ZFP36互作蛋白基因OsGRP1的克隆及其在ABA誘導的抗氧化防護途徑中的功能分析

陸秋萍,季鍔,蔣明義

(南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,江蘇 南京 210095)

ZFP36屬于C2H2類型的鋅指蛋白,已有研究證明其作為轉(zhuǎn)錄因子參與植株抗氧化防護以及在水稻抗稻瘟病過程中起重要作用[1-3]。以ZFP36為誘餌進行酵母雙雜交篩庫試驗,將得到的結(jié)果進行序列比對,發(fā)現(xiàn)了1個互作蛋白OsGRP1。OsGRP1是富集甘氨酸蛋白(glycine-rich protein,GRP),在植物中富含甘氨酸蛋白質(zhì)的特點是存在半重復的富含甘氨酸的基序[4]。一般來說,這些基因呈現(xiàn)出發(fā)育調(diào)控和組織特異的表達模式[5]。在一些植物中,它們的表達也受到生物和非生物因素的調(diào)控。

植物GRP的分類是基于其一般結(jié)構(gòu),再考慮甘氨酸重復的排列以及保守基團的存在[6]。Ⅰ類GRP可能包含1個信號肽和1個高甘氨酸含量區(qū)域,有(GGX)n重復[7]。Ⅱ類GRP也可能包含1個信號肽,并含有1個特征性的富含半胱氨酸的C末端。Ⅲ類GRP可能含有1個信號肽,并且與其他類別相比,含有較低的甘氨酸含量。在這些蛋白質(zhì)中,油素域是這一子群的標志性基團[8]。Ⅳ類GRP又稱為RNA結(jié)合型GRP,除了富含甘氨酸的域外,它們還存在1個RNA識別基序(RRM)或1個冷休克結(jié)構(gòu)域(CSD),它們的結(jié)構(gòu)中還可能存在CCHC鋅指結(jié)構(gòu)[9]。根據(jù)不同的域排列,Ⅳ類GRP又分為Ⅳa(除富含甘氨酸域外,還含有1個RRM基團)、Ⅳb(1個RRM和1個CCHC鋅指)、Ⅳc(1個冷休克域和2個或更多鋅指域)和Ⅳd(2個RRM)[10-11]。此外,在桉樹屬基因組中還發(fā)現(xiàn)了1組具有高甘氨酸含量但具有混合重復模式的GRP,也存在于擬南芥和水稻基因組中,因此提出了一類新的GRP(第Ⅴ類)[12]。

根據(jù)已有研究和BLAST蛋白序列比對,我們發(fā)現(xiàn)OsGRP1與擬南芥中At3g20470、At5g07530、At4g36020和At4g368680同源,At3g20470屬于Ⅰ類GRP,與植物細胞伸長相關(guān),At5g07530屬于Ⅲ類GRP,在花藥的授粉競爭中發(fā)揮作用[13],At4g36020和At4g368680均屬于Ⅳc類GRP,在冷脅迫、離子和滲透脅迫中起作用[14-16]。OsGRP1與擬南芥中At3g20470、At5g07530的親緣關(guān)系更近。

植物激素脫落酸(abscisic acid,ABA)參與植物生長發(fā)育的各個方面,包括種子成熟與休眠、植物開花與果實成熟等[17-20]。ZFP36參與了ABA誘導的抗氧化防護途徑[21],通過影響CAT、SOD等抗氧化防護酶以及NADPH氧化酶活性參與到維護植物氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)中[22]。已證明ZFP36和OsGRP1互作的真實性,ZFP36在ABA誘導的抗氧化防護途徑中如此重要[23],且OsGRP1與Ⅳc類GRP的親緣關(guān)系相近,那么OsGRP1是否會在ABA誘導的抗逆過程中發(fā)揮作用?本試驗采用ABA、H2O2、NaCl模擬離子脅迫,聚乙二醇(PEG)模擬干旱脅迫分別對‘日本晴’幼苗進行時間進程處理,表明OsGRP1基因表達受其誘導上調(diào)。為了進一步驗證OsGRP1是否參與抗逆,我們又通過酶活性檢測、遺傳表型等分析方法,最終證明 OsGRP1 確實參與ABA誘導的抗氧化防護途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株與載體

用于Co-IP試驗的煙草為本生煙煙草,用于BiFC試驗、RT-qPCR分析表達量等試驗所需的水稻為野生型‘日本晴’,用于抗氧化防護及耐逆性分析所需的OsGRP1超表達材料由武漢天問生物科技有限公司構(gòu)建,OsGRP1突變體材料由本實驗室構(gòu)建,以上植物材料均由本實驗室保管。

大腸桿菌感受態(tài)細胞EscherichiacoliDH5α、原核表達蛋白菌株Rosetta(DE3)購于TaKaRa公司;農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為GV3101購于南京沃華生物科技有限公司;酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株Y187 Yeast Strain、Y2H Gold Yeast Strain為實驗室原有保存的菌株。pMD19-T載體購于TaKaRa公司;Y2H試驗中的pGADT7、pGBKT7,GST pull-down試驗中的pET30a、pGEX-4T-1,Co-IP試驗中的pCMBIA1300-Flag、pCMBIA1300-Myc以及BiFC試驗中的pSCYCE、pSCYNE等載體均由本實驗室保存。

1.2 OsGRP1基因系統(tǒng)進化樹分析

通過國家水稻數(shù)據(jù)中心查詢OsGRP1基因的CDS序列和氨基酸序列,把OsGRP1編碼的氨基酸序列與GenBank中其他植物的氨基酸序列比較并進行同源性分析。利用MEGA 5軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.3 Y2H、GST pull-down、Co-IP、BiFC驗證互作

構(gòu)建pGADT7-ZFP36和pGBKT7-OsGRP1融合質(zhì)粒,用Y187 Yeast Strain和Y2H Gold Yeast Strain菌株制作感受態(tài),通過PEG-LiAc轉(zhuǎn)化體系,將質(zhì)粒導入感受態(tài)內(nèi),涂布到缺色氨酸和亮氨酸(SD/-Trp/-Leu)的二缺培養(yǎng)基上,把長大的菌落用無菌水稀釋,并滴在含有X-α-gal的缺色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-gal)的四缺培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2 d左右。

構(gòu)建GST-OsGRP1和His-ZFP36重組質(zhì)粒,通過原核表達體系表達重組蛋白和GST蛋白,在Pull-down結(jié)合緩沖液中,使試驗組GST-OsGRP1蛋白與His-ZFP36蛋白以及對照組GST蛋白與His-ZFP36蛋白充分結(jié)合2 h,在緩沖液中結(jié)合后利用磁力架吸附GST標簽蛋白,并用PBS清洗3次,在SDS-PAGE中分離蛋白,并用anti-His或者anti-GST單克隆抗體檢測蛋白。

構(gòu)建ZFP36-Flag和OsGRP1-Myc重組質(zhì)粒,利用煙草真核表達體系,把質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌GV3101介導侵染本生煙草,暗培養(yǎng)12 h,28 ℃光照培養(yǎng)2 d后,取葉片研磨提取蛋白,加入anti-Myc單克隆抗體及 protein A beads珠子進行免疫沉淀,在SDS-PAGE中分離蛋白,試驗組用anti-Flag或者anti-Myc進行免疫印跡檢測蛋白。

構(gòu)建pSCYNE-OsGRP1和pSCYCE-ZFP36重組質(zhì)粒進行BiFC試驗,分離水稻原生質(zhì)體,利用PEG-CaCl2體系將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進原生質(zhì)體,26 ℃培養(yǎng)過夜,在激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光表達情況。

1.4 水稻幼苗期OsGRP1基因表達模式分析

在28 ℃、光照/黑暗時間16 h/8 h條件下培養(yǎng)野生型‘日本晴’水稻2周,用ABA、H2O2和H2O等按照時間梯度處理幼苗,分別取3株處理過的水稻幼苗,其中水處理為對照,用液氮在研缽中將整株幼苗研磨成白色粉末,用Trizol法提取植物總RNA,按照ABm公司的方案進行反轉(zhuǎn)錄,設(shè)計RT-qPCR引物,用翊圣公司的定量試劑預混樣品,采用Bio-Rad定量PCR儀進行反應(yīng),以水稻β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量,試驗重復3次。

為了探究ABA是如何誘導OsGRP1基因的表達上調(diào),將培養(yǎng)2周的水稻幼苗用ddH2O、H2O2清除劑二甲基硫脲(DMTU)和H2O2抑制劑二苯基氯化碘(DPI)預處理水稻幼苗4 h,再分別用ABA誘導20和240 min后取樣,以同等條件下ddH2O處理為空白對照組。用上述方法提取水稻總RNA,反轉(zhuǎn)錄后用 RT-qPCR 進行OsGRP1基因表達量的分析,試驗重復3次。

1.5 OsGRP1轉(zhuǎn)基因水稻中OsGRP1基因表達量分析

將得到穩(wěn)定遺傳的OsGRP1轉(zhuǎn)基因水稻幼苗移栽至大田,收獲種子進行萌發(fā),待其長到3葉期幼苗的時候,分別取3株幼苗提取RNA,再反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過RT-qPCR進行OsGRP1基因表達量的測定,使用GraphPad Prism 7軟件進行數(shù)據(jù)及誤差分析。

1.6 OsGRP1基因參與ABA調(diào)控的抗氧化防護過程分析

將OsGRP1超表達植株、突變體植株和野生型‘日本晴’培養(yǎng)至3葉期,置于ddH2O中培養(yǎng)4 h以上,使水稻內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)態(tài),再用100 μmol·L-1ABA處理2 h,以同等條件下ddH2O處理的幼苗為對照組,試驗組和對照組分別取20株進行處理。10株用于提取葉片RNA,再反轉(zhuǎn)為cDNA,通過RT-qPCR測定其抗氧化防護酶基因OsCatB和OsSodCc2的表達量;另10株用于提取蛋白粗酶液,測定CAT和SOD活性,分析OsGRP1基因在水稻ABA誘導的抗氧化防護途徑中的作用。在水稻數(shù)據(jù)庫中找到基因OsGRP1、OsCatB和OsSodCc2的序列,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計用于RT-qPCR的引物,引物序列見表1。

表1 本研究RT-qPCR所用的引物Table 1 The primers used for RT-qPCR in this study

1.7 OsGRP1基因在水稻干旱、氧化脅迫中的耐逆性分析

將OsGRP1超表達植株、突變體植株和野生型‘日本晴’培養(yǎng)至3葉期,分別用20% PEG 4000和100 mmol·L-1H2O2進行處理,其中OsGRP1-OE1、OsGRP1-OE2、OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2各18株(OE代表超表達植株,KO代表突變體植株),野生型(WT)有36株。處理15 d后,觀察其生理表型并統(tǒng)計其存活率、株高、鮮重和根長。然后對其進行復水,復水14 d后,再次觀察其生理表型,并統(tǒng)計其存活率、株高、鮮重和根長,試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGRP1的系統(tǒng)進化樹分析

OsGRP1基因的全長為642 bp,編碼214個氨基酸,將OsGRP1編碼的氨基酸序列與GenBank中其他植物的氨基酸序列比較并進行同源性分析。從圖1可知:水稻OsGRP1與擬南芥中At3g20470、At5g07530、At4g36020和At4g368680等同源,且與At3g20470和At5g07530親緣關(guān)系最近。

圖1 水稻OsGRP1與其他物種同源蛋白的進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of OsGRP1 in Oryza sativa and homologous proteins of other species括號內(nèi)數(shù)值代表GRP家族中的分類。The number in parentheses indicate classification of GRP family.

2.2 OsGRP1與ZFP36互作真實性驗證

從Y2H試驗結(jié)果(圖2-A)可知,在二缺酵母板上,所有酵母菌長勢飽滿,狀態(tài)健康,說明酵母轉(zhuǎn)化體系正常;在四缺酵母板上,陽性對照pGADT7-T+pGBKT7-53正常生長并且變藍,陰性對照pGADT7-T+pGBKT7-Lam不生長也不變色,pGADT7-ZFP36+pGBKT7和pGBKT7-OsGRP1+pGADT7-T同樣不生長也不變色,說明2個蛋白均不存在自激活現(xiàn)象,試驗組pGADT7-ZFP36+pGBKT7-OsGRP1正常生長并變藍。這說明OsGRP1與ZFP36在酵母菌內(nèi)存在相互作用。

從GST pull-down試驗結(jié)果(圖2-B)可知,Input分析顯示所有蛋白都正常表達,并在試驗組GST-OsGRP1+His-ZFP36中,用anti-His單克隆抗體檢測出有His-ZFP36的條帶,說明GST-OsGRP1蛋白在體外把His-ZFP36蛋白“拉住”,這說明OsGRP1與ZFP36在體外存在相互作用。

從Co-IP試驗結(jié)果(圖2-C)可知,Input分析顯示所有蛋白都正常表達,并在試驗組ZFP36-Flag+OsGRP1-Myc中,用anti-Flag單克隆抗體檢測出ZFP36-Flag的條帶,說明OsGRP1與ZFP36在煙草體內(nèi)存在相互作用。

從BiFC試驗結(jié)果(圖2-D)可知,通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在對照組pSCYNE-OsGRP1+pSCYCE和pSCYCE-ZFP36+pSCYNE沒有觀察到熒光,說明其沒有合成YFP完整蛋白,試驗組pSCYNE-OsGRP1+pSCYCE-ZFP36在YFP激發(fā)光下細胞核發(fā)出黃色熒光,說明OsGRP1與ZFP36互作,YFP在細胞核中完整組合并成功表達YFP蛋白。這說明OsGRP1與ZFP36在原生質(zhì)體內(nèi)存在相互作用,并初步判斷兩者共定位于細胞核中。

圖2 OsGRP1和ZFP36相互作用真實性的驗證Fig.2 Verification of the authenticity of the interaction between OsGRP1 and ZFP36A. 酵母雙雜交驗證OsGPR1與ZFP36互作;B. GST pull-down驗證OsGPR1與ZFP36互作;C. Co-IP驗證OsGPR1與ZFP36互作;D.BiFC驗證OsGPR1與ZFP36互作。A. Yeast two-hybrid verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36;B. GST pull-down verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36;C. Co-IP verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36;D. BiFC verifies the interaction between OsGPR1 and ZFP36.

2.3 水稻幼苗期OsGRP1基因表達模式分析

用ABA處理野生型‘日本晴’水稻幼苗,與對照相比,OsGRP1基因表達量分別在20和240 min極顯著上升,在20和240 min出現(xiàn)峰值(圖3-A);不同時間H2O2處理野生型‘日本晴’水稻幼苗,與對照相比,OsGRP1基因表達量分別在10和90 min極顯著上升,在10和360 min出現(xiàn)峰值(圖3-B)。用NaCl模擬離子脅迫,用PEG模擬干旱脅迫分別對野生型‘日本晴’水稻幼苗進行不同時間處理。與對照相比,OsGRP1基因表達量分別在45和180 min極顯著上升,在45和180 min出現(xiàn)峰值(圖3-C);與對照相比,OsGRP1基因表達量在60和240 min極顯著上升,在60和240 min出現(xiàn)峰值(圖3-D)。以上結(jié)果證明OsGRP1基因的表達受ABA、H2O2、NaCl和PEG誘導上調(diào)。

在沒有外源ABA誘導的情況下OsGRP1的表達不會受到二甲基硫脲(DMTU)和二苯基氯化碘(DPI)影響;對照組在ABA誘導后,OsGRP1基因的表達量顯著上升,而經(jīng)DMTU和DPI預處理后的樣品經(jīng)ABA誘導后,OsGRP1基因的表達量并無明顯上升(圖3-E)。這證明ABA是通過誘導產(chǎn)生內(nèi)源H2O2來實現(xiàn)誘導OsGRP1基因的表達上調(diào)。

圖3 水稻幼苗期OsGRP1基因表達量分析Fig.3 Analysis of OsGRP1 gene expression level in rice seedlingsA—D. ABA、H2O2、NaCl和PEG處理對水稻中OsGRP1基因表達的影響;E. DMTU、DPI處理后,再用ABA處理對OsGRP1基因表達的影響。CK:不作預處理;DMTU:H2O2清除劑二甲基硫脲(DMTU)預處理水稻幼苗4 h;DPI:H2O2抑制劑二苯基氯化碘(DPI)預處理水稻幼苗4 h。 *P<0.05,**P<0.01。下同。A-D. The effects of ABA,H2O2,NaCl and PEG treatment on the expression of OsGRP1 gene in rice;E. The effect of DMTU and DPI treatment and then treatment with ABA on the expression of OsGRP1 gene. CK:No pretreatment;DMTU:H2O2 scavenger dimethylthiourea(DMTU)pretreatment of rice seedlings for 4 h;DPI:H2O2 inhibitor diphenyl iodide chloride(DPI)pretreatment of rice seedlings for 4 h. *P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

2.4 OsGRP1轉(zhuǎn)基因水稻中OsGRP1基因的表達

從圖4可見:超表達水稻中OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2的OsGRP1基因表達量極顯著高于野生型WT,OsGRP1-OE1水稻中OsGRP1基因表達量約是對照組的6倍,OsGRP1-OE2水稻中OsGRP1基因表達量是對照組的5倍多。在突變體水稻中OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2的OsGRP1基因表達量極顯著低于WT,與對照組相比,OsGRP1基因基本不表達,說明OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻中OsGRP1基因被敲除。

圖4 RT-qPCR分析OsGRP1轉(zhuǎn)基因水稻中OsGRP1基因的表達Fig.4 RT-qPCR analysis of OsGRP1 gene expression in OsGRP1 transgenic riceWT:野生型水稻W(wǎng)ild-type rice;OsGRP1-OE1/OE2:OsGRP1基因超表達水稻2個株系Two strains of rice overexpressing OsGRP1 gene;OsGRP1-KO1/KO2:OsGRP1基因突變體水稻2個株系Two strains of rice mutant of OsGRP1 gene.

2.5 OsGRP1參與ABA調(diào)控的抗氧化防護過程

植物的抗氧化防護是其體內(nèi)各種相關(guān)酶協(xié)同作用的結(jié)果,包括CAT和SOD等,通過RT-qPCR技術(shù),測定在OsGRP1轉(zhuǎn)基因材料中抗氧化防護酶基因OsCatB和OsSodCc2的轉(zhuǎn)錄情況,以‘日本晴’作為對照。從圖5-A可見:OsCatB和OsSodCc2轉(zhuǎn)錄水平受ABA調(diào)控,在OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2水稻中,OsCatB和OsSodCc2基因的表達量高于野生型(WT),ABA處理組OsCatB和OsSodCc2基因的表達量顯著高于對照組;在OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻中,OsCatB和OsSodCc2基因的表達量低于WT,ABA處理組OsCatB和OsSodCc2基因的表達量高于對照組,可以證明OsGRP1參與ABA途徑的抗氧化防護酶基因表達的調(diào)控。

從圖5-B可見:CAT和SOD活性的變化趨勢與圖5-A中類似,在OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2水稻中,CAT和SOD活性高于WT,ABA處理組CAT和SOD活性顯著高于對照組;在OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻中,CAT和SOD活性低于WT,ABA處理組CAT和SOD活性高于對照組,但不能恢復到與WT同等活性,證明OsGRP1參與ABA途徑的抗氧化防護酶活性的調(diào)控。上述結(jié)果證明 OsGRP1參與ABA調(diào)控的抗氧化防護過程。

圖5 OsGRP1參與ABA調(diào)控的抗氧化防護分析Fig.5 Antioxidant protection analysis of OsGRP1 involved in ABA regulationA、B. OsGRP1基因調(diào)控抗氧化防護酶基因OsCatB和OsSodCc2的表達;C、D. OsGRP1基因調(diào)控抗氧化防護酶CAT和SOD的活性。A,B. OsGRP1 gene regulates the expression of antioxidant protection enzyme genes OsCatB and OsSodCc2;C,D. OsGRP1 gene regulates the activities of antioxidant protection enzymes CAT and SOD.

2.6 OsGRP1基因?qū)λ靖珊得{迫和氧化脅迫的影響

從圖6可見:在對照組,不同材料在株高、鮮重和根長方面表現(xiàn)無顯著差異,在20% PEG 4000模擬干旱脅迫和100 mmol·L-1H2O2模擬氧化脅迫處理組,OsGRP1-OE1和OsGRP1-OE2幼苗株高、根長以及存活率都顯著高于WT幼苗;OsGRP1-KO1和OsGRP1-KO2水稻幼苗株高、根長以及存活率都顯著低于WT。證明超表達OsGRP1基因增強了水稻對干旱脅迫和氧化脅迫的耐受性。

圖6 OsGRP1轉(zhuǎn)基因水稻對干旱脅迫和氧化脅迫的耐受性分析Fig.6 Tolerance analysis of OsGRP1 transgenic rice to drought stress and oxidative stressA. 20% PEG 4000模擬干旱脅迫條件下的水稻表型;B. 100 mmol·L-1 H2O2模擬氧化脅迫條件下的水稻表型;C. 在干旱和氧化脅迫下水稻存活率、株高、鮮重和根長。A. Phenotype of rice under 20% PEG 4000 simulated drought stress conditions;B. Phenotype of rice under simulated oxidative stress conditions with 100 mmol·L-1 H2O2;C. Under drought and oxidative stress,the statistics of rice survival rate,plant height,fresh weight and root length.

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中會不斷受到生物和非生物逆境脅迫,影響其正常生長發(fā)育,在長期的進化過程中,植物演變出多種防護體系抵御外界的傷害,其中ABA所介導的抗氧化防護途徑尤為重要。當植物遭遇干旱、鹽等非生物脅迫時,體內(nèi)會迅速積累ABA,所積累的ABA作為信號分子,能增加植物體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生,同時上調(diào)抗氧化防護系統(tǒng)的活性,增強植物對干旱脅迫的耐性。在ABA信號途徑中Ca2+、ROS信號彼此交叉聯(lián)系起作用,植物中ABA與其受體結(jié)合后,依靠胞內(nèi)多種傳遞信號分子(Ca2+、ROS等)將信號向下游傳遞,其中ROS作為胞內(nèi)的第二信使(以H2O2最為典型)受ABA誘導后,會激活質(zhì)膜上Ca2+通道進而調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉;另外ABA又通過誘導抗氧化防護酶CAT、SOD、APX活性增加和GR基因表達來消除ROS對細胞產(chǎn)生的氧化損傷[24-27]。

研究表明,許多轉(zhuǎn)錄因子與ABA參與的逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)。擬南芥中與逆境相關(guān)的鋅指蛋白基因AtSAP5主要在根中表達并受高鹽、干旱和低溫的誘導,無論在擬南芥正常生長條件還是干旱脅迫下AtSAP5的過量表達能夠促進其他干旱逆境相關(guān)基因的表達,并增強轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性,且AtSAP5具有E3泛素連接酶活性,是一種逆境響應(yīng)的正調(diào)節(jié)物。實驗室前期研究證明水稻鋅指蛋白ZFP36作為一種鋅指型轉(zhuǎn)錄因子,參與ABA誘導的抗氧化防護途徑,并且ZFP36能夠正向調(diào)控抗氧化酶(CAT、SOD、APX)活性和其相關(guān)基因的表達,從而提高水稻對干旱脅迫和氧化脅迫的耐受性[28]。

本研究中,水稻OsGRP1作為非典型的甘氨酸富集基因,經(jīng)過遺傳進化分析,其與擬南芥中At3g20470和At5g07530基因同源,而這2個基因分屬Ⅰ類和Ⅲ類甘氨酸富集基因,又因為OsGRP1是由酵母雙雜交篩庫得到的轉(zhuǎn)錄因子ZFP36的互作因子,而ZFP36在ABA調(diào)控的抗氧化防護途徑中具有重要作用,因此OsGRP1也可能在植物抗逆的生理過程中發(fā)揮重要作用。

本研究通過Y2H、GST Pull-down、Co-IP以及BiFC試驗證明OsGRP1與ZFP36真實互作,再通過ABA、H2O2、NaCl、PEG試驗得知OsGRP1基因的表達受其誘導上調(diào),經(jīng)過DMTU、DPI處理后分析得知ABA是通過內(nèi)源H2O2調(diào)節(jié)OsGRP1基因的表達。以上結(jié)果說明,OsGRP1基因響應(yīng)ABA調(diào)節(jié)過程需要H2O2參與。經(jīng)過RT-qPCR分析可知,水稻中超表達OsGRP1基因,導致氧化脅迫酶CAT和SOD活性增加,OsCatB和OsSodCc2基因表達量上升,而在水稻中敲除OsGRP1基因則會導致表達量下降,且在敲除材料中用ABA處理也不能明顯恢復其表達量,證明OsGRP1參與ABA調(diào)控的抗氧化防護過程。對OsGRP1轉(zhuǎn)基因水稻進行耐逆性分析,證明超表達OsGRP1基因增強了水稻對干旱脅迫和氧化脅迫耐受性。

綜上所述,本研究通過酵母雙雜交試驗篩選出OsGRP1是ZFP36的互作蛋白,驗證OsGRP1參與ABA誘導的抗氧化防護途徑并驗證超表達OsGRP1基因能提高水稻在耐旱和抗氧化脅迫中的耐性,對探索水稻OsGRP1基因參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導機制的調(diào)控作用具有重要意義。