5、3G2和2F7（圖6），用于進一步序列比對分析。

圖6 突變抗體的單克隆噬菌體ELISA分析Fig. 6 ELISA analysis of monoclonal phage for mutant antibodies

2.6 篩選獲得突變基因的序列分析

使用pIT2載體引物對3A5、3G2和2F7進行PCR檢測，條帶在950 bp左右（圖7-A），匹配噬菌體完整外源基因大小，可用于進一步的測序分析。

多重序列比對顯示3A5的H-CDR3區(qū)124位發(fā)生了突變，Tyr變成了Gly（Y124G）；而3G2則無變化，跟C7序列完全一致，2F7序列的H-CDR2區(qū)76位出現(xiàn)了終止子（圖7-B）。最終選擇3A5即Y124G作進一步分析。

圖7 突變單鏈抗體的基因克?。ˋ）與氨基酸序列比對（B）Fig.7 Gene cloning（A）and amino acid sequence alignment（B）of mutant scFv antibodies

2.7 突變單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合能力

SPR檢測單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合過程，上 樣 緩 沖 液 選 擇 pH 4.0的 NaAc（10 mmol/L），CmBBMV偶聯(lián)到芯片上的量為1 267 RU，再生反應(yīng)選擇pH 2.5的Glycine-HCl（10 mmol/L）和5 mmol/L NaOH。

各待測樣品分別通過CM5芯片，它們同CmBBMV的結(jié)合是動態(tài)過程，先結(jié)合再解離。ScFv-D5同 CmBBMV基 本 沒 有 結(jié) 合（3.57 RU），Cry1B的結(jié)合能力最強（197.39 RU），突變型Y124G的結(jié)合能力（155.49 RU）將野生型scFv-C7的結(jié)合能力（72.77 RU）提高了2.1倍（圖8）。

圖8 SPR分析突變單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合Fig. 8 SPR analysis of mutant scFv antibodies binding to CmBBMV

2.8 突變單鏈抗體對稻縱卷葉螟的生物活性

稻縱卷葉螟幼蟲經(jīng)過24 h處理，Y124G與scFv-C7殺蟲效果無明顯差異，但是48 h后，特別是經(jīng)過72 h處理，Y124G將scFv-C7的死亡率從42.22%提高到56.67%，雖然突變型將殺蟲活性提高，但是顯著低于陽性對照Cry1B的76.67%（表3），還需進一步改造以達到更佳效果。

表3 突變單鏈抗體對稻縱卷葉螟的生物測定Table 3 Bioassay of mutant scFv antibodies against C. medinalis larvae

3 討論

定點突變的改造方法與傳統(tǒng)抗體改造方法相比，避免了盲目性，成功率較高，而且以分子模擬為基礎(chǔ)的定點突變，在已知蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能等方面信息的基礎(chǔ)上，預(yù)測分子間結(jié)合區(qū)域并確定關(guān)鍵氨基酸殘基，更加準確的反應(yīng)了抗體蛋白作用界面的特征，大大提高了預(yù)測準確度［13，24-25］。本文利用分子對接、預(yù)測熱點的理論知識，構(gòu)建飽和突變抗體庫，經(jīng)過固相篩選，準確發(fā)現(xiàn)了一株提高功能活性的突變株。

計算機輔助設(shè)計所構(gòu)建的飽和突變抗體庫的庫容為2×103，庫容偏小。在設(shè)計飽和突變片段的時候，突變位點設(shè)計成 NNK（N為A、G、C 或T，K為G或T），這使每個位點能囊括全部20種氨基酸，有效減少同義密碼子的數(shù)量，并能有效減少突變抗體庫的篩選數(shù)量［26-27］。此外，為了提高轉(zhuǎn)化效率，我們使用了電轉(zhuǎn)化來構(gòu)建抗體庫。庫容偏小可能的原因是在擴增飽和突變基因過程中得到的PCR產(chǎn)物偏少或者濃度偏低（圖4-D），這需要優(yōu)化PCR程序或設(shè)計新的引物?；蛘呖稍诩扔型蛔凅w的基礎(chǔ)上進行多輪突變，以積累有益突變，從而獲得親和力更高的突變體。

SPR技術(shù)是基于金屬薄膜的光學耦合作用原理建立的探測生物分子之間相互作用的新技術(shù)，可簡單快捷地監(jiān)測生物分子之間的相互作用［28-30］。BIAcore SPR已在許多監(jiān)測種類中應(yīng)用，包括“抗原-抗體”和“受體-配體”互作這兩種最常見的類型。SPR分析發(fā)現(xiàn)Anti-Id scFv與CmBBMV的結(jié)合是“結(jié)合-平衡-解離”的動態(tài)過程，不同于ELISA結(jié)合實驗只得到最終狀態(tài)的靜態(tài)結(jié)果。一般只有偶聯(lián)到CM5傳感芯片上蛋白是單一純化物質(zhì)才能計算動力學常數(shù)［31-32］，由于昆蟲中腸BBMV是多種受體蛋白混合而成，所以無法算出動力學常數(shù)，但是可以計算出結(jié)合能力。SPR與ELISA結(jié)果相互印證，明確了突變株Y124G對CmBBMV的親和力比野生型scFv-C7提高（圖8）。

雖然突變型Y124G對稻縱卷葉螟的殺蟲活性較野生型scFv-C7提高，但還是顯著低于Cry1B毒素（表3）。隨著蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的增加及優(yōu)化，三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的擴充，模型評價系統(tǒng)的優(yōu)化，分子對接技術(shù)的升級，從而可以獲得更準確的對接模型［33］。進而在模型結(jié)構(gòu)上可以精確分析接觸面殘基位點，確定突變氨基酸，為得到活性提高的抗體蛋白材料奠定了堅實的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用計算機模擬方法構(gòu)建了scFv-C7和CmAPN的結(jié)構(gòu)模型，分子對接并預(yù)測對接復(fù)合物的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域，分析位于scFv-C7上的熱點殘基并構(gòu)建定點飽和突變抗體庫，利用固相篩選方法包被CmBBMV，篩選出親和力和生物活性提高的突變單鏈抗體。對基因工程抗體分子對接熱點進行定點飽和突變，是一種快速抗體分子改造的有效方法，也為蛋白農(nóng)藥制備改造提供了一個新途徑。