辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子鑒定及轉(zhuǎn)錄組分析

劉思珍,歐陽(yáng)超,滿益龍,盛家偉,陳岳,張?chǎng)?鄭立敏,李智強(qiáng),李大偉,張德詠,劉勇,王運(yùn)生,譚新球*

(1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院,湖南 長(zhǎng)沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410125;3.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410125;4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193;6.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

辣椒是我國(guó)第二大蔬菜作物,長(zhǎng)期受炭疽病危害[1],其致病菌主要危害辣椒莖、葉和果實(shí),導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量損失嚴(yán)重,品質(zhì)急劇下降,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前辣椒炭疽病的防治采取以種植抗性品種為核心,以化學(xué)農(nóng)藥防治為主的防治措施,但是由于病原菌種群遺傳變異復(fù)雜,導(dǎo)致品種抗性喪失、病原菌抗藥性產(chǎn)生等問(wèn)題,使得辣椒產(chǎn)區(qū)炭疽病頻發(fā),防治困難。因此亟需明確病原菌與辣椒互作機(jī)制,為新型防控技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。

近年來(lái),效應(yīng)因子一直是病原真菌與寄主植物互作的研究熱點(diǎn)。真菌效應(yīng)因子在病原真菌和寄主的互作中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,直接影響病原真菌的侵入、擴(kuò)展和病害發(fā)生[2-4]。常見(jiàn)真菌細(xì)胞外膜蛋白(common in several fungal extracellular membrane proteins,CFEM),約編碼60個(gè)氨基酸,具有特征性的8個(gè)半胱氨酸殘基[5]。CFEM效應(yīng)因子已被證實(shí)與病原菌的致病力[6]、細(xì)胞壁穩(wěn)定性[7-8]和致病過(guò)程密切相關(guān)[5,9-10]。如稻瘟菌(Magnaportheoryzae)中,Pth11、ACI1及MoCDIP2 這3個(gè)CFEM蛋白均在附著胞形成期上調(diào)表達(dá)[5,11-13],其中Pth11作為G蛋白偶聯(lián)受體,含有7個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)CFEM,是附著胞形成的必需蛋白[14-15]。CFEM效應(yīng)因子也調(diào)控白色念珠菌(Candidaalbicans)菌絲生長(zhǎng)及其致病性[16-17]。同時(shí),研究也發(fā)現(xiàn)CFEM的結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度相對(duì)保守,但是不同真菌之間的結(jié)構(gòu)域數(shù)目差異很大[18-19],暗示CFEM效應(yīng)因子生物學(xué)功能的多樣化。

CFEM效應(yīng)因子預(yù)測(cè)與分析可為后期病原菌與寄主互作、致病機(jī)制等研究提供重要信息。目前研究已發(fā)現(xiàn)稻瘟菌約含61個(gè)CFEM 蛋白[20];禾谷膠孢炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)約含32個(gè)CFEM效應(yīng)因子[21];草莓膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)約含22個(gè)CFEM效應(yīng)因子[22],表明不同病原菌中的CFEM效應(yīng)因子存在數(shù)量差異。相關(guān)研究表明,CFEM效應(yīng)因子在病原菌侵染寄主植物過(guò)程中發(fā)揮作用。如禾谷膠孢炭疽菌有22個(gè)CFEM效應(yīng)因子具有信號(hào)肽,均在病原菌的侵染階段表達(dá),其中有3個(gè)CFEM效應(yīng)因子在病原菌活體寄生階段和死體寄生階段均有表達(dá),可能與病原菌致病性關(guān)系更為密切[21];草莓膠孢炭疽菌有8個(gè)CFEM效應(yīng)因子均在侵染階段表達(dá),其中CGGC5-13478.1在整個(gè)侵染階段表達(dá)量上調(diào)大于80倍,可能參與整個(gè)膠孢炭疽菌侵染植物的整個(gè)過(guò)程[22]。

辣椒膠孢炭疽菌是辣椒炭疽病的優(yōu)勢(shì)種群,在我國(guó)主要辣椒產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和危害。目前未見(jiàn)其CFEM 效應(yīng)因子的相關(guān)報(bào)道。因此,該研究基于辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11的基因組測(cè)序結(jié)果,參照NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm nih.gov/)公布的玉米炭疽菌基因組數(shù)據(jù)和注釋信息,采用生物信息學(xué)手段,從全基因組水平上分析鑒定辣椒膠孢炭疽菌的CFEM效應(yīng)因子的組成和結(jié)構(gòu)特征,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)初步分析CFEM效應(yīng)因子的表達(dá)模式差異,同時(shí)根據(jù)表達(dá)模式,選擇其中的5個(gè)CFEM效應(yīng)因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究CFEM效應(yīng)因子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ),對(duì)揭示辣椒膠孢炭疽菌致病機(jī)制具有重要的科學(xué)意義,同時(shí)也可為研發(fā)辣椒炭疽病新的防治靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及供試材料

辣椒膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)野生型菌株CSLL-11經(jīng)單孢分離、病原鑒定后保存?zhèn)溆?PBin-GFP載體為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所真菌實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室)保存;農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室制備;試驗(yàn)所用的辣椒品種為抗性品種‘TC9612’和感病品種‘湘研15號(hào)’;試驗(yàn)所用的模式植物為本氏煙;大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京全式金公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:購(gòu)自索萊寶公司制備的不含抗生素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基,取46 g該培養(yǎng)基于1 L ddH2O溶解,121 ℃高壓滅菌20 min。主要用于辣椒膠孢炭疽菌的培養(yǎng)。

液體PDA培養(yǎng)基:稱取去皮土豆200 g,加入適量的ddH2O在電磁爐上加熱至沸騰,維持20～30 min,用2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾,棄去濾渣;在濾液中加入葡萄糖20 g,玻璃棒攪拌溶解后,ddH2O定容至 1 000 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基:包含液體LB培養(yǎng)基和固體LB培養(yǎng)基,胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,氯化鈉 10 g·L-1,加ddH2O定容至1 L,pH值調(diào)節(jié)至7.0,121 ℃高壓滅菌 20 min;固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂。主要用于大腸桿菌培養(yǎng)及農(nóng)桿菌培養(yǎng)。

1.3 試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Hiscript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)]購(gòu)自諾唯贊公司;RNA提取試劑盒(TransZol UP Plus RNA Kit)、大腸桿菌感受態(tài)試劑盒(pEasy-Blunt Cloning Kit)均購(gòu)自北京全式金公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司;DNA聚合酶及三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、緩沖液(buffer)、T4DNA 連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司;各種抗生素(潮霉素、卡那霉素、氨芐霉素、利福平)購(gòu)自Roche公司,潮霉素、卡那霉素、氨芐霉素均配制成50 mg·mL-1儲(chǔ)藏液,利福平配制成 25 mg·mL-1儲(chǔ)藏液,-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑制備

乙酰丁香酮(AS)母液:用二甲亞砜配成1 mol·L-1溶液,細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后,-20 ℃保存;MgCl2母液:用無(wú)菌水配成1 mol·L-1溶液,細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后,4 ℃保存;2-嗎啉乙磺酸(MES)母液:用無(wú)菌水配成 500 mmol·L-1溶液,用NaOH調(diào)pH值至5.6,細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后,4 ℃保存。使用時(shí),將母液稀釋到工作濃度:MES 20 mmol·L-1,AS 10 μmol·L-1,MgCl210 mmol·L-1,混合后使用。

1.5 生物學(xué)信息分析

參照NCBI(http://www.ncbi.nlm nih.gov/)玉米炭疽菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)用 SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸的N端信號(hào),按要求輸入30個(gè)氨基酸序列的Fasta格式,N端信號(hào)肽分析選擇默認(rèn)設(shè)置。利用在線工具TMHMM2.0 Server(http://www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)果。通過(guò)TargetP 1.1 Server(http//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 總RNA提取與純化

取生長(zhǎng)健康、大小一致的不同品種(抗性品種‘TC9612’和感病品種‘湘研15號(hào)’)辣椒紅果進(jìn)行人工接種。試驗(yàn)設(shè)置處理組和對(duì)照組,每組接種15個(gè)辣椒果實(shí),設(shè)4次重復(fù)。處理組:制備C.gloeosporioidesCSLL-11的分生孢子懸浮液5×105mL-1,采用針刺人工接種方法分別接種到感病品種‘湘研15號(hào)’和抗性品種‘TC9612’的果實(shí)上部、中部和下部。對(duì)照組采用無(wú)菌水接種。根據(jù)辣椒膠孢炭疽菌附著胞形成階段(appressoria phase)、活體營(yíng)養(yǎng)階段(biotrophic phase)和死體營(yíng)養(yǎng)階段(necrotrophic phase)3個(gè)階段特征,于接種后12、36和96 h分別取對(duì)照組及處理組辣椒果實(shí)的接種區(qū)域,按照TransZol UP Plus RNA Kit使用說(shuō)明分別提取總RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度,檢測(cè)合格的樣品送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.7 辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11部分 CFEM 效應(yīng)因子的亞細(xì)胞定位驗(yàn)證

1.7.1 辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11 mRNA提取和目標(biāo)CFEM效應(yīng)因子cDNA制備取固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11菌落,切成小塊于液體PDA培養(yǎng)基,200 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h;用濾膜過(guò)濾,收獲菌絲,用無(wú)菌水將菌絲沖洗2～3次,以去除培養(yǎng)基殘?jiān)?用無(wú)菌濾紙移除菌絲表面多余水分,將菌絲放入液氮預(yù)冷的研缽中,研棒充分研磨后取適量置于2 mL離心管中,按照TransZol UP Plus RNA Kit使用說(shuō)明提取純化mRNA,分管貯存至-80 ℃?zhèn)溆?。cDNA的制備:采用Hiscript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper),按照說(shuō)明書(shū)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,分管貯存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 目標(biāo)CFEM效應(yīng)因子的克隆與分析以1.7.1節(jié)制備的cDNA為模板,克隆5個(gè)CFEM效應(yīng)因子,對(duì)應(yīng)的引物如表1。PCR體系采用TaKaRa TaqTM體系,擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序均參照說(shuō)明書(shū)。PCR產(chǎn)物用TaKaRa純化回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0)回收。連接、轉(zhuǎn)化按pEasy-Blunt Cloning Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。菌落PCR篩選鑒定陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子,并送至上海生物工程股份有限公司武漢分公司測(cè)序。利用DNAMAN 7.0對(duì)測(cè)序結(jié)果與基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析,提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.7.3 CFEM效應(yīng)因子亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建根據(jù)表1中相應(yīng)CFEM效應(yīng)因子克隆引物,以1.7.2節(jié)相應(yīng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)子的質(zhì)粒為模板(1∶50稀釋),PCR擴(kuò)增出相應(yīng)CFEM效應(yīng)因子DNA片段,采用DpnⅠ消化移除多余的質(zhì)粒模板,利用TaKaRa純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。5個(gè)CFEM效應(yīng)因子和PBin-GFP按照表1相對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行酶切,酶切體系參照NEB公司的說(shuō)明書(shū)。酶切完成后純化回收獲得CFEM效應(yīng)因子的克隆目標(biāo)片段和目標(biāo)載體。將目標(biāo)片段和目標(biāo)載體使用TaKaRa T4連接酶進(jìn)行連接,具體操作參照Li等[23]的連接方法,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化步驟按照pEasy-Blunt Cloning Kit操作說(shuō)明進(jìn)行。菌落PCR篩選鑒定陽(yáng)性克隆子,獲得重組載體PBin-GFP-CghnCFEM13471、PBin-GFP-CghnCFEM13279、PBin-GFP-CghnCFEM02929、PBin-GFP-CghnCFEM09727和PBin-GFP-CghnCFEM14146。菌落PCR篩選鑒定陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 5個(gè)CFEM效應(yīng)因子引物序列Table 1 Primers used to clone five CFEM effectors in Colletotrichum gloeosporioides

1.7.4 農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化將1.7.3節(jié)構(gòu)建完成的PBin-GFP-CghnCFEM效應(yīng)因子質(zhì)粒通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101,具體步驟參照張?jiān)品宓萚24]農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。電擊完成后,28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)1 h,取100 μL菌懸液涂布在含有25 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的抗性LB培養(yǎng)基上,28 ℃黑暗培養(yǎng)48 h。挑取農(nóng)桿菌菌落,經(jīng)特異性PCR引物驗(yàn)證后,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基(含25 mg·L-1利福平+50 mg·L-1卡那霉素),28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h,保存菌液。

1.7.5 重組載體在本氏煙上的瞬時(shí)表達(dá)與分析將1.7.4節(jié)獲得的陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子擴(kuò)繁后,當(dāng)D600=1.0時(shí),5 000 r·min-1離心棄去LB培養(yǎng)基,懸浮菌體,調(diào)節(jié)菌體懸浮液濃度到D600值為0.5左右,菌體懸浮液室溫靜置3 h;選取3～4周齡煙草葉片,采用10 mL的注射器,去除針頭,具體參照黎茵等[25]的農(nóng)桿菌注射滲透法,將懸浮液壓入煙草葉片細(xì)胞,并做好標(biāo)記,經(jīng)注射的煙草植株在25 ℃、光/暗時(shí)間為14 h/10 h 的光周期下培養(yǎng)2 d。取樣制作玻片,激光共聚焦顯微鏡(尼康c2 plus)下觀察CFEM效應(yīng)因子亞細(xì)胞定位情況。以空載體PBin-GFP、核定位載體PBin-GFP:CoNIS1[26]、清水處理作為對(duì)照。觀察時(shí),拍照記錄定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)蛋白信號(hào)肽分析

信號(hào)肽是真菌分泌蛋白的基本特征。本研究利用SignalP 4.1 Server在線分析辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11的基因組,結(jié)果表明:辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11含有30個(gè)CFEM效應(yīng)因子,其中26個(gè)CFEM效應(yīng)因子 N端氨基酸序列具有典型的信號(hào)肽,均位于N端16～30個(gè)氨基酸(表2)。

2.2 辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用TMHMM2.0 Server軟件分析,發(fā)現(xiàn)30個(gè)CFEM效應(yīng)因子中13個(gè)不含跨膜結(jié)構(gòu)域,17個(gè)含有數(shù)目不等的跨膜結(jié)構(gòu)域,其中 CFEM效應(yīng)因子Cghn00284的跨膜結(jié)構(gòu)域最多,為19個(gè);CFEM效應(yīng)因子Cghn13741和Cghn05690的跨膜結(jié)構(gòu)域最少,為6個(gè)(表2)。

2.3 辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

利用TargetP 1.1 Server對(duì)26個(gè)具有信號(hào)肽的CFEM效應(yīng)因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析,結(jié)果表明:26個(gè)CFEM效應(yīng)因子均通過(guò)分泌途徑分泌至胞外。定位可信度分析顯示:除Cghn03726、Cghn07893、Cghn09289、Cghn10687和Cghn10927 這5個(gè)效應(yīng)因子定位可信度略低外(Pr<0.6),其余15個(gè)CFEM效應(yīng)因子的定位預(yù)測(cè)可信度皆較高(Pr>0.6)。26個(gè)CFEM效應(yīng)因子均具有信號(hào)肽,且所有分泌蛋白SP的得分值≥0.755,可能通過(guò)分泌途徑分泌至胞外(表2)。

表2 辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)分析Table 2 Analysis of CFEM effect factor structure in C.gloeosporioides from pepper plants

2.4 辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄分析

對(duì)辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1所示。CFEM效應(yīng)因子Cghn01651、Cghn07586、Cghn10235、Cghn12664、Cghn13471和Cghn14998在其侵染辣椒果實(shí)各階段的表達(dá)量均很低,推測(cè)這些效應(yīng)因子可能在侵染與致病過(guò)程中作用不明顯。CFEM效應(yīng)因子Cghn02929、Cghn09727、Cghn12645和Cghn14146在侵染辣椒果實(shí)各個(gè)階段表達(dá)均較高,推測(cè)可能參與病菌的整個(gè)致病過(guò)程。CFEM效應(yīng)因子Cghn07893在侵染過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平整體下降,并有先降后升的趨勢(shì),推測(cè)該效應(yīng)因子在病原菌侵染過(guò)程中存在功能分化的可能。CFEM效應(yīng)因子Cghn06262、Cghn09571和Cghn13279在侵染的中后期表達(dá)量均較高,推測(cè)可能與菌絲的侵染擴(kuò)展相關(guān)。

圖1 CFEM效應(yīng)因子轉(zhuǎn)錄組分析

2.5 辣椒膠孢炭疽菌部分CFEM效應(yīng)因子的亞細(xì)胞定位

根據(jù)CFEM效應(yīng)因子在侵染辣椒果實(shí)不同階段中的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,選擇參與整個(gè)致病侵染過(guò)程的4個(gè)表達(dá)量較高的CFEM效應(yīng)因子(Cghn14146、Cghn09727、Cghn13279和Cghn02929)以及在整個(gè)侵染過(guò)程中表達(dá)量較低的Cghn13471在模式植物本氏煙中進(jìn)行亞細(xì)胞定位驗(yàn)證。結(jié)果(圖2)表明:Cghn14146、Cghn09727和Cghn13279均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì);Cghn02929、Cghn13471定位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上。但Cghn13471在細(xì)胞膜上的定位不是連續(xù)的,在胞間連絲也有定位。

圖2 5個(gè)CFEM效應(yīng)因子亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular location of five CFEM effectors from C.gloeosporioidesPBin-GFP:空載體,陰性對(duì)照;CoNIS1:陽(yáng)性對(duì)照。PBin-GFP:Recombinant vector,control;CoNIS1:Positive control.

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究表明,效應(yīng)蛋白在植物病原真菌與寄主植物互作過(guò)程中發(fā)揮重要作用,主要涉及病菌生長(zhǎng)發(fā)育和侵染等生理過(guò)程[27-28]。膠孢炭疽菌導(dǎo)致的辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)上重要的真菌病害?；诶苯纺z孢炭疽菌基因組分析,發(fā)現(xiàn)該菌含有30個(gè)CFEM效應(yīng)因子,效應(yīng)因子數(shù)量介于禾谷膠孢炭疽菌(32個(gè))[21]和草莓膠孢炭疽菌(22個(gè))[22]之間;辣椒膠孢炭疽菌、禾谷膠孢炭疽菌和草莓膠孢炭疽菌三者具有信號(hào)肽、可分泌至胞外的CFEM效應(yīng)因子數(shù)分別為13、22和8個(gè)。利用辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11CFEM效應(yīng)因子作參照,發(fā)現(xiàn)與草莓膠孢炭疽菌、禾谷膠孢炭疽菌和橡膠膠孢炭疽菌(Cg-14)具有同源性的CFEM分別為15、10和23個(gè),僅Cghn05708、Cghn07586、Cghn09727、Cghn10927、Cghn13471、Cghn14998和Cghn12645這7個(gè)CFEM效應(yīng)因子在不同寄主來(lái)源的膠孢炭疽菌間高度保守,表明病原菌與寄主互作過(guò)程CFEM效應(yīng)因子存在進(jìn)化差異。

前期研究證實(shí)稻瘟菌中Pth11基因的敲除削弱了病原菌在植物表面形成附著胞的能力,并顯著降低了稻瘟菌的致病性[29];橡膠膠孢炭疽菌CgCFEM3基因編碼1個(gè)胞外分泌效應(yīng)蛋白,參與調(diào)控膠孢炭疽菌菌絲和分生孢子產(chǎn)量以及致病過(guò)程[30];煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中CFEM蛋白參與細(xì)胞壁穩(wěn)定,但不參與血紅素?cái)z取或生物膜形成[8];白色念珠菌中含 CFEM 結(jié)構(gòu)域的CAS1與致病性相關(guān)[31]。另外,在白色念珠菌中,3個(gè)CFEM細(xì)胞壁蛋白(Rbt5、Pga7和Csa1)與生物膜形成和與血紅素中獲取鐵有關(guān)[31];在近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)中3個(gè)CFEM效應(yīng)因子(CFEM2、CFEM3和CFEM6)都參與了從血紅素獲得鐵的過(guò)程,但敲除這3個(gè)效應(yīng)因子對(duì)近平滑假絲酵母生物膜形成無(wú)影響[31]。表明不同物種的CFEM效應(yīng)因子間存在差異,執(zhí)行著不同的功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn),不同區(qū)域來(lái)源的辣椒膠孢炭疽菌在相同品種辣椒和模式植物本氏煙上表現(xiàn)出明顯致病性差異(病斑大小相差0.5～1.2 cm),病原菌菌絲生長(zhǎng)速率(相差2～2.5倍)、產(chǎn)孢量(相差20～320倍)和分生孢子大小差異明顯(數(shù)據(jù)正在投稿中),而且本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個(gè)效應(yīng)因子在侵染和致病過(guò)程中表達(dá)量存在差異,因此推測(cè)CFEM效應(yīng)因子在種群內(nèi)可能存在功能性分化,這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)合人工接種抗性品種‘TC9612’和感病品種‘湘研15號(hào)’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)CFEM效應(yīng)因子在病原菌侵染寄主過(guò)程中表達(dá)量存在明顯差異。有14個(gè)CFEM效應(yīng)因子特別是Cghn01651、Cghn07586、Cghn10235和Cghn12664在菌絲體的表達(dá)量很低或者檢測(cè)不到,但是分生孢子階段Cghn01651和Cghn12664表達(dá)量明顯高于侵染階段,推測(cè)這些效應(yīng)因子在病菌侵染早期就分泌到胞外,并可能在附著胞形成初期發(fā)揮識(shí)別寄主的作用。另外有8個(gè)效應(yīng)因子特別是Cghn02929、Cghn07893、Cghn09727和Cghn12645從接種到形成壞死過(guò)程中維持較高表達(dá)量,表明這8個(gè)效應(yīng)因子可能在病原菌進(jìn)入寄主植物細(xì)胞內(nèi)時(shí),干擾寄主相應(yīng)受體靶標(biāo)的識(shí)別過(guò)程,從而在寄主免疫防衛(wèi)過(guò)程中發(fā)揮作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和不同表達(dá)的CFEM效應(yīng)因子亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),并不是所有的CFEM效應(yīng)因子只定位在細(xì)胞膜上,在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和胞間連絲均有定位信號(hào),可能與不同效應(yīng)因子的跨膜結(jié)構(gòu)域存在關(guān)聯(lián),反映了不同的CFEM效應(yīng)因子執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。

綜上所述,本研究以辣椒膠孢炭疽菌CSLL-11為例,利用其基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),開(kāi)展辣椒膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)因子功能研究,有助于解析炭疽病病原菌-寄主辣椒互作與識(shí)別機(jī)制,為其抗性育種提供科學(xué)支撐。