(1.閩江學(xué)院物理與電子信息工程學(xué)院,福建 福州 350108;2.福建工業(yè)學(xué)校,福建 福州 350002)
共聚焦顯微鏡是光學(xué)顯微鏡的一種,其原理由Minsky于1957年首先提出[1],和傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比,它具有對比度高、分辨率高和獨特的層析能力等特點。自20世紀(jì)80年代以來,共聚焦技術(shù)集成到光學(xué)顯微成像中,逐漸應(yīng)用于微電子制造[2]、材料科學(xué)[3]、工業(yè)精密測量[4]、生物醫(yī)學(xué)[5]和食品安全[6]等領(lǐng)域,為科學(xué)探索、科技創(chuàng)新開辟了新的道路。普通光學(xué)顯微成像技術(shù)在獲得焦面信息的同時也獲得離焦信息,該離焦信息會使圖像清晰度變差,其效果猶如在聚焦處鋪上了一層“薄紗”,降低了圖像的對比度,而共聚焦顯微成像技術(shù)抑制了焦面外的雜散光,確保獲得的圖像只來自樣品聚焦處的信息,即像面和觀測面是完全“共軛”的,也就去除了“薄紗”的影響[7]。與傳統(tǒng)顯微成像技術(shù)相比,共聚焦顯微成像技術(shù)不僅能夠提高圖像的對比度,還能夠?qū)颖具M行層切掃描,實現(xiàn)樣本的三維成像及三維形貌還原[8-9]。
目前應(yīng)用廣泛的激光掃描共聚焦顯微鏡,是在普通光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上增加了共聚焦技術(shù)和激光掃描技術(shù),共聚焦技術(shù)即在光路中增加照明針孔和探測針孔,并使兩個針孔與樣品的聚焦面共軛,達到點照明和點探測的目的。激光掃描技術(shù)即在光路中安裝X方向和Y方向振鏡,分別用于控制經(jīng)過照明針孔后的激光光束對樣品的X方向和Y方向的逐點掃描照明,結(jié)合圖像處理算法,獲得樣品焦面的共聚焦圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡橫向分辨率可以達到普通光學(xué)顯微鏡的2倍(約200 nm),軸向分辨率可達幾百納米,但由于使用了針孔照明,抑制雜散光的同時,也減弱了照明光強度,使得探測器端的量子效率低,圖像信噪比低,每獲得一幅圖像需要逐點掃描,成像效率低,系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,成本高[9]。
基于數(shù)字微鏡器件 (digital micro-mirror device,DMD)實現(xiàn)的共聚焦顯微成像系統(tǒng),利用DMD作為空間光調(diào)制器,產(chǎn)生并行照明針孔,從單點掃描變?yōu)槎嗦凡⑿姓彰鳎綄悠繁砻娴牟煌c進行成像,克服了現(xiàn)有激光掃描共聚焦顯微鏡掃描速度比較慢、操控振鏡或樣品運動的機械控制復(fù)雜等缺點,系統(tǒng)光路結(jié)構(gòu)簡單,成本低[10]。
本設(shè)計包含3個部分:光學(xué)系統(tǒng)、電路系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)有照明和成像兩部分光路,電路系統(tǒng)包括DMD控制電路、攝像頭觸發(fā)控制單元和電動載物臺控制模塊,計算機系統(tǒng)包括實時圖像采集及處理、DMD控制、載物臺控制和人機交互界面4個部分。系統(tǒng)的總體設(shè)計如圖1所示。
圖1 系統(tǒng)總體設(shè)計框圖Fig.1 Overall system design block diagram
圖2 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計圖Fig.2 Optical system design
系統(tǒng)光路包含照明光路和成像光路兩部分,汞燈光源發(fā)出的光經(jīng)過具有科勒照明原理的集光鏡組后變成均勻光,由全反射棱鏡改變?nèi)肷浣嵌?與復(fù)位狀態(tài)下的DMD表面成66°夾角)后照射到DMD表面,經(jīng)過DMD調(diào)制的光束經(jīng)過半反半透棱鏡反射后進入顯微物鏡,照射到樣品表面,樣品的反射光經(jīng)過物鏡后再次經(jīng)過半反半透棱鏡和管鏡后在攝像頭上成像,系統(tǒng)的光路如圖2所示。為了實現(xiàn)共聚焦顯微成像,在光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計中使得DMD、樣品和攝像頭三者共軛。
圖3 DMD及控制器Fig.3 DMD and controller
DMD是TI公司在1987年發(fā)明的一款數(shù)字光學(xué)器件,核心部件由1 024×768個13.68 μm×13.68 μm的正方形微鏡單元構(gòu)成(本系統(tǒng)選用DLP7000-DLP? 0.7 XGA 2xLVDS Type-A DMD款),可以通過控制器編程控制每個微鏡單元在-12°、0°和+12°3個偏轉(zhuǎn)角度之間切換,實現(xiàn)對入射光的調(diào)制。作為新型數(shù)字光處理器件,DMD目前被廣泛應(yīng)用于數(shù)字投影[11]、數(shù)字全息成像[12]、數(shù)字光刻技術(shù)[13-14]、微納光學(xué)測量[15]和結(jié)構(gòu)光照明顯微[16]等領(lǐng)域。DMD及其控制器的外形如圖3所示。
控制器選用德國ViALUX公司的V-7001VIS套件,該控制器基于TI公司的DLP Discovery 4100芯片組,可用于紫外光波段、可見光波段和近紅外波段,支持USB3.0接口,最小可實現(xiàn)1 500 幀·s-1的高速實時數(shù)據(jù)載入,板載8 G Byte的內(nèi)存,可暫存1萬幅1 024×768像素的照明圖案??刂破鞲鶕?jù)下載到控制器內(nèi)存中的圖像或程序,可以實現(xiàn)對DMD照明模式的控制,以達到對光束進行不同模式的調(diào)制,包括實現(xiàn)光點大小、光點間距、線寬和灰度等不同模式的調(diào)制。
共聚焦顯微鏡除了滿足光源、樣品和攝像頭三者共軛關(guān)系外,還具備“點照明和點探測”的特點,以抑制焦點之外的雜散光,達到高成像對比度的目的。
為了實現(xiàn)基于點照明的并行共聚焦顯微成像系統(tǒng),需要通過計算機來設(shè)置DMD的控制器,使其控制DMD陣列循環(huán)產(chǎn)生陣列點光源,DMD只充當(dāng)照明針孔的角色,由于DMD的外形尺寸、微鏡單元大小和間隙固定,故其參數(shù)配置包括針孔大小和周期。綜合測量精度、測量范圍和測量速度之間的關(guān)系,本研究中使用的測量系統(tǒng)的DMD照明參數(shù)選擇2×2個微鏡單元構(gòu)成照明針孔,x方向或y方向各取4個微鏡單元為一個周期T,具體結(jié)構(gòu)如圖4所示。
圖4 DMD照明針孔和周期設(shè)置示意圖Fig.4 Schematic diagram of DMD lighting pinhole and cycle setting
對一個周期是T的照明模式, 需要分別在x方向移動該照明模式,一次一個微鏡單元的距離,產(chǎn)生T幅空間互補的照明圖案,并獲取標(biāo)本相對應(yīng)的圖像;類似地,還需要在y方向移動該照明模式,一次一個微鏡單元的距離,產(chǎn)生T幅空間互補的照明圖案,并獲取此照明條件相對應(yīng)的樣品的圖像;因此對周期是T=4的DMD照明基本模式,需要序列獲取T×T=16幅DMD照明圖案,并獲取16幅圖像??梢酝ㄟ^計算機產(chǎn)生T×T幅二進制灰度圖像,并將這些圖像預(yù)先下載到DMD控制電路的內(nèi)存中,同時指定每一幅照明圖案的停留時間,DMD就會按照指定的時間序列產(chǎn)生T×T幅在空間上互補的照明圖案,這些圖像疊加起來,實現(xiàn)一個視場內(nèi)的(非重復(fù))照明。
共聚焦顯微成像技術(shù),既要有照明針孔,又要有探測針孔。將DMD放置在照明光路與成像光路的共用部分中,使DMD既是照明針孔,又是探測針孔時,從獲取的光斑圖像中可得,在遠(yuǎn)離光軸中心的斑點明顯大于光軸中心處斑點。而將DMD只放置在照明光路中,使得斑點在視場中心與邊緣的差異減小。因此光學(xué)設(shè)計優(yōu)化結(jié)果使得DMD只能作為照明針孔,探測針孔通過DMD微鏡與攝像頭空間的對應(yīng)關(guān)系、DMD微鏡單元與攝像頭單個像素尺寸的對應(yīng)關(guān)系實現(xiàn),該方法實現(xiàn)的探測針孔實際上是虛擬的,也稱為“虛擬針孔”。
由于DMD、圖像傳感器、物鏡成像面處的樣品面三者共軛,使得DMD也處于圖像傳感器的成像面上,因此,DMD的微鏡單元之間的縫隙也將在圖像傳感器上顯現(xiàn),即圖像傳感器上獲取的圖像具有DMD微鏡單元的陰影網(wǎng)格,這成為影響DMD共聚焦顯微成像系統(tǒng)圖像質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)前述選用器件的參數(shù):DMD微鏡單元的尺寸為13.68 μm,攝像頭單個像素的尺寸為6.5 μm。設(shè)置DMD到攝像頭的總體放大倍數(shù)為0.950 3(圖2中的中間體透鏡和管鏡),使得1個DMD微鏡單元在攝像頭端覆蓋2×2個像素,達到DMD邊長13.68 μm的正方形微鏡與圖像傳感器兩個像素邊長13 μm的正方形嚴(yán)格對準(zhǔn)。
攝像頭選用濱松 C11440-22CU數(shù)字sCMOS相機,分辨率為2 048×2 048,像元尺寸為6.5 μm×6.5 μm,全分辨率條件下最大幀率為100幀/s。在共聚焦成像過程中,將DMD控制器的觸發(fā)信號輸出端接攝像頭的觸發(fā)信號輸入端,并將攝像頭設(shè)置為外部觸發(fā)模式,確保DMD每翻轉(zhuǎn)一次到位時,輸出一個信號供相機獲取圖像。DMD處于循環(huán)工作模式,攝像頭開始曝光的時刻由DMD控制器輸出的觸發(fā)信號控制,為了保證攝像頭每次獲取圖像時發(fā)生在DMD已經(jīng)翻轉(zhuǎn)且處于穩(wěn)定的狀態(tài),應(yīng)設(shè)置DMD的翻轉(zhuǎn)時間大于攝像頭的曝光時間,以此種同步捕獲模式重復(fù)直至取完所有的獨立照明模式下的互補圖像。
基于虛擬針孔獲取圖像的方法如下:使用平面反射鏡作為樣品,按照圖4所示的照明模式,下載校準(zhǔn)圖到DMD上,在攝像頭端獲取校準(zhǔn)成像圖,找出照明圖與成像圖中相關(guān)聯(lián)的點,計算出兩幅圖像之間的仿射變換矩陣。再獲取被測樣品的圖像,與上述仿射變換矩陣進行運算,得到每個照明模式下的虛擬針孔成像圖。至此,用虛擬針孔圖濾除了每個共聚焦圖像的雜散光之后將16幅圖像進行濾波、疊加運算,就得到了基于DMD的共聚焦顯微成像圖。
圖5 橫向分辨率測量結(jié)果Fig.5 Lateral resolution measurement
圖6 縱向分辨率測量結(jié)果Fig.6 Longitudinal resolution measurement
為了檢驗基于DMD的并行共聚焦顯微成像系統(tǒng)的橫向與縱向分辨率,選用20× /0.75的物鏡,將鍍鋁膜的平面反射鏡放置于載物臺上,設(shè)置DMD為單點照明模式,在攝像頭端獲取圖像,得到其橫向半高寬 (full width of half maximum,F(xiàn)WHM)曲線如圖5所示,可得實驗測得的橫向分辨率為0.57 μm(理論值為0.45 μm)。
選用20×0.75的物鏡,將鍍鋁膜的平面反射鏡放置于載物臺上,設(shè)置DMD為單點照明模式,控制載物臺做縱向掃描,掃描范圍為40 μm,步進0.1 μm,在攝像頭端獲取400幅圖像,取每幅圖像的光強最大值為評價函數(shù),得到縱向FWHM曲線(圖6),可得實驗測得的縱向分辨率為1.1 μm(理論值為0.93 μm)。
基于DMD的并行共聚焦顯微成像系統(tǒng)除了具有比普通光學(xué)顯微鏡高的分辨率之外,還具有表面層切的能力,設(shè)置為明場照明模式,選用電路板中的焊盤作為檢測對象,將電路板放置于載物臺上,將載物臺沿縱向移動,間隔1 μm,依次獲取100幅圖像,如圖7(a)所示,利用最大值合成算法,得到層切還原圖像如圖7(b)所示。
為了驗證基于DMD的并行共聚焦顯微成像系統(tǒng)提高了顯微成像的對比度和清晰度,以藍(lán)寶石襯底材料作為樣品,分別在明場照明模式和并行共聚焦模式下對樣品的同一位置進行顯微成像實驗。明場模式的實驗條件為設(shè)置DMD全開,在探測端獲取樣品的顯微圖像,如圖8所示。并行共聚焦模式的實驗條件為設(shè)置DMD的照明針孔大小為2×2微鏡單元,周期為x、y方向均為4個微鏡單元,控制DMD產(chǎn)生16幅照明圖像,在探測端獲取對應(yīng)的16幅樣品圖,再經(jīng)過虛擬針孔處理后由計算機合成,得到基于DMD的并行共聚焦圖像,如圖9所示。
圖7 層析能力測試結(jié)果Fig.7 Chromatographic capability test
圖8 明場模式下藍(lán)寶石襯底顯微圖像Fig. 8 Microscopic image of sapphire substrate in bright field mode
圖9 并行共聚焦模式下藍(lán)寶石襯底顯微圖像Fig.9 Microscopic image of sapphire substrate in parallel confocal mode
基于上述在明場照明模式和并行共聚焦模式下對藍(lán)寶石襯底樣品獲取的同一位置的顯微圖像,借助于Brenner函數(shù)
計算相鄰兩個像素灰度差的平方,評價兩種模式下顯微圖像的對比度和清晰度,對比結(jié)果如表1所示。
表1 明場照明模式和并行共聚焦模式對比度和清晰度評價表
由表1可見,基于DMD的共聚焦顯微成像模式比明場情況下獲取顯微圖像的清晰度和對比度提高了1個量級。
使用陣列式數(shù)字微鏡(DMD)作為照明針孔,結(jié)合虛擬針孔技術(shù)實現(xiàn)并行共聚焦顯微成像系統(tǒng)。用數(shù)字控制DMD來快速實現(xiàn)針孔密度、單個針孔尺寸大小、針孔分布模式的微秒量級的快速改變,從而實現(xiàn)快速共聚焦觀察模式以及普通明場觀察模式之間的快速轉(zhuǎn)換。該系統(tǒng)可以直接與普通光學(xué)顯微鏡接口,適用于熒光和非熒光樣品,相信該系統(tǒng)在顯微成像與微納測量領(lǐng)域必將會有廣泛的應(yīng)用空間。