低溫異養(yǎng)硝化菌的篩選、鑒定及降解特性研究

李珍陽(yáng) 姜潤(rùn) 劉琳 李思琦 王曉慧

（1. 陜西省西咸新區(qū)空港新城管理委員會(huì)，西安 712034；2. 北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029）

隨著我國(guó)人口數(shù)量的增加，工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，氨氮污染問(wèn)題日益突出［1］。氨氮主要來(lái)源于生活污水、農(nóng)業(yè)灌溉及工業(yè)廢水［2］。氨氮含量過(guò)高不僅會(huì)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，也會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。目前，在氨氮的處理技術(shù)中，生物法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、效率高等優(yōu)勢(shì)，已成為氨氮去除的主流技術(shù)［3］，如連續(xù)流分段進(jìn)水生物脫氮工藝（continuous step feed biological nutrient removal，CSFBNR）［4］，新型預(yù)曝氣/厭氧-缺氧-好氧法（anaerobic-anoxicoxic，OAA）/間歇曝氣的組合工藝（sequencing batch reactor，SBR）［5］等。生物法去除氨氮主要是利用硝化菌來(lái)完成，在好氧條件下，硝化菌會(huì)將NH4+-N或有機(jī)氮降解轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，進(jìn)而在通過(guò)反硝化細(xì)菌完成脫氮。硝化細(xì)菌分為異養(yǎng)型和自養(yǎng)型，與對(duì)環(huán)境因素敏感的自養(yǎng)型硝化菌相比，異養(yǎng)型硝化菌具有適應(yīng)性強(qiáng)，能以多種有機(jī)物作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用［6-9］。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的異養(yǎng)型硝化菌，Gupta等［10］發(fā)現(xiàn)菌株 T. pantotropha 制成的混合菌劑具有較好的硝化能力，Joo、Rout和Zhang等［11-13］也發(fā)現(xiàn)了3種不同菌屬的異養(yǎng)硝化菌，分別為產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）的Alcaligenes faecalis strain 4、芽孢桿菌屬（Bacillus）的Bacillus cereus GS-5 strain、假單胞菌屬（Pseudomonas）的 Pseudomonas stutzeri YZN-001。

然而生物法去除氨氮仍存在較大弊端，在北方地區(qū)尤其是黑龍江省，冬季水溫處于10℃以下，異氧硝化菌的生物活性受到抑制［14］，出水中氨氮含量過(guò)高，最終會(huì)導(dǎo)致出水質(zhì)量不佳。經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，目前低溫菌的篩選存在以下問(wèn)題：（1）篩選溫度過(guò)高，冬季不適用，如趙燕［15］從青藏高原凍土中篩選出3株脫氮優(yōu)勢(shì)菌株，并按一定比例將3株脫氮菌配制成混合菌群投加至氨氮廢水中，在16℃的條件下，配制得混合菌群對(duì)NH4+-N的去除效率達(dá)85%；（2）低溫篩選的菌株氨氮的去除效果不佳，如孫靜等［16］從北方人工濕地分離篩選得到一株菌可8℃條件下進(jìn)行脫氮，氨氮去除率為50.63%。因此篩選出低溫高效的異養(yǎng)硝化菌是解決此類(lèi)問(wèn)題的關(guān)鍵。本研究分別從3種不同的泥樣中，在13℃條件下篩選出3株耐低溫性能較好的異養(yǎng)硝化菌，并對(duì)分離出的菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。根據(jù)前人研究所設(shè)溫度和處理效率的高低［15-16］，選擇更加貼近冬季且處理效率較高的溫度，因此培養(yǎng)溫度設(shè)置為13℃。選用3種不同的污泥制成復(fù)合菌劑，因?yàn)閺?fù)合菌劑可能存在協(xié)同菌株，可以提高氨氮去除效率，同時(shí)進(jìn)行固定化后可避免菌的流失，因此將篩選的菌株按一定比例進(jìn)行混合后形成復(fù)合菌劑，分析碳源種類(lèi)、氮源濃度、pH及鹽度等條件對(duì)菌劑硝化性能影響，進(jìn)而確定最優(yōu)硝化條件，最后對(duì)復(fù)合菌劑進(jìn)行固定化測(cè)定氨氮去除效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 泥樣樣品來(lái)源 泥樣分別取自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的好氧顆粒污泥、冬季北京化工大學(xué)污水處理站活性污泥、江蘇省某污水處理廠生物轉(zhuǎn)盤(pán)污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基的種類(lèi)及成分配比 根據(jù)培養(yǎng)需要，共配置4種類(lèi)型的培養(yǎng)基，分別為活化培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基和異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH范圍7.0-7.4，成分配比如表1所示，培養(yǎng)基的配置參考袁雪嬌［17］培養(yǎng)高效異養(yǎng)硝化菌的配方。配置好的培養(yǎng)基均置于高壓滅菌鍋中121℃，滅菌30 min后再使用。

表1 培養(yǎng)基成分表Table 1 Medium composition

1.1.3 試劑的配制 1 mol/L的NaOH溶液：稱(chēng)取4 g的NaOH固體粉末于燒杯中，加入適量的蒸餾水使之溶解，再用100 mL的容量瓶定容。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分離、純化及保存 富集：將冬季北京化工大學(xué)污水處理站的活性污泥進(jìn)行靜置沉淀，取10 mL沉淀后的活性污泥樣品，5 g生物轉(zhuǎn)盤(pán)泥樣、5 g實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的好氧顆粒污泥，分別置于含無(wú)菌水的錐形瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。錐形瓶中加入少量玻璃珠，將污泥絮體打散，有利于菌的釋放。振蕩一段時(shí)間后靜置10 min，取10 mL的上清液于富集培養(yǎng)基中進(jìn)行異養(yǎng)硝化菌的富集，置于13℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器上培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基渾濁。然后再取10 mL富集培養(yǎng)液于新的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，此步驟重復(fù)4次，以確保得到較高的菌濃度。

分離：取1 mL最終富集培養(yǎng)液于9 mL的無(wú)菌水中進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂屘荻葹?0-1-10-6。選擇10-4、10-5和10-6的稀釋濃度，各取200 μL菌液采用稀釋涂布法涂布于固體培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，每份樣品做3個(gè)重復(fù)，最后置于生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為13℃。

純化：待培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落，通過(guò)平板劃線法反復(fù)劃線得到純化的菌落。

保存：將純化的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中直至斜面長(zhǎng)出菌落后放于4℃冰箱保存，每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行菌株的活化，活化后在進(jìn)行培養(yǎng)接種于斜面。同時(shí)將菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)與已滅菌40%的甘油以1∶1的比例存于-20℃冰箱。

1.2.2 菌株篩選 將上述分離得到的純化菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，吸取適量培養(yǎng)后的菌液置于離心機(jī)上5 000 r/min，離心3 min，然后制備成菌懸液放入含異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在好氧的條件下，在13℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d。測(cè)量培養(yǎng)前后菌液中NH4+-N的含量變化，篩選出能夠在低溫條件下，較好降解NH4+-N的菌株。重復(fù)上述操作，以篩選出高效降解NH4+-N的菌株。將篩選出的菌株進(jìn)行鑒定，包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色及16S rDNA測(cè)序分析。

16S rDNA測(cè)序分析步驟：用DNA試劑盒提取DNA，選取引物27F primer和1492R，序列分別 為AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR反應(yīng)體系如表2所示。PCR反應(yīng)過(guò)程：預(yù)變性94℃ 3 min，進(jìn)行1次循環(huán)；變性 94℃ 30 s；退火 54℃ 30 s；延伸 72℃ 90 s。變性、退火和延伸過(guò)程循環(huán)24次。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

繪制生長(zhǎng)曲線時(shí)，需將斜面培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)篩選的菌株活化，并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3 d測(cè)定一次OD600。

1.2.3 復(fù)合菌株的構(gòu)建 設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，3因素分別為上述篩選出的高效降解菌株命名為AJ-5、BJ-4和CJ-1，3水平分別為接種量1 mL、2 mL和3 mL。將AJ-5、BJ-4和CJ-1活化獲得菌懸液，各菌液調(diào)至OD600相同，按正交實(shí)驗(yàn)的各菌株接種量進(jìn)行混合，然后接種于含100 mL異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基的錐形瓶中13℃，150 r/min培養(yǎng)3 d，測(cè)量培養(yǎng)前后菌液中NH4+-N的含量變化，確定最佳配比。

1.2.4 菌株脫氮因素影響 碳源種類(lèi)、氮源濃度、pH和鹽度對(duì)異養(yǎng)硝化菌的脫氮性能具有顯著的影響［18-23］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取4種碳源（乙酸鈉（CH3COONa）、葡萄糖、檸檬酸鈉、丁二酸鈉），按照C/N=15計(jì)算添加量［24］，5個(gè)氮源濃度梯度（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L 和 400 mg/L），5個(gè)pH值（pH為5、6、7、8和9）和4個(gè)鹽濃度梯度（10 g/L、20g/L、30 g/L和40 g/L）來(lái)探究不同因素對(duì)復(fù)合菌劑去除NH4+-N能力的影響。

1.2.5 復(fù)合菌的固定化及脫氮效率 采用海藻酸鈉-硅藻土對(duì)復(fù)配菌株進(jìn)行包埋固定化，其成分比例為硅藻土1%、海藻酸鈉（sodium alginate，SA）2%、CaCl23%和沸石6%，從污水處理站的曝氣池采集生活污水，NH4+-N 濃度為3.92 mg/L，每升污水中添加NH4Cl 0.04 g，得到NH4+-N含量為15.13 mg/L，進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)，1組作為空白對(duì)照組，2組為游離復(fù)合菌劑組，3組為固定化顆粒組，測(cè)定其處理效果。

1.2.6 測(cè)定方法 NH4+-N測(cè)定采用納氏試劑分光光度法；OD600測(cè)定采用光電比濁法；pH值用FE28 pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選結(jié)果

從活性污泥中篩選出低溫異養(yǎng)硝化菌19株，生物轉(zhuǎn)盤(pán)中篩選出17株，好氧顆粒污泥中篩選出14株，根據(jù)圖1顯示上述部分菌株降解NH4+-N情況，選出降解效率最好的3株菌分別命名為AJ-5、BJ-4和CJ-1，其對(duì)應(yīng)的NH4+-N去除率為70.57%、73.66%和68.14%。

圖1 菌株對(duì)NH4+-N的去除率Fig. 1 Removal rate of NH4+-N by various strains

2.2 菌落的形態(tài)特征

菌株AJ-5在固體培養(yǎng)基上呈乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)易被挑起，革蘭氏染色呈陰性（圖2-A，圖3-A）；菌株BJ-4的菌落形態(tài)呈乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)凸起，邊緣整齊，革蘭氏染色呈陰性（圖2-B，圖3-B）；CJ-1的菌落同樣為乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)，但是邊緣不整齊，革蘭氏染色呈陰性（圖2-C，圖 3-C）。

圖2 各菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of each strain

圖3 革蘭氏染色呈像Fig.3 Gram chromatogram of each strain

2.3 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)16S rDNA測(cè)序結(jié)果分析可知，AJ-5的序列長(zhǎng)度為1 316 bp，BJ-4的序列長(zhǎng)度為1 310 bp，CJ-1的序列長(zhǎng)度為1 327 bp。將測(cè)序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示AJ-5鑒定為Acinetobacter johnsonii strain，BJ-4鑒定為Acinetobacter celticus strain，CJ-1鑒定為Acinetobacter albensis strain，3株菌均為不動(dòng)桿菌屬。選擇Mega.7.0的NJ（neighbour Joining）法構(gòu)建各菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其結(jié)果如圖4-6所示。

圖4 菌株AJ-5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the bacterial strain AJ-5

2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線

AJ-5、BJ-4和CJ-1的OD600的變化情況如圖7所示。從圖中可知，0-15 h內(nèi)，3株菌處于適應(yīng)階段，生長(zhǎng)不明顯。15 h-27 h內(nèi)，各菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，生長(zhǎng)迅速。27 h，CJ-1的OD600最大的濃度值為0.766，27 h-39 h內(nèi)，該株菌處于穩(wěn)定期，OD600變化不明顯，39 h后開(kāi)始有較為明顯的下降趨勢(shì)，此時(shí)菌的數(shù)量減少。AJ-5和BJ-4的OD600的濃度值在30 h左右達(dá)到最大，分別為1.379和0.738，之后AJ-5的OD600的濃度值一直維持在1.3左右的水平，而B(niǎo)J-4則隨時(shí)間增加而減少，BJ-4、CJ-1后期數(shù)量開(kāi)始下降可能是對(duì)碳源的利用能力較低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)短缺導(dǎo)致，因此AJ-5適應(yīng)低溫的環(huán)境能力更強(qiáng)，能夠更高效的利用能源物質(zhì)。綜上所述，為保證充足的生物量，應(yīng)選擇30 h左右的菌液。

圖5 菌株BJ-4的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the bacterial strain BJ-4

圖6 菌株CJ-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of the bacterial strain CJ-1

圖7 菌株生長(zhǎng)曲線圖Fig.7 Growth curve of strain

2.5 復(fù)合菌株最佳配比確定

如上所述，選擇30 h左右的菌液進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定最佳配比，其結(jié)果如表3所示。根據(jù)K值高低可判斷，最佳為A1B1C1即AJ-5、BJ-4和CJ-1各1 mL進(jìn)行混合，氨氮的去除能力可達(dá)72.94%，同時(shí)將復(fù)合菌劑命名為ABCJ-1。對(duì)比各因素的極差R，C因素的R最高為4.15%，說(shuō)明CJ-1接種量對(duì)氨氮去除率影響最大，原因可能是CJ-1的接種量大小會(huì)引發(fā)更為激烈的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，3株菌株的生物量發(fā)生改變，從而影響氨氮的去除率。因此適宜的接種量對(duì)于復(fù)合菌劑的硝化能力也具有重要的意義。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

2.6 菌株脫氮因素研究結(jié)果

2.6.1 碳源種類(lèi)對(duì)復(fù)合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響 本次共選取4種常見(jiàn)的有機(jī)碳源進(jìn)行探究，分別是乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖。不同碳源對(duì)氨氮去除率的影響以及OD600的變化情況如圖8所示。從圖8-A可知，以檸檬酸鈉為唯一碳源菌劑生長(zhǎng)最好，30 h后OD600維持在1.2左右，其次是丁二酸鈉、乙酸鈉，以葡萄糖為唯一碳源菌劑生長(zhǎng)最差，幾乎無(wú)增長(zhǎng)現(xiàn)象。由圖8-B可知，菌劑在檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中NH4+-N去除效率最高為84.91%，丁二酸鈉、乙酸鈉次之去除效率也在65%以上，在葡萄糖培養(yǎng)基中，無(wú)去除效果。綜上所述，檸檬酸鈉為最佳碳源。同時(shí)可以觀察到添加不同碳源的菌劑NH4+-N去除效率與其生長(zhǎng)量變化是一致的，說(shuō)明菌株的生長(zhǎng)量對(duì)于菌劑的硝化能力有直接影響。

圖8 菌劑在不同碳源下OD600濃度變化（A）及NH4+-N去除率變化（B）Fig.8 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different carbon sources

2.6.2 氨氮濃度對(duì)復(fù)合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響 氨氮濃度高低直接影響碳氮比，因此也是影響微生物生長(zhǎng)的重要因子。由圖9-A可知，NH4+-N的濃度為50 mg/L時(shí)，OD600接近1，NH4+-N的濃度為100 mg/L-400 mg/L時(shí)，OD600大于1.1，說(shuō)明菌劑具有較好的耐受性，可在高氨氮濃度下正常生長(zhǎng)。由圖9-B可知，NH4+-N的濃度為50 mg/L，幾乎完全去除，去除率可達(dá)96.92%，但隨著NH4+-N濃度的增加，去除效果越來(lái)越差，可能是C/N過(guò)低，影響了微生物的硝化過(guò)程，抑制了硝化反應(yīng)的進(jìn)行。綜上所述，最適的NH4+-N的濃度為50 mg/L。

圖9 菌劑在不同氮源濃度下OD600濃度變化（A）及NH4+-N去除率變化（B）Fig.9 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different nitrogen source concentration

2.6.3 pH對(duì)復(fù)合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響pH的高低會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)及生物活性，因此選取適宜的pH對(duì)菌劑硝化能力具有重要意義。由圖10-A可知，在pH為5-8范圍內(nèi)，菌劑的生物量會(huì)隨著pH的上升而增加，當(dāng)pH 8時(shí)，OD600濃度值最大約為1.1，當(dāng)pH大于8時(shí)，OD600濃度值小于1，說(shuō)明復(fù)合菌劑更適合在弱堿性的條件下生長(zhǎng)。菌劑在不同初始pH條件下對(duì)NH4+-N的去除效果如圖10-B所示，隨著pH的增加，NH4+-N的去除率從45.2%增值至82%，當(dāng)pH 8時(shí)，NH4+-N的去除率最大為82%，當(dāng)pH＞8時(shí)，NH4+-N的去除率有所下降，因此最佳pH為8。

2.6.4 鹽度對(duì)復(fù)合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了鹽度梯度來(lái)探究不同鹽度對(duì)菌劑生長(zhǎng)及硝化能力的影響。由圖11-A可知，鹽度在10 g/L-30 g/L范圍內(nèi)，菌劑的OD600均可達(dá)到1.1以上，但是會(huì)隨著鹽度增加，生長(zhǎng)所需的時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，當(dāng)濃度大于30 g/L時(shí)，菌劑的生長(zhǎng)狀態(tài)變差，OD600僅0.318。菌劑對(duì)NH4+-N的去除率如圖11-B所示，10 g/L-20 g/L時(shí)，去除效果良好，可達(dá)70%以上，當(dāng)濃度大于30 g/L，去除效率低于60%。綜上所述，菌劑的最適宜的鹽度范圍為10 g/L-20 g/L。

圖11 菌劑在不同鹽度下OD600濃度變化（A）及NH4+-N去除率變化（B）Fig.11 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different salinities

2.7 復(fù)合菌劑的脫氮效果

按照比例硅藻土1%、SA 2%、CaCl23%、沸石6%，在最優(yōu)化的條件下進(jìn)行固定化，1組為空白對(duì)照組未作處理，2組為游離復(fù)合菌劑，3組為固定化菌劑，菌劑對(duì)氨氮的去除效率如圖12所示。隨著時(shí)間增加NH4+-N含量先依次下降后有輕微上升。在48 h時(shí)，1組NH4+-N去除率為40.4%；2組NH4+-N去除率為84.28%；3組NH4+-N的含量降至0.626 mg/L，去除率為95.86%，固定化菌劑處理效果最好。

圖12 固定化菌劑氨氮的去除效率Fig.12 Removal efficiency of ammonia nitrogen immobilized bacteria agent

3 討論

對(duì)復(fù)合菌劑進(jìn)行探究的過(guò)程中，我們分別從碳源種類(lèi)、氨氮濃度、pH、鹽度4個(gè)方面進(jìn)行討論。碳源種類(lèi)不僅影響著異養(yǎng)硝化菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還影響著硝化能力的大?。?5］。有些異養(yǎng)硝化菌如Alcaligenes faecalis No.4［26］對(duì)于碳源要求極為苛刻，從而也限制了該菌的廣泛應(yīng)用，便宜易得、去除效果較好的碳源對(duì)于低溫異養(yǎng)硝化菌的實(shí)際應(yīng)用很重要。ABCJ-1的最佳碳源為檸檬酸鈉，其原因可能是檸檬酸鈉是代謝過(guò)程中的產(chǎn)物，更容易被細(xì)菌利用進(jìn)行代謝繁殖，且分子質(zhì)量小于300，有研究表明，好氧硝化會(huì)受碳源分子質(zhì)量的影響，尤其是分子質(zhì)量小于300的碳源，若濃度過(guò)高會(huì)對(duì)硝化過(guò)程產(chǎn)生顯著的抑制作用［27］。本次以C/N為15計(jì)算碳源的添加量，去除效率可達(dá)84.91%，進(jìn)一步證明了Liu等［24］研究成果的可靠性，同時(shí)在較低碳氮比的條件下進(jìn)行硝化反應(yīng)可有效解決碳源不足等問(wèn)題。

最佳NH4+-N的濃度為50 mg/L，在100 mg/L-400 mg/L濃度范圍內(nèi)，OD600仍維持在1.1。在城市污水處理系統(tǒng)中，自養(yǎng)型硝化菌的比例為0.086，氨氮需要保持一定濃度才能保證自養(yǎng)型硝化菌的正常生長(zhǎng)［28］，而ABCJ-1耐高氨氮濃度，因此氨氮濃度沖擊對(duì)菌劑生長(zhǎng)影響較小，相比之下，復(fù)合菌劑更具有生存優(yōu)勢(shì)。

適宜的pH會(huì)維持微生物體內(nèi)酶的穩(wěn)定性，并通過(guò)影響細(xì)胞膜的電位來(lái)促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用［29］。ABCJ-1的最適pH為8，但在酸性環(huán)境下，復(fù)合菌劑生長(zhǎng)緩慢，菌劑的生長(zhǎng)量小于0.7，其原因可能是在酸性條件下游離氨（NH3）數(shù)量較少，降低了參與硝化反應(yīng)過(guò)程中氨單加氧酶（AMO）的活性，從而會(huì)抑制異養(yǎng)硝化反應(yīng)［30］。

高鹽度廢水會(huì)影響菌體內(nèi)脫氫酶的活性，抑制其生長(zhǎng)和相關(guān)的生理功能［31］，但是也有研究表明，適量的鹽會(huì)促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，如Halomonas campisalis ha3菌［32］，加入適量的NaCl后，生長(zhǎng)速率可達(dá)到 0.58 h-1，本研究確定的最佳鹽度范圍為10 g/L-20 g/L，其適應(yīng)鹽度范圍相比于HN-02菌株［33］更為廣泛。

從復(fù)合菌劑的脫氮效果來(lái)看，固定化顆粒比游離的復(fù)合菌劑去除效果更好，其原因在于復(fù)合菌劑進(jìn)行固定化后，生物的負(fù)荷量高，菌不易流失，生物穩(wěn)定性提升，耐受力也隨之增強(qiáng)［34］。

低溫異養(yǎng)硝化菌對(duì)冬季污水處理廠的污水處理具有重要意義，除了探討環(huán)境因素外還需要探究低溫異養(yǎng)硝化菌的耐冷機(jī)制以及其他功能的發(fā)掘，以更好地應(yīng)用到實(shí)際中，解決冬季生物處理的難題。馬銀鵬等［35］在一株低溫氨氮去除能力較強(qiáng)的異養(yǎng)硝化細(xì)菌Acinetobacter harbinensis HITLi 7T的基因組信息中發(fā)現(xiàn)了冷休克蛋白基因SE27_RS01265，該基因在12.5℃時(shí)進(jìn)行高表達(dá)，因此推測(cè)在不動(dòng)桿菌中，該蛋白是菌株耐冷的主要調(diào)節(jié)因子。同時(shí)Richardson等［36］提出了異養(yǎng)硝化菌的脫氮途徑的假說(shuō)，如圖13所示。該圖不僅列出硝化反應(yīng)涉及的酶，同時(shí)表明了反硝化途徑中參與的酶，因此可通過(guò)判定酶的種類(lèi)來(lái)間接驗(yàn)證是否存在反硝化作用。本次篩選出的低溫復(fù)合菌劑可以在耐冷基因表達(dá)以及是否存在好氧反硝化作用方面進(jìn)行后續(xù)深入地探究。

圖13 異養(yǎng)硝化菌的脫氮途徑Fig.13 Nitrogen removal ways of heterotrophic nitrifying bacteria

4 結(jié)論

從3種不同的泥樣中共篩分出3株低溫異養(yǎng)硝化菌，分別命名為AJ-5、BJ-4和CJ-1，通過(guò)16S rDNA的測(cè)序以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，確定3株菌均屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合菌劑的最佳配比1∶1∶1，將復(fù)合菌劑命名為ABCJ-1，并探究碳源種類(lèi)、氨氮濃度、pH及鹽度對(duì)ABCJ-1脫氮的影響，結(jié)果顯示當(dāng)碳源為檸檬酸鈉，氨氮的濃度為50 mg/L、pH 8、鹽度在10 g/L-20 g/L時(shí)，ABCJ-1硝化能力最好。對(duì)復(fù)合菌劑按照比例硅藻土1%、SA 2%、CaCl23%和沸石6%進(jìn)行固定化后，氨氮的轉(zhuǎn)化能力可達(dá)95.86%。