成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20單克隆抗體的制備及鑒定

唐祿 董麗平 尹茉莉 劉磊 董媛 王會(huì)巖

（1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 132013；2. 吉林省抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 132013）

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一類(lèi)能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的FGF家族共有23個(gè)成員［1］，分子量為17 kD-34 kD，成員之間的氨基酸序列同源性較高，多數(shù)成員來(lái)自中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞［2］。廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，參與多種器官發(fā)育、血管新生、促有絲分裂、細(xì)胞遷移和分化等，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于組織創(chuàng)傷修復(fù)，美容創(chuàng)面修復(fù)、皮膚早衰等領(lǐng)域［3］。FGF20是FGF家族中的一員，與FGF9和FGF16屬于同一亞家族［4］。2000年首次被Ohmachi等［5］發(fā)現(xiàn)，同年 Kirikoshi等［6］在人體中發(fā)現(xiàn)了FGF20，其成熟蛋白質(zhì)由211個(gè)氨基酸組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)存在大量的β折疊。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth gactor recepter，F(xiàn)GFR）屬于酪氨酸激酶受體的一種［7-8］，F(xiàn)GF20通過(guò)與FGFR特異結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。FGF20在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病［9］、形態(tài)發(fā)生［10］、毛囊生長(zhǎng)［11-12］、組織修復(fù)［13］等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。另外，F(xiàn)GF20的多態(tài)性還是中國(guó)漢族人群的PD 疾病的危險(xiǎn)因素［14］。Jeffers等［15］利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同人腫瘤細(xì)胞中FGF20 mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在肺癌、胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞中FGF20基因表達(dá)量最高，在正常組織中則是低表達(dá)；劉萍等［16-17］利用免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF20在大腸癌組織中異常表達(dá)，隨后通過(guò)免疫組化和Western Blot檢測(cè)，顯示直腸癌中FGF20表達(dá)顯著高于正常腸粘膜組織，且FGF20表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20基因定位的8號(hào)染色體區(qū)域，發(fā)生突變后容易產(chǎn)生神經(jīng)退行性疾病，胃癌和肺癌等疾?。?8-19］。Fitzmaurice等［20］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2018年，全球共有2 450萬(wàn)癌癥病例，導(dǎo)致了960萬(wàn)人死亡。我國(guó)2014年確診的惡性腫瘤病例數(shù)為380.4萬(wàn)例，2019年約為392.2萬(wàn)例，增長(zhǎng)率為3.2%。而肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌為最為常見(jiàn)的癌癥，如果患者能在患病的早期就及時(shí)發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要。由于FGF20可在肺癌、胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，可作為幾種癌癥潛在的腫瘤標(biāo)志物，因此制備抗FGF20的高親和力抗體，可以為肺癌和其他癌癥早期診斷篩查及預(yù)后評(píng)估提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨髓瘤細(xì)胞株（SP2/0）為本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌BL21（DE3）plysS購(gòu)于北京全式金生物，載體由上海杰瑞生物工程公司合成構(gòu)建。Balb/c小鼠購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品研究所。

蛋白胨、酵母提取物購(gòu)于英國(guó)OXOID公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗體購(gòu)于美國(guó)Abmart公司；商品化FGF20購(gòu)于上海優(yōu)寧維；亞型抗體檢測(cè)試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT購(gòu)于美國(guó)sigma公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)BI公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；SUMO酶（本實(shí)驗(yàn)室保存）；超濾管購(gòu)于Millipore公司；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)Corning公司；純化填料和層析柱購(gòu)于美國(guó)GE公司；Tris堿、NaCl等試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 pET24a-SUMO-hFGF20表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)FGF20基因（ID：26281）序列的5′端添加SUMO基因序列，并在序列兩側(cè)設(shè)計(jì)Nde I、BamH I酶切位點(diǎn)，優(yōu)化并合成基因序列。公司合成載體（由上海杰瑞完成）。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS感受態(tài)細(xì)胞中。涂布于含Kana+的LB平皿，37℃倒置培養(yǎng)12-16 h。

1.2.2 抗原的表達(dá) 從平皿中挑取單菌落，接種于 5 mL LB 培 養(yǎng) 基 中（Kana+，10 μg/mL），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.8-1.0左右時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，20℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，4℃、9 000 r/min離心15 min收集菌體。按照菌體∶裂解液（20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA-2Na pH 8.2）1∶10的比例，重懸菌體超聲破碎，功率為50%，工作4 s，間休6 s，超聲30 min。離心收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 抗原的純化 大量制備菌體，加入裂解液溶解后，在低溫條件下用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體。4℃、20 000 r/min，離心 30 min，收集上清，0.45 μm濾膜過(guò)濾，上清液先用鎳NTA親和層析柱純化，收集洗脫液，PBS溶液透析過(guò)夜，然后采用SUMO酶進(jìn)行酶切。4℃條件下酶切16 h。酶切后樣品再次經(jīng)鎳NTA親和層析柱純化，收集流出液，用超濾管（截流分子量10 kD）超濾置換溶液。收集的蛋白溶液純度采用SDS-PAGE法檢測(cè)，濃度用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。

1.2.4 動(dòng)物免疫 選擇7-8周齡雌性Balb/c小鼠3只（20±2）g，將FGF20蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化，通過(guò)頸背部多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行首次免疫（100 μg/只小鼠）。兩周后進(jìn)行第2次免疫，F(xiàn)GF20蛋白與弗氏不完全佐劑（劑量與首次相同）乳化后頸背部多點(diǎn)注射。3次免疫后，小鼠尾靜脈收集血清，用間接ELISA檢測(cè)血清中抗體效價(jià)。選取一只最佳免疫的小鼠，融合前3 d腹腔注射抗原作加強(qiáng)免疫（劑量同前）。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)吉林醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（編號(hào)：2021-LW004）。

1.2.5 雜交瘤細(xì)胞的建立與篩選 首先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，取1只未免疫的Balb/c小鼠，處死后置于75%乙醇溶液中浸泡5 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作暴露腹膜。用預(yù)熱RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗腹腔并收集沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，每孔100 μL，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SP2/0細(xì)胞，離心重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)。另取血清效價(jià)最高的BALB/c小鼠，脫頸處死后75%乙醇浸泡5 min，取脾臟研磨，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集脾細(xì)胞。脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞以2∶1的比例混合，離心棄上清，滴入50%的PEG溶液 1 mL，靜置45 s后，加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液終止PEG作用。用含10%胎牛血清和HAT的RPMI-1640細(xì)胞選擇培養(yǎng)液重懸，96孔板中每孔200 μL，37℃，5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后，第4天更換培養(yǎng)液，第7天篩選融合細(xì)胞（取細(xì)胞上清，采用間接ELISA法篩選融合細(xì)胞），用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸收值，陽(yáng)性/陰性值（P/N）大于2.1作為陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行3-4次亞克隆。

1.2.6 單克隆抗體的純化 取3只適齡的Balb/c小鼠，預(yù)先腹腔注射0.5 mL石蠟制敏小鼠，1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞（2×106個(gè)/0.5 mL），觀察腹水產(chǎn)生情況，10 d后收集腹水。4℃，12 000 r/min，離心30 min，收集上清，0.45 μm濾膜過(guò)濾，4℃保存待用。收集的腹水樣品先用等體積的10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）溶液稀釋?zhuān)琾rotein G親和層析柱純化，先用10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）預(yù)平衡層析柱10個(gè)柱體積，然后上稀釋后腹水樣品，上樣結(jié)束后再用PBS溶液平衡至基線穩(wěn)定。用0.1 mol/L甘氨酸溶液（pH 3.0）洗脫，收集樣品，離心管中預(yù)先加入1 mol/L Tris溶液（pH 9.0），收集的蛋白樣品用超濾管（截留分子量10 kD）進(jìn)行濃縮換液。收集的蛋白溶液純度采用SDS-PAGE法檢測(cè)。

1.2.7 單克隆抗體的分析檢測(cè)

1.2.7.1 ELISA法測(cè)定抗體效價(jià) 將純化的FGF20蛋白包被 ELISA 板（5 μg/mL，100 μL/孔），4℃孵育過(guò)夜，洗滌液洗板3次，用封閉液稀釋待測(cè)抗體，加入到ELISA板中100 μL/孔，稀釋倍數(shù)分別為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800，100 μL/孔，37℃孵育 40 min，洗滌液洗板3次，再加入山羊抗鼠IgG-HRP二抗（稀釋比例為1∶8 000）100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗滌液洗板3次；加TMB顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育3-10 min，每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)每孔吸收值。

1.2.7.2 抗體亞型分析 按照sigma鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)純化后的抗體，鑒定單克隆抗體的亞型，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.7.3 Western Blotting檢測(cè) 配制12%的SDSPAGE膠，將等量純化FGF20蛋白與商品化FGF20上樣進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，將目的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上（恒流300 mA，1 h），然后用封閉液（含5%脫脂奶粉+TBST）溶液室溫封閉PVDF膜1-2 h，加入封閉液稀釋后的純化抗體（1∶5 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，第2天用TBST溶液洗滌PVDF膜3次后，加入用TBST溶液稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgGHRP二抗（1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h后，TBST溶液洗滌3次，最后用ECL曝光液曝光。用伯樂(lè)ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)。

1.2.7.4 Surface Plasmon Resonance（SPR）測(cè)定抗體親和力 SPR實(shí)驗(yàn)使用BIAcore T200儀器，在HBSEP緩沖液（10 mmol/L HEPES、150 mmol/L NaCl、3 mmol/L EDTA、0.005%聚山梨醇酯20，pH 7.4）中進(jìn)行。通過(guò)胺偶聯(lián)反應(yīng)將FGF20蛋白固定在CM5芯片上，使其保持充分的配體結(jié)合能力。采用控制流通道作為基準(zhǔn)面進(jìn)行體效應(yīng)的減法。增加濃度的抗體注射對(duì)固定化和參考通道，然后用再生液（2 mol/L NaCl，10 mmol/L醋酸鈉，pH 4.5）處理芯片。最后用BIA Evaluation軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)擬合的飽和結(jié)合曲線計(jì)算平衡離解常數(shù)Kd。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Nde I、BamH I雙酶切后，DNA電泳結(jié)果顯示（圖1），在1 000 bp附近處有一條明顯的條帶，與預(yù)計(jì)大小相符。工程菌pET24a-SUMO-hFGF20經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量為37 kD出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，顯示目的蛋白在上清中表達(dá)（圖2）。均質(zhì)破碎后離心樣品通過(guò)鎳NTA親和層析柱，捕獲到SUMO-FGF20融合蛋白，按比例用SUMO酶酶切后，樣品再經(jīng)過(guò)鎳NTA親和層析柱，收集穿出液即獲得目的蛋白（圖3）。

圖1 質(zhì)粒雙酶切圖Fig.1 Double enzyme digestion of plasmid

圖2 工程菌可溶性分析電泳圖Fig.2 Electrophoregram analysis of soluble of engineere bacteria (SDS-PAGE)

圖3 FGF20純化電泳圖Fig.3 Electrophoregram analysis of purified FGF20

2.2 抗體的純化

通過(guò)多次有限稀釋進(jìn)行克隆化篩選，獲得1株穩(wěn)定分泌表達(dá)FGF20單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為17G3。將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)后，注射到小鼠腹腔內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生腹水，收集腹水并分離純化。還原型SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖4），分子量為25 kD和50 kD有兩條帶，分別對(duì)應(yīng)抗體的輕鏈與重鏈。通過(guò)凝膠成像軟件分析，純度達(dá)到95%以上。

圖4 抗體純化電泳圖Fig.4 Electrophoregram analysis of purified monoclonal antibody

2.3 單克隆抗體的檢測(cè)

2.3.1 抗體效價(jià)和亞型的分析檢測(cè) 收集雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠腹水，用間接ELISA檢測(cè)（n=3）純化后17G3抗體效價(jià)，以樣品OD450大于等于陰性對(duì)照OD值2.1時(shí)，所對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為抗體的效價(jià)，結(jié)果顯示純化后抗體效價(jià)為1∶25 600（圖5），經(jīng)ELISA亞型檢測(cè)后，雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體亞型為IgG1（圖6）。

圖5 抗體效價(jià)分析檢測(cè)Fig.5 Antibody titer assay

圖6 抗體亞型分析檢測(cè)Fig.6 Antibody subgroup assay

2.3.2 Western Blot分析檢測(cè) Western Blot結(jié)果顯示（圖7），在相對(duì)分子量為23 kD處可以曝光出條帶，且兩條帶位置相同，說(shuō)明免疫純化得到的17G3抗體既可以與自制的抗原結(jié)合，又能與商品化的FGF20抗原結(jié)合，抗原抗體特異性較好。

圖7 Western Blot分析Fig.7 Western Blot assay

2.3.3 表面等離子共振技術(shù)（SPR）檢測(cè)抗體與FGF20結(jié)合動(dòng)力學(xué)特性 將FGF20抗原偶聯(lián)到CM5芯片上，利用BIAcore T200 system對(duì)抗原抗體進(jìn)行親和力檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示離解速率常數(shù)（Kd）為1.07×10-7mol/L（圖8），結(jié)果表明17G3抗體與FGF20表現(xiàn)出極強(qiáng)的親和力和穩(wěn)定性?？梢杂糜诤罄m(xù)癌細(xì)胞的診斷或者靶向治療。

圖8 SRP檢測(cè)抗體與FGF20結(jié)合動(dòng)力學(xué)特性Fig.8 Kinetic assay on antibody binding to FGF20 antigen by SPR

3 討論

目前隨著惡性腫瘤的發(fā)病率不斷增高，腫瘤疾病的診斷，治療方法也在不斷進(jìn)步，單克隆抗體由B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生，具有高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。在疾病研究及診斷中，單克隆抗體由于其特異性強(qiáng)、均一性好、可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷、腫瘤診斷及預(yù)后判斷等方面。作為治療性抗體藥物，由于專(zhuān)一性強(qiáng)、療效顯著，也可以攜帶特定藥物，通過(guò)靶向作用到特定作用位點(diǎn)，用來(lái)干預(yù)癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的各個(gè)信號(hào)通路，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)藥物之一。因此，單克隆抗體是重要的研究工具，診斷試劑和臨床治療手段。目前國(guó)內(nèi)科研，生產(chǎn)檢測(cè)所用到的單克隆抗體，基本為國(guó)外進(jìn)口壟斷，價(jià)格不菲，因此自主研發(fā)制備高質(zhì)量的單克隆抗體顯得十分重要。

有研究表明，F(xiàn)GF20可以與不同的受體結(jié)合，從而產(chǎn)生不同的功能。FGFR2介導(dǎo)的信號(hào)途徑在癌癥發(fā)展的過(guò)程中起到重要作用，F(xiàn)GF20可以與FGFR2結(jié)合，從而激活一系列信號(hào)活動(dòng)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［21-23］。Chamorro等［24］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20是β-catenin的直接下游靶基因，突變的β-catenin能使RK3E細(xì)胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化，說(shuō)明在Wnt信號(hào)通路中，F(xiàn)GF20是促使腫瘤形成的關(guān)鍵因素。Katoh等［25］研究顯示，在胃腸道中，F(xiàn)GF18、FGF20和SPRY4是Wnt信號(hào)通路的有效靶點(diǎn)。另外，Katoh［26］研究發(fā)現(xiàn) FGF20、JAG1 和 DKK1 是 Wnt/βcatenin信號(hào)級(jí)聯(lián)的靶基因，Wnt和FGF信號(hào)通路的串?dāng)_增強(qiáng)了β-catenin和NFAT信號(hào)級(jí)聯(lián)。同時(shí)姜治國(guó)［27］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20高表達(dá)在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要的生物學(xué)作用，可能是Wnt/β-catenin信號(hào)通路被異常激活。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)的表觀遺傳沉默和功能突變存在于多種人類(lèi)癌癥中，這可能是由于β-catenin的累積導(dǎo)致細(xì)胞膜上的表達(dá)量減少［23］。目前關(guān)于FGF20的單克隆抗體的研究，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?？傊S著不斷的深入研究，制備抗FGF20單克隆抗體，無(wú)論是作為腫瘤診斷，還是作為靶向治療都具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建表達(dá)FGF20工程菌，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化獲得了高純度的目的蛋白，通過(guò)免疫小鼠制備鼠單克隆抗體，有限稀釋法篩選獲得了1株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，抗體經(jīng)過(guò)ELISA效價(jià)，WB和SPR檢測(cè)，結(jié)果顯示可以與自制的FGF20目的蛋白和商品化的FGF20蛋白結(jié)合，自制單克隆抗體與FGF20目的蛋白的親和力Kd值達(dá)到1.07×10-7mol/L。該雜交瘤細(xì)胞株表達(dá)的抗體，可用于對(duì)組織細(xì)胞中FGF20蛋白表達(dá)檢測(cè)，癌細(xì)胞診斷，或者靶向治療等研究。本課題組后續(xù)會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行FGF20單克隆抗體的篩選、配對(duì)和FGF20多克隆抗體的制備工作，為開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)FGF20的檢測(cè)試劑盒做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建表達(dá)FGF20的原核載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）plysS中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)分離純化獲得重組蛋白，通過(guò)免疫小鼠，有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，獲得1株穩(wěn)定分泌抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，通過(guò)ELISA、WB等對(duì)抗體進(jìn)行分析鑒定。