一種快速添加或替換蛋白標(biāo)簽的新方法及應(yīng)用

張皓,劉雪瑩,錢銘,高鴻儒,湯超,張華,王鵬,張紹鈴,吳巨友*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省梨工程研究中心,江蘇 南京 210095;2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,上海 201699)

蛋白標(biāo)簽(protein tag)是指利用DNA體外重組技術(shù),與目的蛋白一起融合表達(dá)的蛋白或多肽,主要用于目的蛋白的表達(dá)、純化、檢測(cè)和示蹤等[1]。隨著功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展,越來(lái)越多的蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn),這也極大地豐富了蛋白標(biāo)簽的功能。根據(jù)試驗(yàn)的不同目的可以選擇不同功能的蛋白標(biāo)簽。目前常用的蛋白標(biāo)簽有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)[2]、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)[3]、綠色熒光蛋白(GFP)[4]、用于蛋白純化和檢測(cè)設(shè)計(jì)的八肽(Flag)[5]、六聚組氨酸(6×His)[6]、來(lái)源于人c-myc基因的表位標(biāo)簽(Myc)[7]和流感病毒血凝素表位(HA)[8]等。根據(jù)蛋白標(biāo)簽相對(duì)分子質(zhì)量的大小被分成2大類:大的蛋白質(zhì)分子(或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其衍生物)和小的多肽片段。前者主要有GST、MBP和GFP等,它們?cè)谑褂眠^(guò)程中會(huì)增加目的蛋白的溶解性,但在蛋白結(jié)晶和抗體產(chǎn)生等過(guò)程中必須去除標(biāo)簽;后者主要有Flag、6×His、Myc和HA等,多數(shù)情況下多肽標(biāo)簽相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小,對(duì)融合蛋白結(jié)構(gòu)的影響較小,不需要從融合蛋白中切除,所以多肽標(biāo)簽更為常用[9]。例如多肽標(biāo)簽Flag和Myc分別由8個(gè)氨基酸(DYKDDDDK)和10個(gè)氨基酸(EQKLISEEDL)組成的小分子短肽,所以它們對(duì)目的蛋白的折疊不會(huì)造成明顯的影響[10]。6×His標(biāo)簽是由6個(gè)組氨酸殘基鏈接上所組成的氨基酸序列,該標(biāo)簽是純化重組蛋白的首選標(biāo)簽,因?yàn)榻M氨酸殘基的序列可以在特定的緩沖液條件下結(jié)合到多種類型固定的離子上(比如鎳、鈷和銅),從而獲得易檢測(cè)和純化His標(biāo)簽的重組蛋白[11-13]。因此,小分子多肽標(biāo)簽對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和生理活性的影響很小,所以在表達(dá)及純化效果方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

不同的融合標(biāo)簽系統(tǒng)有其相同點(diǎn),但各自也有其不同的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。融合標(biāo)簽系統(tǒng)受到很多因素制約,例如融合標(biāo)簽系統(tǒng)的純化條件、融合目的蛋白自身的性質(zhì)(如等電點(diǎn)和細(xì)胞定位等)、純化的基質(zhì)及試驗(yàn)材料成本和融合標(biāo)簽的可去除性等[14]。沒(méi)有任何單一標(biāo)簽可以滿足所有試驗(yàn)研究的需要。因此,開(kāi)發(fā)2種甚至多種不同功能蛋白標(biāo)簽的組合使用,現(xiàn)已成為融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。本研究基于同源重組連接酶反應(yīng),利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系得到同時(shí)含有目的基因和所需蛋白標(biāo)簽的重組質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究目的蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘碭山酥梨’的花柱,取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心的江浦實(shí)驗(yàn)基地。載體pCold-TF、p1300-35S-GFP和pROK2-35S-mCherry由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心保存。大腸桿菌T1(DH5α)和BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;農(nóng)桿菌GV3101購(gòu)自南京百思禾生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ和BglⅡ購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;Phanta Max高保真DNA聚合酶、2×Rapid Taq master Mix和同源重組連接酶Exnase Ⅱ 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.2 RNA提取和 cDNA 合成

RNA提取使用成都福際生物技術(shù)有限公司多糖多酚植物RNA 提取試劑盒。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?One-Step RT-PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

從梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載目的基因S7-RNase的CDS參考序列[15],利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目的基因和蛋白標(biāo)簽的引物(表1)。

表1 本研究所用引物及用途Table 1 Primers used in the study and its application

根據(jù)同源重組連接酶的原理,將線性化載體和插入片段(插入片段的5′和3′最末端引入線性化載體兩端一致的序列15～20 bp)按一定比例混合后,在同源重組連接酶的催化下,37 ℃反應(yīng)30 min即可完成連接。因此,多標(biāo)簽重組連接酶法需要在目的基因和蛋白標(biāo)簽的正/反向引物5′端前添加15 bp同源臂和酶切位點(diǎn),用于同源重組連接酶的連接,具體見(jiàn)圖1。此外也可以在蛋白標(biāo)簽前添加一些不常用的酶切位點(diǎn),為后續(xù)試驗(yàn)更換目的基因帶來(lái)便利。設(shè)計(jì)快速添加目的基因的蛋白標(biāo)簽時(shí),分別為目的基因S7-RNase(去除信號(hào)肽)和蛋白標(biāo)簽GFP設(shè)計(jì)2對(duì)引物F1/R1和F2/R2,然后在每個(gè)引物的5′端加入相應(yīng)的15 bp的同源臂和6 bp的酶切位點(diǎn)。例如引物R1與F2之間至少要有15 bp同源臂,引物F1和R2分別與載體pCold-TF被NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切之后兩端要有15 bp同源臂,為了同源重組連接酶的識(shí)別、切割特異的重組位點(diǎn),要連接2個(gè)參與重組的分子(表1、圖2-A)。同樣,設(shè)計(jì)快速替換目的基因的蛋白標(biāo)簽時(shí),分別為目的基因S7-RNase和蛋白標(biāo)簽mCherry設(shè)計(jì)2對(duì)引物F3/R3和F4/R4,然后在每個(gè)引物的5′端加入相應(yīng)的15 bp的同源臂和6 bp的酶切位點(diǎn)(表1、圖2-B)。

圖1 目的基因和蛋白標(biāo)簽的引物設(shè)計(jì)圖Fig.1 Primer design diagram of target gene and protein tag

圖2 快速添加(A)或替換蛋白標(biāo)簽(B)的流程圖Fig.2 Flow chart of the new method of rapid protein tag addition(A)or replacement(B)

1.4 基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

以‘碭山酥梨’的花柱cDNA和p1300-35S-GFP載體質(zhì)粒為模板,分別用引物F1/R1和F2/R2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因S7-RNase片段1和蛋白標(biāo)簽GFP片段2。pCold-TF空載體用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)片段1、2和載體pCold-TF(NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切)進(jìn)行膠回收,再將片段1、2和載體pCold-TF(NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切)在重組酶反應(yīng)體系下37 ℃反應(yīng)30 min,最后將樣品置于冰上終止反應(yīng)。重組酶反應(yīng)體系20 μL:片段1xμL,片段2yμL,雙酶切載體片段zμL,5×重組酶反應(yīng)buffer 4 μL,重組酶 2 μL,用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)至20 μL。其中,x=[0.04×片段1堿基對(duì)數(shù)]/片段1的濃度;y=[0.04×片段2堿基對(duì)數(shù)]/片段2的濃度;z=[0.02×載體片段堿基對(duì)數(shù)]/雙酶切載體的濃度。重組酶反應(yīng)終止后,立即進(jìn)行載體轉(zhuǎn)化。從反應(yīng)體系中取20 μL樣品在冰上與100 μL大腸桿菌T1感受態(tài)混合,冰浴30 min;在42 ℃水浴鍋中熱激45 s,立即置于冰上,3 min后在體系中加入700 μL無(wú)抗LB培養(yǎng)基,在37 ℃搖床中孵育1 h;將樣品涂布于抗性氨芐青霉素(Amp)固體平板,在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。從上述的轉(zhuǎn)化平板中挑取10個(gè)單克隆菌落分別放入裝有200 μL Amp液體LB的2 mL的離心管,在37 ℃搖床中振搖8～10 h。取1 μL菌液為PCR模板,以F5/R5為引物對(duì),進(jìn)行菌液PCR。PCR體系20 μL:模板 1 μL,正、反向引物各1 μL,2×Rapid Taq master Mix 10 μL,用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如有目的條帶,取100 μL菌液送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確即可得到重組菌株,可以提取質(zhì)粒進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

以‘碭山酥梨’的花柱cDNA和pROK2-35S-mCherry載體質(zhì)粒為模板,分別用引物F3/R3和F4/R4經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因S7-RNase片段3和蛋白標(biāo)簽mCherry片段4。p1300-35S-GFP空載體用XbaⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切,其余方法同上。其中菌液PCR的引物為F6/R6,菌落置于含卡那霉素(Kan)的液體LB中搖菌。試驗(yàn)所需引物見(jiàn)表1。

1.5 目的基因S7-RNase的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位

將去除信號(hào)肽的目的基因S7-RNase和蛋白標(biāo)簽GFP構(gòu)建到His標(biāo)簽的載體pCold-TF中,并轉(zhuǎn)化BL21菌株。采用張皓等[16]的方法,將得到的上述重組表達(dá)菌株按1∶50接種到10 mL LB(含100 μg·mL-1Amp)液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,活化重組表達(dá)菌株。將活化的重組表達(dá)菌株按 1∶50 轉(zhuǎn)至15 ml LB培養(yǎng)基(含Amp 100 μg·mL-1)中,37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600為0.5時(shí)再置于15 ℃搖床中靜置40 min,最后加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG,誘導(dǎo)表達(dá)24 h。表達(dá)完成后取10 mL菌液12 000 r·min-1離心5 min,收集菌體沉淀。沉淀中加入200 μL 0.1 mg·mL-1十二烷基磺酸鈉(SDS),混勻后100 ℃水浴10 min,再置于冰上冷卻2 min,于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min;取上清液40 μL,加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液混勻后,取10 μL進(jìn)行12%常規(guī)SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。

將目的基因S7-RNase和蛋白標(biāo)簽mCherry構(gòu)建到去除GFP標(biāo)簽的載體p1300-35S-GFP上,并將p1300-35S-S7-RNase-mCherry的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(GV3101),經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后置于28 ℃、200 r·min-1搖床中培養(yǎng)1～2 d。將農(nóng)桿菌液按體積比為1∶50比例擴(kuò)繁后5 000 r·min-1離心10 min,收集菌液,將菌液懸浮在含有10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和100 μmol·L-1乙酰丁香酮的誘導(dǎo)劑中,置于室溫 50 r·min-1的搖床中孵育4 h。用1 mL去針頭無(wú)菌注射器吸入菌液,緩緩注射到小葉本氏煙的背面葉片中,侵染完成后置于20～25 ℃的環(huán)境下繼續(xù)生長(zhǎng)2 d,使用ZEISS LSM800激光共聚焦顯微鏡拍照。試驗(yàn)重復(fù)3次。亞細(xì)胞定位引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種添加或替換目的基因蛋白標(biāo)簽方法用時(shí)和步驟的比較

由表2可見(jiàn):T4DNA連接酶法添加或替換目的基因的1個(gè)蛋白標(biāo)簽總用時(shí)為4～6 d,而多標(biāo)簽重組連接酶法和融合PCR法總用時(shí)2～3 d。通過(guò)進(jìn)一步比較多標(biāo)簽重組連接酶法和融合PCR法,發(fā)現(xiàn)融合PCR法在基因克隆步驟上除了擴(kuò)增目的基因和蛋白標(biāo)簽外,還需要進(jìn)行預(yù)融合PCR和正式融合PCR擴(kuò)增,因此在基因克隆上融合PCR法用時(shí)是多標(biāo)簽重組連接酶法的3倍,可見(jiàn)多標(biāo)簽重組連接酶法在用時(shí)方面比融合PCR法還是具備一定的優(yōu)勢(shì),同時(shí)這種優(yōu)勢(shì)隨著擴(kuò)增片段(目的基因和蛋白標(biāo)簽)長(zhǎng)度的增加會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。另外,多標(biāo)簽重組連接酶法添加或替換目的基因的1個(gè)蛋白標(biāo)簽只需1步即可,而T4DNA連接酶法則需要2步;融合PCR法雖然也只需1步,但是在基因克隆步驟上需要多個(gè)步驟。因此,多標(biāo)簽重組連接酶法在用時(shí)和步驟上比融合PCR法和T4DNA連接酶法具有更簡(jiǎn)單、快速和高效等特點(diǎn)。

表2 3種添加或替換目的基因蛋白標(biāo)簽方法用時(shí)和步驟的比較Table 2 Time and steps comparison of protein tag addition or replacement of target gene in three methods

2.2 目的基因和蛋白標(biāo)簽片段的克隆及融合載體構(gòu)建

利用F1/R1和F2/R2引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因S7-RNase(去除信號(hào)肽)片段1和蛋白標(biāo)簽GFP片段2。凝膠電泳結(jié)果顯示,片段1位于500～750 bp,片段2位于500～750 bp,與預(yù)期的600和714 bp基本相符(圖3-A)。將片段1、2和雙酶切載體pCold-TF片段在重組酶Exnase Ⅱ的作用下進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化和測(cè)序。菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果可見(jiàn)1 300 bp左右的條帶(圖3-B),測(cè)序結(jié)果顯示目的基因S7-RNase和蛋白標(biāo)簽GFP已經(jīng)連接到載體上。同樣,利用F3/R3和F4/R4兩對(duì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因S7-RNase片段1和蛋白標(biāo)簽mCherry片段2。凝膠電泳結(jié)果顯示,片段3位于500～750 bp,片段4位于500～750 bp,與預(yù)期的678和711 bp基本相符(圖3-C)。將片段3、4和雙酶切載體p1300-35S-GFP片段在重組酶Exnase Ⅱ的作用下進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化和測(cè)序。菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果可見(jiàn)1 400 bp左右的條帶(圖3-D),測(cè)序結(jié)果顯示目的基因S7-RNase和蛋白標(biāo)簽mCherry已經(jīng)連接到載體上。

圖3 基因克隆(A、C)及陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)(B、D)Fig.3 Gene cloning(A,C)and PCR detection of positive clones(B,D)M. DNA Marker;1～2分別為S7-RNase和GFP蛋白標(biāo)簽的基因克隆;3～12為重組質(zhì)粒S7-RNase-GFP-pCold-TF轉(zhuǎn)化大腸桿菌的PCR檢測(cè);13～14分別為S7-RNase和mCherry蛋白標(biāo)簽的基因克隆;15～24為重組質(zhì)粒p1300-35S-S7-RNase-mCherry轉(zhuǎn)化大腸桿菌的PCR檢測(cè)。M. DNA Marker;1-2 indicate gene clones of S7-RNase and GFP protein tag,respectively. 3-12 indicate PCR detection of recombinant plasmid S7-RNase-GFP-pCold-TF was transformed into Escherichia coli. 13-14 indicate gene clones of S7-RNase and mCherry protein tag,respectively. 15-24 indicate PCR detection of recombinant plasmid p1300-35S-S7-RNase-mCherry was transformed into E. coli.

2.3 載體S7-RNase-GFP-pCold-TF重組蛋白的體外表達(dá)

將上述重組質(zhì)粒S7-RNase-GFP-pCold-TF(帶有2個(gè)蛋白標(biāo)簽:GFP和His)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá),發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒S7-RNase-GFP-pCold-TF菌液明顯呈淺綠色(圖4-A)。通過(guò)不同IPTG濃度篩選,最后發(fā)現(xiàn)在15 ℃和IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1時(shí),重組蛋白表達(dá)量最高。S7-RNase(除去信號(hào)肽)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為22×103,帶His標(biāo)簽的重組表達(dá)載體和GFP標(biāo)簽相對(duì)分子質(zhì)量分別約為50×103和 27×103,所以最終表達(dá)的重組蛋白S7-RNase-GFP-His相對(duì)分子質(zhì)量約為100×103,這與SDS-PAGE檢測(cè)的結(jié)果較為一致(圖4-B)。

圖4 S7-RNase-GFP-pCold-TF在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)(A)及重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE圖(B)Fig.4 Expression of S7-RNase-GFP-pCold-TF in prokaryotic system from Escherichia coli(A) and the SDS-PAGE image of recombinant protein after induced expression(B)1～3分別為IPTG誘導(dǎo)后的His、S7-RNase-His和S7-RNase-GFP-His的菌液表達(dá);4～6分別為IPTG誘導(dǎo)后的His、S7-RNase-His和 S7-RNase-GFP-His菌體總蛋白;M. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量。1-3 are the expression from Escherichia coli of His,S7-RNase-His and S7-RNase-GFP-His that are induced by IPTG,respectively. 4-6 are the total protein of His,S7-RNase-His and S7-RNase-GFP-His that are induced by IPTG,respectively. M. The standard of molecular weight of protein.

2.4 目的基因S7-RNase的亞細(xì)胞定位分析

如圖5所示:GFP空載可在整個(gè)煙草葉片的細(xì)胞中表達(dá),而S7-RNase-GFP或S7-RNase-mCherry的綠色或紅色熒光主要在細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間有明顯積累的趨勢(shì);同時(shí)在細(xì)胞核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也發(fā)現(xiàn)了綠色和紅色熒光。表明S7-RNase蛋白可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生并由細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)桨狻?/p>

圖5 S7-RNase-GFP和S7-RNase-mCherry蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localizations of S7-RNase-GFP and S7-RNase-mCherry proteinDAPI:4′,6-二脒基-2-苯基吲哚4′,6-diamidino-2-phenylindole. Bar=20 μm.

3 討論與結(jié)論

隨著蛋白組學(xué)和功能基因組學(xué)的興起,如何獲取大量高純度的蛋白成為一個(gè)亟須解決的難題,這也極大促進(jìn)了融合標(biāo)簽技術(shù)和蛋白純化技術(shù)的快速發(fā)展。最近,Lu等[17]提出“水稻全基因組蛋白標(biāo)簽計(jì)劃(RPTP)”的倡議,該計(jì)劃旨在全基因組范圍內(nèi)讓水稻的每一個(gè)蛋白編碼基因原位標(biāo)記一個(gè)蛋白標(biāo)簽,將極大推動(dòng)水稻和其他物種的蛋白組學(xué)和功能基因組學(xué)的發(fā)展。此外,通過(guò)基因工程技術(shù)將具有一定生物學(xué)意義的功能基因連接到表達(dá)載體中,進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)和純化,有利于進(jìn)一步研究其具體功能、在細(xì)胞內(nèi)的定位以及與其他蛋白互作等[18]。目前,利用融合標(biāo)簽技術(shù)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)、純化、檢測(cè)和示蹤等方法已得到普遍使用,但其仍然存在一些缺點(diǎn),如蛋白標(biāo)簽可能干擾與其融合目的蛋白的折疊,從而影響目的蛋白的可溶性和活性,導(dǎo)致其在細(xì)胞中不能正常表達(dá)和發(fā)揮作用[18-19]。因此,合理使用某種蛋白標(biāo)簽對(duì)目的蛋白的表達(dá)和純化及其重組蛋白的活性同樣也至關(guān)重要。

原核表達(dá)技術(shù)是獲得目的蛋白最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法之一[20-21]。大腸桿菌因其遺傳背景清楚、擴(kuò)繁周期短、技術(shù)操作和培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn),常作為外源蛋白表達(dá)的宿主[21]。而GFP作為融合蛋白的表達(dá)標(biāo)簽,是一種應(yīng)用方便、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單,對(duì)融合的目的蛋白產(chǎn)生較少干擾的報(bào)告蛋白質(zhì)[18]。目前在大腸桿菌中利用GFP標(biāo)簽表達(dá)外源蛋白是一種常見(jiàn)的技術(shù)手段,但T4DNA連接酶法在構(gòu)建添加或替換目的基因的蛋白標(biāo)簽時(shí)存在試驗(yàn)環(huán)節(jié)多、操作繁雜且轉(zhuǎn)化效率和目的蛋白表達(dá)量偏低等問(wèn)題。盡管融合PCR法為不同來(lái)源的任意DNA片段體外連接提供了快速簡(jiǎn)捷的途徑[22],但在基因克隆等步驟上環(huán)節(jié)較多,因此應(yīng)用過(guò)程也存在一些問(wèn)題。本研究基于同源重組連接酶反應(yīng),利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系將一個(gè)蛋白標(biāo)簽與目的基因同時(shí)進(jìn)行連接從而一步獲得試驗(yàn)所需的重組表達(dá)載體,同時(shí)還可以一步添加多個(gè)蛋白標(biāo)簽或替換原有載體上的蛋白標(biāo)簽。該方法具有簡(jiǎn)單、快速和高效等特點(diǎn),為進(jìn)一步研究蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及蛋白之間的互相作用等提供了一定的技術(shù)支持。