雞球蟲(chóng)多價(jià)多表位亞單位疫苗免疫原性分析及抗球蟲(chóng)感染的效果觀察

陳思穎,黃劍梅,張楊,陳玉鳳,丁文傒,劉佳斌,徐立新,嚴(yán)若峰,宋小凱,李祥瑞

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物健康與食品安全MOE聯(lián)合國(guó)際研究實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

雞球蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的原蟲(chóng)病。它可以導(dǎo)致雞采食量減少、營(yíng)養(yǎng)不良、飼料轉(zhuǎn)換率下降甚至死亡[1]。目前,公認(rèn)的雞球蟲(chóng)有7種,分別為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella)、堆型艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)、毒害艾美耳球蟲(chóng)(E.necatrix)、巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(chóng)(E.mitis)、早熟艾美耳球蟲(chóng)(E.praecox)和布氏艾美耳球蟲(chóng)(E.brunetti)[2],前4種球蟲(chóng)臨床上危害最為嚴(yán)重。

目前藥物是控制球蟲(chóng)病的主要手段。然而抗球蟲(chóng)藥物的使用存在諸多問(wèn)題:球蟲(chóng)存在日益嚴(yán)重的耐藥性,抗球蟲(chóng)藥物殘留易導(dǎo)致食品安全問(wèn)題,新藥研發(fā)昂貴,政府對(duì)于藥物使用的限制等,這些問(wèn)題迫使研究者探索新的球蟲(chóng)預(yù)防策略[3]。而傳統(tǒng)球蟲(chóng)疫苗又存在強(qiáng)毒株易散毒、弱毒株易返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[4],于是越來(lái)越多的學(xué)者將目光投向新型球蟲(chóng)疫苗。亞單位疫苗是一種通過(guò)原核、真核或植物表達(dá)系統(tǒng)獲得重組抗原蛋白來(lái)免疫動(dòng)物而誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的疫苗,具有安全、成本較低、易規(guī)模化制備的優(yōu)勢(shì)[5]。

表面抗原在球蟲(chóng)入侵的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。毒害艾美耳球蟲(chóng)子孢子表面抗原(NA4)是Karel等[6]從毒害艾美耳球蟲(chóng)中純化得到的子孢子表面蛋白,該蛋白能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性,對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的感染起到交叉保護(hù)作用。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子表面抗原(TA4)分布于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子表面,在球蟲(chóng)入侵過(guò)程中起重要作用,TA4基因目前被視為雞球蟲(chóng)DNA疫苗研發(fā)中最有效的候選抗原之一[7]。乳酸脫氫酶(LDH)在毒害艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)上都有表達(dá),其與雞腸道上皮細(xì)胞構(gòu)成的上皮細(xì)胞-球蟲(chóng)抗原復(fù)合物可能是引起免疫效應(yīng)的靶點(diǎn),且LDH蛋白在球蟲(chóng)的不同發(fā)育階段(卵囊、子孢子、裂殖體和裂殖子)有不同程度的表達(dá),這樣能有效提高其對(duì)球蟲(chóng)感染的保護(hù)性,因此LDH是很有潛力的疫苗抗原[8]。從巨型艾美耳球蟲(chóng)中克隆的鈣調(diào)節(jié)蛋白激酶(EmCDPK)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的EtCDPK在球蟲(chóng)卵囊孢子化最后階段表達(dá)量增加,在子孢子侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中,在宿主細(xì)胞膜上檢測(cè)到EtCDPK,提示EtCDPK在子孢子入侵宿主細(xì)胞時(shí)起關(guān)鍵性的作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建多價(jià)多表位DNA疫苗pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1和串聯(lián)細(xì)胞因子IL-2作為佐劑的pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2,試驗(yàn)證明這2個(gè)疫苗針對(duì)柔嫩、毒害、巨型和堆型4種艾美耳球蟲(chóng)感染均能起到免疫保護(hù)效力[10]。本試驗(yàn)在DNA疫苗基礎(chǔ)上構(gòu)建相應(yīng)的原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化重組蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2,分析這2個(gè)重組蛋白的免疫原性并觀察其抵抗多種球蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)效果,為雞球蟲(chóng)病疫苗的研制及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1日齡海蘭白雛雞,購(gòu)自江蘇省南通市某養(yǎng)雞場(chǎng),飼養(yǎng)于提前消毒的無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境中。飼喂清潔的不含任何抗球蟲(chóng)藥的水和飼料。柔嫩、毒害、巨型和堆型4個(gè)艾美耳球蟲(chóng)江蘇分離株均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存,動(dòng)物試驗(yàn)開(kāi)始前復(fù)蘇,以保證卵囊活性。重組蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、尿素及咪唑購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;鼠抗雞CD4、鼠抗雞CD3和鼠抗雞CD8購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司。雞血清IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司。His標(biāo)簽蛋白純化柱(His TrapTMFF crude)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)和表達(dá)載體構(gòu)建

參考GenBank的毒害艾美耳球蟲(chóng)TA4基因(GenBank ID:M21004)、堆型艾美耳球蟲(chóng)LDH基因(GenBank ID:FJ617009)、毒害艾美耳球蟲(chóng)NA4基因(GenBank ID:EU523548)、巨型艾美耳球蟲(chóng)EMCDPK基因(GenBank ID:Z71756)序列,使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。將保存質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別擴(kuò)增出目的基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1(1 296 bp)和目的基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL2(1 740 bp),引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence for PCR

將經(jīng)膠回收純化的基因片段與pET-32a(+)載體分別用BamHⅠ和SalⅠ酶切后用Ligation Mix連接,將其轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21感受態(tài)細(xì)胞中,涂布帶有氨芐青霉素抗性的瓊脂平板。待平板長(zhǎng)出單菌落后,挑取單菌落繼續(xù)培養(yǎng)16 h,使用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒(mini kit)按照說(shuō)明書(shū)提取菌液質(zhì)粒后,依次進(jìn)行PCR后用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒鑒定。鑒定出的陽(yáng)性樣品送安徽通用生物公司測(cè)序。

1.4 重組蛋白的原核表達(dá)及純化

將10 mL陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)接至1 L含氨芐青霉素的LB溶液中,37 ℃條件下待菌液生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入 IPTG誘導(dǎo)3 h,高速離心(8 000 r·min-1,15 min)得到菌體沉淀,將菌體用上樣緩沖液重懸。在-80 ℃反復(fù)凍融3次后用超聲破碎細(xì)胞壁。8 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,沉淀用包涵體上樣緩沖液重懸,4 ℃靜置過(guò)夜。取包涵體上樣緩沖液使用His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱HisTrap HP純化重組蛋白,純化后的蛋白保存在-80 ℃?zhèn)溆?。用同樣方法制備pET-32a標(biāo)簽蛋白。

1.5 重組蛋白的免疫原性分析

1.5.1 重組蛋白的Western blot分析將純化后的重組蛋白與標(biāo)簽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后,用半干的方式將蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜。加5%脫脂奶37 ℃封閉2 h,PBS清洗后,加一抗后分別孵育感染柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲(chóng)的雞血清(1∶50稀釋)。4 ℃過(guò)夜后,用PBS清洗。加二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體,37 ℃孵育1 h后,用PBS清洗。最后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色,觀察記錄結(jié)果。

1.5.3 重組蛋白免疫后血清細(xì)胞因子和特異性IgG抗體水平變化分別在首免前、首免當(dāng)天和二免后第7天取1.5.2節(jié)中各組雛雞各3只,通過(guò)心臟采血分離血清。應(yīng)用雙抗體夾心法檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β水平[11]。IgG抗體檢測(cè)按照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的間接ELISA法進(jìn)行[12]。

1.6 重組蛋白的抗球蟲(chóng)免疫保護(hù)效果評(píng)估

選取2周齡健康且體重接近的雛雞,隨機(jī)分為17組,每組20只雞。免疫組每只雛雞在腿部注射 0.4 mL(200 μg)重組蛋白,PBS對(duì)照組和pET-32a對(duì)照組分別注射0.4 mL的PBS溶液和pET-32a(200 μg)蛋白;3周齡時(shí)同樣方式加強(qiáng)免疫;4周齡時(shí)每組經(jīng)口感染相應(yīng)的新鮮孢子化卵囊:柔嫩和毒害艾美耳球蟲(chóng)均每羽5×104,堆型和巨型艾美耳球蟲(chóng)均每羽1×105。5周齡時(shí)對(duì)所有雞稱重并剖殺,進(jìn)行腸道病變計(jì)分(0～40)[13]。按公式(1)計(jì)算病變值;按公式(2)計(jì)算各組卵囊減少率(%)[14];按公式(3)計(jì)算各組的抗球蟲(chóng)指數(shù)(anticoccidiosis index,ACI),分析各組的抗球蟲(chóng)能力。

病變值=各試驗(yàn)組的平均病變記分(0～4)×10

(1)

(2)

ACI=(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)

(3)

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 21.0 軟件的ANOVA單因素方差分析方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后進(jìn)行電泳。如圖1-A所示:小片段為1 296 bp,與預(yù)期一致。重組質(zhì)粒pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL2經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后進(jìn)行電泳。如圖1-B所示:小片段為 1 740 bp,與預(yù)期一致。

圖1 重組質(zhì)粒pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1(A)和pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2(B)的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pVAX1-NA4-1- TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1(A)and pVAX1-NA4-1-TA4- 1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2(B)M. DNA標(biāo)準(zhǔn)品DL5000 DNA standard DL5000;1. 重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物Recombinant plasmid by double enzyme digestion.

2.2 rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2重組蛋白的純化

將包涵體裂解液和上清液上樣緩沖液分別制樣后進(jìn)行SDS-PAGE,重組蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2完全表達(dá)在包涵體中(圖2-A、B)。使用His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱HisTrap HP純化重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),純化效果良好(圖2-C、D)。

圖2 重組蛋白 rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2 的表達(dá)(A,B)與純化(C,D)Fig.2 Expression(A,B)and purification(C,D)of recombinant protein rN1T1L2E1 and rN1T1L2E1I2M. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 Protein standard marker;1. 全菌體蛋白Whole cell protein;2. 誘導(dǎo)菌超聲裂解后上清液Supernatant after ultrasonic lysis;3. 誘導(dǎo)菌超聲裂解后包涵體Inclusion body after ultrasonic lysis;4. 純化前的蛋白Protein before purification;5. 純化后的蛋白 Protein after purification.

2.3 重組蛋白的Western blot分析

純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上然后進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果(圖3)顯示:rN1T1L2E1可分別被感染柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲(chóng)的雞血清所識(shí)別,在片段大小為65×103處有1條蛋白質(zhì)印跡帶;rN1T1L2E1I2也可被這4種球蟲(chóng)感染雞血清識(shí)別,在片段大小為82×103處有1條蛋白質(zhì)印跡帶。

圖3 Western blot分析rN1T1L2E1(上)和rN1T1L2E1I2(下)蛋白的抗原性Fig.3 The analysis of antigenicity of rN1T1L2E1(above)and rN1T1L2E1I2(below)protein by Western blotA,C,E,G. 一抗分別被柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲(chóng)感染的雞血清E.tenella,E.necatrix,E.maxima,E.acervulina infected chicken serum as the primary antibody;B,D,F,H. 一抗為健康雞的雞血清Healthy chicken serum as the primary antibody.M. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Protein marker;1. rN1T1L2E1;2. rN1T1L2E1I2.

2.4 重組蛋白免疫后脾臟T細(xì)胞亞類(lèi)比例的變化

圖4 重組蛋白免疫后試驗(yàn)雞脾臟淋巴細(xì)胞亞類(lèi)變化的流式圖(a)和統(tǒng)計(jì)圖(b)Fig.4 Flow chart(a)and histogram(b)of lymphocytes subtype in spleen of chickens immunized with recombinant proteinPBS:PBS對(duì)照組PBS control group;pET-32a:pET-32a對(duì)照組pET-32a control group;rN1T1L2E1:rN1T1L2E1試驗(yàn)組rN1T1L2E1 test group;rN1T1L2E1I2:rN1T1L2E1I2試驗(yàn)組rN1T1L2E1I2 test group. The same below.a. 表示免疫后雞脾臟T淋巴細(xì)胞亞類(lèi)變化流式圖(A、B和C、D分別表示一免和二免后和 T淋巴細(xì)胞數(shù))Flow cytometry of T lymphocyte subsets in chicken spleen after immunization(A,B and C,D mean number of T lymphocytes after the first and second immunization);b. 免疫后雞脾臟淋巴細(xì)胞亞類(lèi)變化柱形圖Histogram of lymphocyte subsets in spleen of chickens after immunization.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. The same below.

2.5 重組蛋白免疫后雛雞血清細(xì)胞因子水平的變化

用間接ELISA方法對(duì)重組蛋白免疫誘導(dǎo)的雞血清中細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)。如圖5所示:免疫前各試驗(yàn)組間及與PBS對(duì)照組和pET-32a蛋白對(duì)照組之間的IgG水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。一免后,與PBS組和pET-32a蛋白對(duì)照組相比,免疫組血清TGF-β、INF-γ、IL-4和IL-17的細(xì)胞因子水平顯著升高(P<0.05)。二免后,4種細(xì)胞因子繼續(xù)上升的趨勢(shì)不明顯。

圖5 雞血清中各細(xì)胞因子水平Fig.5 Levels of cytokines in chicken serum

2.6 重組蛋白免疫后雛雞血清IgG水平變化

用間接ELISA方法對(duì)重組蛋白免疫誘導(dǎo)的雞血清中IgG水平進(jìn)行檢測(cè)。如圖6所示:首免后,與對(duì)照組相比,rN1T1L2E1I2試驗(yàn)組血清中IgG水平顯著升高(P<0.05),而rN1T1L2E1試驗(yàn)組IgG水平變化不顯著(P>0.05)。二免后2個(gè)試驗(yàn)組IgG水平繼續(xù)提升,相比對(duì)照組差異更加顯著(P<0.05)。

圖6 雞血清中IgG水平Fig.6 IgG level in chicken serum

2.7 重組蛋白對(duì)球蟲(chóng)感染雛雞的免疫保護(hù)作用評(píng)估

本試驗(yàn)中,各組雛雞的存活率均為100%。由表2可知:與非免疫攻蟲(chóng)對(duì)照組和pET-32a蛋白對(duì)照組相比,rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2抗柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲(chóng)感染試驗(yàn)組的相對(duì)增重率、病變計(jì)分、盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)均差異顯著(P<0.05)。對(duì)于艾美耳球蟲(chóng)不同種的攻擊,2個(gè)試驗(yàn)組在ACI值上有所差異。對(duì)于柔嫩艾美耳球蟲(chóng),rN1T1L2E1試驗(yàn)組在相對(duì)增重率上有優(yōu)勢(shì),ACI值略高于rN1T1L2E1I2試驗(yàn)組;對(duì)于毒害艾美耳球蟲(chóng),rN1T1L2E1與rN1T1L2E1I2試驗(yàn)組的ACI值持平,rN1T1L2E1試驗(yàn)組相對(duì)增重率略高;對(duì)于巨型艾美耳球蟲(chóng),rN1T1L2E1I2組在相對(duì)增重率和病變計(jì)分減輕方面占優(yōu)勢(shì),其ACI值高于rN1T1L2E1組;對(duì)于堆型艾美耳球蟲(chóng),rN1T1L2E1組ACI值略高于rN1T1L2E1I2組。綜上所述,未串聯(lián)IL-2基因的重組疫苗rN1T1L2E1抗球蟲(chóng)效力優(yōu)于串聯(lián)IL-2基因作為佐劑的重組疫苗rN1T1L2E1I2。

表2 重組蛋白rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2對(duì)柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲(chóng)感染的保護(hù)效果Table 2 Protective effect of recombinant protein rN1T1L2E1 and rN1T1L2E1I2 against E.tenella, E.necatrix,E.maxima and E.acervulina

3 討論

rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2誘導(dǎo)血清中IFN-γ、IL-4和TGF-β的水平顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明其能激活以Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。雖然部分學(xué)者認(rèn)為抗體在抗球蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮作用有限[18]，但也有學(xué)者認(rèn)為體液免疫也可以發(fā)揮一定的免疫保護(hù)效果[19]。Wallach[20]研究表明,用巨型艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原免疫母雞后可以激發(fā)母雞的母源抗體,借此保護(hù)雛雞抵抗球蟲(chóng)感染;另外用特異性IgG對(duì)雞進(jìn)行被動(dòng)免疫的策略也起抗球蟲(chóng)的效果[21]。本試驗(yàn)中,相較PBS對(duì)照組,rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2能夠顯著提高雞血清中IgG水平，加強(qiáng)免疫后,試驗(yàn)組IgG水平進(jìn)一步提高。說(shuō)明這2個(gè)重組蛋白均能有效激發(fā)機(jī)體的體液免疫。Western blot結(jié)果證明這2個(gè)重組蛋白具有針對(duì)4種球蟲(chóng)的免疫原性和抗球蟲(chóng)活性,說(shuō)明rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2具有良好的免疫原性。

球蟲(chóng)的多價(jià)多表位疫苗是指針對(duì)多種球蟲(chóng)均有抵抗作用,同時(shí)攜帶多個(gè)目標(biāo)抗原上表位或輔助性表位的疫苗[22]。多價(jià)多表位亞單位疫苗表達(dá)重組的抗原表位,選擇的表位多來(lái)自抗原分子的保守氨基酸序列[23],這樣能夠有效應(yīng)對(duì)球蟲(chóng)基因的高頻突變帶來(lái)的免疫逃避問(wèn)題。在本文抵抗4種球蟲(chóng)感染的動(dòng)物試驗(yàn)中,試驗(yàn)組相對(duì)增重率顯著增高,表明 rN1T1L2E1和rN1T1L2E1I2能夠緩解因4種球蟲(chóng)感染造成的體重?fù)p失和飼料轉(zhuǎn)化率下降的問(wèn)題;試驗(yàn)組病變計(jì)分顯著下降,說(shuō)明重組蛋白能夠減輕由于球蟲(chóng)感染帶來(lái)的盲腸壁肥厚、腸芯或盲腸腫大、小腸黏膜損傷、腸管充氣、腸道充血等腸道癥狀;試驗(yàn)組盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)顯著下降,表明重組蛋白能夠減少感染雞的球蟲(chóng)卵囊數(shù),抑制球蟲(chóng)在腸道內(nèi)的發(fā)育和生活史。試驗(yàn)組抗球蟲(chóng)指數(shù)ACI值明顯高于對(duì)照組,表明重組蛋白可對(duì)4種球蟲(chóng)感染提供交叉免疫保護(hù)力,可作為抵抗多種球蟲(chóng)感染的候選抗原。

IL-2是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞因子佐劑,IL-2能夠增強(qiáng)單核細(xì)胞與NK細(xì)胞的殺傷活性,同時(shí)能促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖分化,在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤、感染性疾病的治療上起著重要的作用[24]。研究表明,雞IL-2和IL-7共表達(dá)能夠增強(qiáng)雞VP2 DNA疫苗針對(duì)IBDV的保護(hù)效果[25]。TA4基因和雞IL-2串聯(lián)的DNA疫苗對(duì)雞球蟲(chóng)病具有良好的免疫保護(hù)作用[26]。而柔嫩艾美耳球蟲(chóng)5401基因與IL-2串聯(lián)型DNA疫苗能夠增強(qiáng)抗雞球蟲(chóng)效力[27]。但在本試驗(yàn)中,表達(dá)IL-2基因的rN1T1L2E1I2與未表達(dá)IL-2基因的rN1T1L2E1的抗球蟲(chóng)能力相當(dāng)。這可能與雞IL-2重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)變化和蛋白活性變化有關(guān)。這提示下一步試驗(yàn)中,雞IL-2重組蛋白應(yīng)單獨(dú)表達(dá),與候選抗原共同免疫以進(jìn)一步觀察抗球蟲(chóng)效力是否得到提升。

本試驗(yàn)使用不添加任何佐劑的重組亞單位疫苗,相比任喆[9]構(gòu)建的DNA疫苗抗球蟲(chóng)指數(shù)略有下降。這可能因?yàn)橹亟M亞單位疫苗是在體外表達(dá)純化的病原體蛋白,難以保持蛋白的天然構(gòu)象表位,誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度減弱導(dǎo)致的。相對(duì)傳統(tǒng)疫苗,其存在難以穿過(guò)細(xì)胞膜、在細(xì)胞微環(huán)境容易被迅速降解等缺點(diǎn)。另外重組蛋白疫苗通常要求多次接種,因此聯(lián)合安全有效的免疫佐劑對(duì)于誘導(dǎo)足夠水平的免疫保護(hù)具有重要作用[28]。重組亞單位疫苗優(yōu)化了抗原基因的免疫原性,可規(guī)?；a(chǎn),其成分單純,避免了減毒疫苗或滅活疫苗的免疫抑制原和反應(yīng)原。另外,重組亞單位疫苗是在無(wú)致病性和無(wú)害的微生物中表達(dá),保證生物安全性[29]。因此它是一種更有潛能的新型疫苗。本試驗(yàn)中重組蛋白表達(dá)量大,純化效果良好,證明其具有規(guī)模化生產(chǎn)的潛能。后續(xù)工作將圍繞最適佐劑選擇、最適免疫途徑、最適免疫劑量逐步展開(kāi)。