基于磁性納米探針的莠去津殘留熒光檢測方法

劉金彤,蒲虹辰,葉林瑤,莫艷陽,楊紅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院/江蘇省農(nóng)藥學(xué)重點實驗室,江蘇 南京 210095)

農(nóng)藥對于防控病蟲和雜草并提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力必不可少[1]。莠去津?qū)賰?nèi)吸型選擇性除草劑,由于其高效除草性能而在世界范圍內(nèi)被大量使用。然而伴隨著莠去津的廣泛施用,其在水資源、土壤以及農(nóng)作物中蓄積與殘留,為環(huán)境安全以及人體健康帶來了潛在的威脅[2-3]。因此,有效檢測并定量環(huán)境中殘留的莠去津?qū)Νh(huán)境及污染評估至關(guān)重要。近年來,相繼發(fā)展并廣泛應(yīng)用的如高效液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜法等一系列農(nóng)藥殘留分析方法,均具有較好的靈敏度和重現(xiàn)性,但大多耗時且樣品制備過程較為復(fù)雜[4-6]。因此,發(fā)展新型快捷、靈敏、選擇性好的農(nóng)藥殘留分析方法尤為必要。隨著納米技術(shù)發(fā)展,熒光納米傳感探針因其分析快速、靈敏度高、選擇性高等特點,作為農(nóng)藥檢測的新手段進(jìn)入了研究者的視野[7-8]。相比于非特異性探針及蛋白功能化探針,適配體熒光納米探針利用適配體特異性識別的鎖鑰機(jī)制,顯示出對靶標(biāo)識別的專一性,為識別復(fù)雜環(huán)境中的特定目標(biāo)物提供了可能[9-10]。

本研究構(gòu)建了適配體功能化的磁性納米熒光探針,并將其應(yīng)用于莠去津的殘留分析檢測。莠去津適配體及熒光素標(biāo)記的編碼DNA可形成非完全互補(bǔ)DNA雙鏈,將該復(fù)合物修飾于磁性納米粒子后,由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移[11-12],熒光素的熒光被淬滅。當(dāng)特異性識別莠去津時,DNA雙鏈解旋,淬滅的熒光被重新“點亮”,基于此建立定量檢測莠去津殘留方法,利用適配體結(jié)合莠去津,借助磁性特征實現(xiàn)對莠去津的富集,為開發(fā)新型農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)提供試驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器FluoroMax-4 熒光光譜儀(日本堀場公司),UV-3600紫外分光光度計(日本島津公司),高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司),PCR儀(美國伯樂公司),高分辨透射電子顯微鏡(日本電子公司),萬分之一分析天平(梅特勒有限公司),VORTEX-5旋渦混合儀(海門其林貝爾有限公司)。

1.1.2 試劑莠去津由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、六水合氯化亞鐵(FeCl2·6H2O)、高錳酸鉀(KMnO4)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自西格瑪奧德里奇公司。油酸(分析純)、氨水(28%)購自南京化學(xué)試劑有限公司。DNA序列購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。DNA序列包括:氨基化適配體(APT):5′-NH2-TGTACCGTCTGAGCGATTCGTACGAACGGCTTTGTACTGTTTGCACTGGCGGAT-TTAGCCAGTCAGTGTTAAGGAGTGC-3′;熒光素FAM標(biāo)記的封閉鏈(FAM-L):5′-TGCAAACAGTACAAAG-CCGTTCGTACGAATCGCTCAGACGG-FAM-3′。

1.2 試驗方法

1.2.1 合成磁性Fe3O4納米粒子將16.2 g FeCl3·6H2O溶解在285 mL去離子水中,攪拌并加熱至70 ℃。另將8.8 g FeCl2·4H2O溶解于20 mL去離子水中形成溶液,加入FeCl3溶液中,同時快速加入36 mL氨水(28%)。反應(yīng)1 min后,逐滴加入9.32 g油酸,并繼續(xù)在70 ℃反應(yīng)1 h。

1.2.2 合成羧基化磁性Fe3O4納米粒子利用永磁體施加外磁場,收集黑棕色Fe3O4磁性納米粒子,乙醇洗滌2次以去除余量油酸,再用超純水洗滌直至pH值接近7。加入320 mL 10 mg·mL-1KMnO4溶液,在超聲清洗儀中超聲8 h。經(jīng)永磁體進(jìn)一步磁性分離后,用去離子水洗滌3次,通過表面羧基改性得到表面帶有羧基修飾的磁性納米粒子。

1.2.3 構(gòu)建磁性納米熒光探針如圖1-A所示,將APT(100 μmol·L-1)和FAM-L(100 μmol·L-1)等量混合放入PCR儀中95 ℃退火5 min,隨后以5 ℃·min-1的速度冷卻至室溫,從而獲得DNA雙鏈APT-L。將10 mg EDC和20 mg NHS加入9 mL羧基化磁性納米粒子(1 mg·mL-1)中,并在室溫下振蕩40 min。隨后將1 mL雙鏈APT-L(50 μmol·L-1)加入該混合物中并在室溫下孵育3 h。將產(chǎn)物離心洗滌2次,并重新分散于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中作磁性納米探針。

圖1 磁性納米探針的制備(A)及其應(yīng)用于莠去津的熒光傳感分析(B)示意圖Fig.1 Schematic illustration of construction of magnetic nanoprobe(A)and its application in the fluorescent sensing of atrazine(B)

1.2.4 莠去津傳感分析傳感原理如圖1-B所示。分別將不同質(zhì)量濃度(0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1)的莠去津與磁性納米探針(20 μL)于PBS(20 mmol·L-1,pH7.4)中混合,并將混合液于37 ℃避光反應(yīng)30 min。測定激發(fā)波長492 nm下樣品的熒光發(fā)射光譜及其520 nm峰值處的熒光強(qiáng)度,繪制莠去津檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.5 選擇性及離子干擾性驗證為了驗證所合成探針對莠去津的特異性,分別將含有特丁津、西瑪津、撲滅津、撲草凈、莠滅凈(均為1 μg·mL-1)等農(nóng)藥與探針孵育,并測定其熒光強(qiáng)度;為了驗證莠去津檢測探針對各種陽離子的抗干擾性,將含Na+、Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+(均為1 μg·mL-1)的莠去津溶液(1 μg·mL-1)與納米探針均勻混合,測定其熒光強(qiáng)度。

1.2.6 加標(biāo)回收率測定取南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地未使用莠去津的稻田水及黃棕壤稻田土作為試樣,并添加莠去津標(biāo)準(zhǔn)溶液使水樣的添加水平分別為0.01、0.5和5 mg·L-1,土樣的添加水平為0.01、0.5和5 mg·kg-1。稻田水先后用濾紙和0.45 μm濾膜過濾,將過濾后的稻田添加水樣與探針共孵育,采用1.2.3節(jié)建立的熒光分析方法檢測。稻田土壤樣品晾干后,去除石子、植物組織等雜質(zhì),過孔徑150 μm篩網(wǎng)后稱取上述土樣 2 g,加入15 mL乙腈與水(體積比為2∶1),超聲提取后,再以4 000 r·min-1離心8 min,收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干。用水將燒瓶中殘留物超聲溶解,定容至1 mL,取樣進(jìn)行熒光檢測,每個添加水平重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米探針表征

由透射電子顯微鏡(TEM)圖可見:所合成的羧基化磁性Fe3O4納米粒子形狀較均一,粒徑7～10 nm(圖2-A),粒徑小表明其具有較大的比表面積,有利于后續(xù)適配體的連接。同時,在羧基化磁性Fe3O4納米粒子的紫外吸收圖譜中可見一主吸收峰位于440 nm附近(圖2-B)[13]。相比于Fe3O4納米粒子,羧基化磁性Fe3O4納米粒子由于表面具有更多的負(fù)電性的-COOH,其Zeta電位由原來的33.7 mV降至-11.0 mV(圖2-C),進(jìn)一步證明了羧基化磁性Fe3O4納米粒子合成成功。此外,羧基化磁性Fe3O4納米粒子具有較寬的紫外吸收峰,可淬滅修飾其上DNA鏈的熒光,為探針的設(shè)計提供可能。相比于羧基化磁性Fe3O4納米粒子,利用雙鏈APT-L功能化后,獲得的磁性納米探針在UV-vis光譜中具有新的260 nm DNA的特征峰,證明該探針合成成功。根據(jù)已知濃度APT-L溶液的熒光校準(zhǔn)曲線(圖2-D),將合成過程中含有游離APT-L上清液的熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的APT-L濃度,用初始APT-L濃度減去剩余濃度獲得磁性納米探針APT-L的負(fù)載率為31.7%。如圖2-B中插圖所示,合成的Fe3O4納米粒子溶液呈現(xiàn)均勻的黑褐色(左),而在右側(cè)施加磁場后,該納米粒子由于磁性作用引導(dǎo)被吸附貼于內(nèi)壁(右),證明羧基化磁性Fe3O4納米粒子具有在磁性作用下可分離的特性。

圖2 羧基化磁性Fe3O4納米粒子及磁性探針的表征Fig.2 Characterization of COOH-Fe3O4 nanoparticles and magnetic probeA. 羧基化磁性Fe3O4納米粒子TEM圖(插圖:放大TEM圖);B. 羧基化磁性Fe3O4納米粒子及磁性探針的紫外-可見光譜圖[插圖:在無(左)、有(右)磁場作用下羧基化磁性Fe3O4納米粒子溶液圖片];C. Fe3O4納米粒子與羧基化磁性Fe3O4納米粒子的Zeta電位圖;D. 不同濃度APT-L的熒光強(qiáng)度。A. TEM image of magnetic COOH-Fe3O4 nanoparticles(Inset:Enlarged TEM image);B. UV-visible spectrum of COOH-Fe3O4[Inset:Photograph of COOH-Fe3O4 magnetic nanoparticles suspended in water(left)and separated by an external magnet(right)];C. Zeta potentials of Fe3O4 nanoparticles and COOH-Fe3O4 nanoparticles;D. Fluorescence intensity vs. different concentrations of APT-L.

2.2 凝膠電泳試驗

為了驗證所合成的磁性熒光探針構(gòu)建是否成功及其對莠去津的特異性響應(yīng),采用凝膠電泳分析,結(jié)果(圖3)顯示:相比于FAM-L(條帶b)及APT(條帶c)2條DNA單鏈,通過堿基互補(bǔ)配對而成的DNA雙鏈APT-L,呈現(xiàn)出1條單一的條帶(條帶a);同時,由于其堿基分子更多,在凝膠電泳上受電場作用遷移距離更短,證明該APT-L雙鏈DNA成功合成。

圖3 APT-L(a)、FAM-L(b)、APT(c)、探針(d)及探針+莠去津(e)的凝膠電泳分析圖Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis analysis image of APT-L(a),FAM-L(b),APT(c),magnetic probe(d)and magnetic probe+atrazine(e)

將APT-L雙鏈通過共價鍵結(jié)合到羧基化磁性Fe3O4納米粒子得到納米探針后,探針由于納米粒子的阻滯作用而停留于點樣孔中,相應(yīng)的APT-L雙鏈條帶消失(圖3,條帶d)。將探針與莠去津孵育后點樣,則出現(xiàn)與FAM-L鏈(條帶b)遷移距離類似的條帶(條帶e)。這可能是由于磁性探針內(nèi)的莠去津適配體與莠去津之間具有強(qiáng)親和力,二者特異性結(jié)合后可釋放熒光標(biāo)記的FAM-L鏈脫離探針,從而用于莠去津的識別與檢測。

2.3 探針檢測莠去津

將探針應(yīng)用于莠去津傳感分析試驗中,在優(yōu)化pH(pH7.4)條件下,磁性探針熒光對莠去津的響應(yīng)在30 min孵育時間達(dá)到最佳(圖4)。由磁性熒光探針的熒光光譜(圖5-A)可見:在492 nm激發(fā)光下,探針的發(fā)射光譜峰值位于520 nm處,且其熒光強(qiáng)度較低,這是由于磁性熒光探針內(nèi)載體對FAM-L鏈熒光具有較強(qiáng)的淬滅作用,為莠去津檢測方法的建立提供了較低背景。將探針分別與0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的莠去津共孵育后,探針熒光峰位置未發(fā)生明顯偏移,其熒光強(qiáng)度隨莠去津質(zhì)量濃度增加而逐漸增強(qiáng),并在0.01～20 μg·mL-1與質(zhì)量濃度(β)的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系(圖5-B)。線性回歸方程:F=1 559 149 lgβ+3 611 861,R2=0. 998,傳感器的最低檢測限為8.17 μg·L-1。以上結(jié)果均表明開發(fā)的熒光探針可對莠去津殘留實現(xiàn)傳感分析,并具有較高靈敏度。

圖4 不同孵育時間(A)和pH(B)條件下磁性探針對莠去津(1 μg·mL-1)響應(yīng)的熒光強(qiáng)度Fig.4 Fluorescence intensity of magnetic probe in response to atrazine(1 μg·mL-1) at the incubation time(A)and pH(B)

圖5 磁性探針測定莠去津Fig.5 Determination of atrazine by magnetic probeA. 磁性探針對0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1莠去津的熒光響應(yīng)譜圖(從下到上);B. 磁性探針熒光強(qiáng)度與莠去津濃度對數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。A. Fluorescence response of magnetic probe to atrazine at the concentrations of 0,0.01,0.1,0.2,0.5,1,2,5,10 and 20 μg·mL-1(from bottom to top);B. The calibration curve of fluorescence intensity of magnetic probe vs. logarithmic value of atrazine concentration.

將本文構(gòu)建的傳感器和文獻(xiàn)報道[14-19]的莠去津檢測方法進(jìn)行比較,結(jié)果(表1)顯示:本試驗制備的傳感器的檢測限比大多數(shù)已報道的傳統(tǒng)方法低,而且具有較寬的線性范圍,以上結(jié)果證明了DNA修飾熒光納米探針的高負(fù)載效率及熒光方法的靈敏性。

表1 莠去津不同檢測方法的比較Table 1 Comparison of various detection methods for atrazine

2.4 探針檢測莠去津的選擇性及抗離子干擾性驗證

為驗證檢測體系測定實際樣品中莠去津殘留濃度的可行性與特異性,研究了此體系對一些常見農(nóng)藥的響應(yīng)情況。由圖6-A可見:相比于莠去津引發(fā)的強(qiáng)信號,探針對含有特丁津、西瑪津、撲滅津、撲草凈、莠滅凈等農(nóng)藥幾乎沒有響應(yīng),說明修飾于探針的適配體對莠去津具有良好的特異性。為驗證方法的抗離子干擾性,在檢測莠去津體系中分別加入各種陽離子,并測定體系熒光強(qiáng)度。由圖6-B可知:相比于僅加入莠去津(1 μg·mL-1)的對照組,共存離子Na+、Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+和Ca2+(均為1 μg·mL-1)對探針檢測莠去津的干擾幅度均不超過對照組的4%?？梢?納米探針的熒光強(qiáng)度不受該濃度下陽離子的影響,具有一定抗離子干擾能力。

圖6 常用農(nóng)藥(A)或共存離子(B)對磁性探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of common pesticides(A)or coexisting ions(B)on the fluorescence intensity of magnetic probe in the presence

2.5 實際樣品測定

為考察本方法的可行性,我們通過標(biāo)準(zhǔn)加入回收試驗進(jìn)行稻田水及稻田土實際樣品中莠去津含量的測定。如表2所示:稻田水中添加0.01、0.5和5 mg·L-1莠去津時,其平均添加回收率為95.48%～102.03%,RSD為2.17%～3.14%;當(dāng)?shù)咎锿林休ソ虻奶砑铀綖?.01、0.5和5 mg·kg-1時,其平均添加回收率為94.79%～100.66%,RSD為3.40%～4.72%。上述結(jié)果表明本檢測方法均滿足農(nóng)藥殘留定量分析要求,檢測限低于國家食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(0.02 mg·kg-1)[20]。表明,基于磁性探針的莠去津殘留檢測方法具有較好的重現(xiàn)性及應(yīng)用于實際樣品檢測的潛力。

表2 莠去津在不同樣品中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 2 Recoveries and the relative standard deviations(RSD)of atrazine in real samples including paddy water and soil(n=3)

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了基于磁性納米材料的熒光探針,通過適配體修飾及DNA設(shè)計,將所開發(fā)探針應(yīng)用于莠去津殘留量的熒光傳感分析。結(jié)果表明:所建立的莠去津殘留熒光定量方法簡單、高效,具有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性,符合農(nóng)藥殘留分析要求,并可應(yīng)用于稻田水及稻田土中莠去津的定量檢測。