水稻白穗突變體wp8的表型鑒定及候選基因定位和功能分析

劉林,朱澤,王致遠(yuǎn),劉世家,田云錄,周時榮,江玲,劉玲瓏,萬建民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京210095)

水稻(Oryzasativa)是重要的糧食作物,也是一種單子葉模式植物。葉綠體是水稻中唯一可以進行光合作用的器官。葉綠體通過葉綠素將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。葉綠體能否正常形成、發(fā)育和發(fā)揮功能,對高產(chǎn)水稻的育種起決定性作用。葉色突變體是研究葉綠素合成、葉綠體發(fā)育和光合作用分子機制的理想遺傳材料[1]。到目前為止,已經(jīng)鑒定出許多與葉綠體生物合成和發(fā)育有關(guān)的基因[2]。

水稻植株呈現(xiàn)的顏色涉及多個途徑調(diào)控,其分子生物學(xué)機制較為復(fù)雜。在水稻中發(fā)現(xiàn)很多葉色突變體,包括purpleleaf6(pl6)[3]、thermo-sensitivechlorophyll-deficient33(tcd33)[4]、zebraleaf15(z15)[5]等。然而,目前關(guān)于幼穗中控制穎殼顏色的研究較少,至今報道的突變體僅有whitepanicle1(wp1)[6]、whitepanicle2(wp2)[7]、whitepanicle(t)[wp(t)][8]、whitestripedleafandwhitepanicle(wslwp)[9]、whiteleafandpanicles1(wlp1)[10]、stripeleafandwhitepanicle(slwp)[11]、stripewhiteleafandwhitepanicle(st-wp)[12]等。其中wp1突變體呈現(xiàn)2種表型,嚴(yán)重時植株白化并死亡,輕微時整個生長時期葉片均呈現(xiàn)白條紋性狀,抽穗期幼穗白化。WP1基因編碼一個纈氨酸-tRNA合成酶,主要在葉綠體中核糖體發(fā)育的調(diào)控途徑起作用[6]。最近報道的wp2是由硫氧還蛋白Z基因(擬南芥AtTRXz的同源基因)突變所引起;幼苗表現(xiàn)出高溫敏感的白化表型。硫氧還蛋白Z通過控制質(zhì)體多細(xì)胞器RNA編輯因子的氧化還原狀態(tài)來調(diào)節(jié)植物葉綠體RNA編輯[7]。這些研究表明水稻葉片和穎殼顏色形成的分子機制很復(fù)雜,尚需挖掘新的基因,為闡明葉片和穎殼顏色形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

本研究從粳稻品種‘寧粳6號’誘變突變體庫篩選到一個白條紋白穗的突變體wp8。考察wp8突變體葉色表型及農(nóng)藝性狀,圖位克隆WP8基因,分析WP8基因在葉綠素合成和葉綠體發(fā)育中的功能,為解析葉片和穎殼顏色形成機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和農(nóng)藝性狀調(diào)查

水稻白穗突變體whitepanicle8(wp8)來自水稻品種‘寧粳6號’甲基磺酸乙酯(EMS)誘變突變體庫。將突變體wp8與秈稻品種‘N22’配置雜交組合,并利用其F2代分離群體進行遺傳分析和基因定位。水稻均種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋基地(119°5′E,31°56′N)和海南省陵水縣南京農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地(110°3′E,18°30′N)。采用常規(guī)的田間種植和栽培管理模式[13]。在野生型和wp8成熟后,調(diào)查株高、分蘗數(shù)、穗長以及劍葉長和寬等。在種子收獲期,調(diào)查枝梗數(shù)、結(jié)實率、每穗粒數(shù)、粒長、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀。利用便攜式光合儀(Li6400XT,美國LI-COR公司)和超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(MINI-PAM,德國WALZ公司)測定最大分蘗期的野生型和突變體wp8的劍葉光合速率和其他光合作用指標(biāo)。每個性狀調(diào)查20株,取平均值。

1.2 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

取野生型和wp8植株4葉期第3片葉與抽穗期劍葉進行葉綠體顯微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察。參考王致遠(yuǎn)等[13]的方法,采用Hitachi H-7650透射電鏡對樣品進行觀察和拍照。

1.3 光合色素含量測定

野生型和wp8植株生長至4葉期后測量葉片葉綠素含量;植株抽穗時取完全伸展但未結(jié)實小穗拍照并測定其葉綠素含量,同時測定劍葉葉綠素含量。參照Lichtenthaler[14]的方法進行樣品處理。取葉片或小穗約0.03 g,剪碎后浸入5 mL 95%乙醇中,避光放置48 h。離心收集上清液,使用分光光度計(Beckman DU800 USA)測定665、649和470 nm處上清液光密度值,重復(fù)3次。光合色素含量計算公式如下:Ca=13.95D665-6.88D640;Cb=24.96D649-7.32D665;Cx=(1 000D470-2.05Ca-114Cb)/245。式中:Ca為葉綠素a含量;Cb為葉綠素b含量;Cx為類胡蘿卜素含量。最后換算單位質(zhì)量的葉綠素含量。

1.4 遺傳分析與基因定位

wp8與‘N22’雜交得到F1,F1種子自交獲得F2代種子,于正季將F2代種子種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋?qū)嶒灮?。在抽穗期調(diào)查wp8/N22分離群體中正常和白條紋葉白穗表型的單株數(shù),對分離比進行卡方測驗,驗證白條紋葉和白穗表型是否由單個隱性核基因控制。

將在F2分離群體中挑選的276個與wp8表型一致的單株用于基因定位。使用CTAB方法提取葉片中基因組DNA[13]。從本實驗室的SSR和InDel引物庫中篩選均勻分布于水稻12條染色體,且多態(tài)性良好的147對引物,用于初定位。選取10個與wp8表型一致的單株進行初步連鎖分析,將目的基因定位于RM279和I6-5之間,根據(jù)Gramene(http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫的‘日本晴’和‘93-11’序列,利用NCBI(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)設(shè)計分子標(biāo)記,將剩余的極端單株用于精細(xì)定位。所用精細(xì)定位引物序列見表1。

表1 WP8基因定位的分子標(biāo)記Table 1 The developed molecular markers for WP8 gene mapping

1.5 活性氧物質(zhì)(ROS)分析

1.6 序列分析和蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載WP8以及同源蛋白的氨基酸序列并搜索其功能結(jié)構(gòu)域;利用RGAP網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)對基因的功能進行預(yù)測。采用Bioedit(v7.0.9.0)軟件進行同源比對。

1.7 Real-time PCR分析

剪取水稻4葉期幼苗第3片葉,使用RNAprep pure Plant Kit(天根生化有限公司)提取葉片總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄和定量RT-PCR均采用TaKaRa公司SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?PremixExTaqTMKit,以及ABI prism 7500定量RT-PCR系統(tǒng)。反應(yīng)體系:模板DNA 5 μL(<100 ng),5 μmol·L-1前、后引物各2.5 μL,SYBRPremixExTaqⅡ 10 μL,總體積20 μL。定量反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,循環(huán)數(shù)為40;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。

UBQ5(Ubiquitin)基因作為內(nèi)參,每個樣品3次重復(fù),采用2-ΔΔCT法[15]進行數(shù)據(jù)分析處理。相關(guān)基因引物參照文獻[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體wp8的表型觀察

從表2可見:相比野生型,wp8的株高降低9.5%,分蘗數(shù)減少18%,穗長下降8.5%,劍葉長下降16%,劍葉寬下降6.6%,結(jié)實率增加5.9%,千粒重減少3.3%,且這些性狀與野生型均差異顯著。相比野生型,wp8在整個生育期均表現(xiàn)出明顯的縱向白條紋表型;隨著植株生長,突變體新生葉白條紋表型變?nèi)?直至成熟期,部分葉片顏色恢復(fù)正常綠色(圖1-A、B、C、D、F)。移栽后2周,wp8的白條紋表型變?nèi)?圖1-C)。抽穗期,wp8穎殼相比于野生型有明顯的白化;隨著籽粒成熟,穎殼逐漸恢復(fù)正常(圖1-E、G)。

圖1 WT和突變體wp8的表型特征Fig.1 Morphological characteristics of the WT and wp8 mutantA. 田間條件下4葉期的野生型(左)和wp8(右)的整體植株表型;B. 田間條件下4葉期的野生型(左)和wp8(右)的單株植株表型,比例尺為5 cm;C.田間移栽后2周的野生型(左)和wp8(右)的植株表型;D. 田間條件下抽穗期野生型(左)和wp8(右)的植株表型,比例尺為10 cm,右上角為野生型(左)和wp8(右)葉片放大圖;E.抽穗期野生型(左)和wp8(右)的穗部,比例尺為2 cm;F. 田間條件下成熟期野生型(左)和wp8(右)的植株表型,比例尺為10 cm,虛線框內(nèi)為野生型(左)和wp8(右)葉片放大圖;G. 成熟期野生型(左)、wp8(右)的穗部,比例尺為2 cm。A. The overall plant phenotype of wild type(left)and wp8(right)at the four-leaf stage under field conditions;B. The single plant phenotype of wild type(left)and wp8(right)at the four-leaf stage under field conditions,bar=5 cm;C. The phenotype of wild type(left)and wp8(right)plants at two weeks after being transplanted in the field;D. The phenotype of wild type(left)and wp8(right)plants at heading stage under field conditions,bar=10 cm,and the top right corner shows enlarged wild type(left)and wp8(right)leaves;E. Spikes of wild type(left)and wp8(right)at heading stage,bar=2 cm;F. The phenotype of wild type(left)and wp8(right)plants after maturation in field conditions,bar=10 cm,and the dashed box shows enlarged wild type(left)and wp8(right)leaves;G. Spike phenotype of wild type(left)and wp8(right)at mature stage,bar=2 cm.

表2 野生型(WT)和wp8農(nóng)藝性狀比較Table 2 Agronomic trait comparison of wild type(WT)and wp8

2.2 突變體wp8光合色素含量和光合作用指標(biāo)測定

分別測量野生型和突變體wp84葉期幼葉、抽穗期劍葉、抽穗后7 d小穗的色素含量。與野生型相比,wp8幼葉和抽穗期劍葉葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均極顯著降低(圖2-A、B),wp8穎殼葉綠素a、類胡蘿卜素含量均極顯著降低(圖2-C)。相較于野生型,wp8幼葉總光合色素含量下降31.8%,wp8抽穗期劍葉總光合色素含量下降32.8%,wp8小穗總光合色素含量下降42.1%。

圖2 WT 與wp8葉片和小穗中色素含量Fig.2 Pigment content in leaves and spikelets of WT and wp8A. 野生型和突變體wp8 4葉期第3片葉的色素含量;B. 野生型和突變體wp8抽穗期劍葉色素含量;C. 野生型和突變體wp8抽穗后7 d的小穗色素含量。A. Pigment content of the third leaf of wild type and wp8 mutant at four-leaf stage;B. Pigment content of flag leaf of wild type and wp8 mutant at heading stage;C. Pigment content of spikelet of wild type and wp8 mutant seven days after heading.

對最大分蘗期野生型和突變體wp8劍葉的光合作用指標(biāo)的測量結(jié)果表明,相比于野生型,wp8劍葉的最大光量子效率顯著降低3.7%,量子產(chǎn)量下降,但與野生型之間沒有明顯差異。wp8劍葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均極顯著下降,比野生型分別下降44.9%、22.2%、17.6%。wp8劍葉胞間CO2濃度相比于野生型升高4.2%(表3)。這些結(jié)果表明,wp8農(nóng)藝性狀的變化可能是由于光合作用改變導(dǎo)致的。

表3 WT和wp8的光合作用指標(biāo)Table 3 Photosynthesis indicators of WT and wp8

2.3 突變體wp8葉綠體顯微結(jié)構(gòu)

突變體wp8葉片在整個生長時期均呈縱向白條紋表型,表明可能與葉綠體發(fā)育受損有關(guān)。利用透射電鏡對幼苗期野生型和突變體wp8葉綠體進行觀察,結(jié)果(圖3)表明野生型植株葉片葉綠體正常發(fā)育,類囊體片層結(jié)構(gòu)完好,基粒緊密堆疊(圖3-A、C);wp8植株葉片大部分葉綠體發(fā)生降解,一些僅存的葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)基本消失,并且伴隨出現(xiàn)大量嗜鋨體和空泡狀結(jié)構(gòu)(圖3-B、D)。對抽穗期野生型和突變體wp8劍葉植株葉綠體形態(tài)進行觀察,結(jié)果顯示野生型植株葉片葉綠體正常發(fā)育(圖3-E、G);wp8植株葉片類囊體片層結(jié)構(gòu)相對疏散,并出現(xiàn)大量的嗜鋨體結(jié)構(gòu)(圖3-F、H)。

圖3 WT和wp8的葉綠體透射電鏡觀察Fig.3 Transmission electron microscopic observation of WT and wp8 mutantA、C. 野生型4葉期植株第3片葉葉綠體;B、D. wp8 4葉期植株白條紋葉片葉綠體;E、G. 野生型抽穗期劍葉葉綠體;F、H. wp8抽穗期劍葉葉綠體。CP:葉綠體;SG:淀粉顆粒;Thy:類囊體片層;OB:嗜鋨體。A,C. The third chloroplast of a wild type of four-leaf stage plant;B,D. The chloroplast of a white striped leaf of a wp8 plant at the four-leaf stage;E,G. The wild type flag leaf chloroplast at the heading stage;F,H. The flag leaf chloroplast of wp8 at heading stage. CP:Chloroplast;SG:Starch granule;Thy:Thylakoid lamellar;OB:Osmiophilic body.

2.4 wp8活性氧(ROS)積累分析

圖4 WT和wp8中活性氧(ROS)比較Fig.4 Comparison of reactive oxygen species(ROS)activities in WT and wp8 mutantA. 聯(lián)苯胺(DAB)檢測過氧化氫(H2O2);B. 硝基藍(lán)四氮唑(NBT)檢測超氧根離子 活性氧清除機制相關(guān)基因RT-qPCR分析;D. 野生型和突變體wp8過氧化氫含量。圖A和B標(biāo)尺為0.1 cm。A. Hydrogen peroxide(H2O2)detected by diaminobezidin(DAB)staining;B. Superoxide by nitro-blue tetrazolium(NBT)staining;C. RT-qPCR analysis of genes related to ROS clearance mechanism;D. The hydrogen peroxide content of wild type and wp8 mutant. Scale bars:0.1 cm in figure A and B.

2.5 突變體wp8的圖位克隆

在F2分離群體中隨機選取10株隱性極端單株進行初定位,將目標(biāo)基因定位于第6條染色體短臂上于標(biāo)記RM279和I6-5之間,2個標(biāo)記之間的距離為4.4 Mb(圖5)。將剩余的極端單株進行精細(xì)定位,最終定位于標(biāo)記B4至B5之間,2個標(biāo)記之間為287 bp,包含35個預(yù)測基因。其中19個編碼假定蛋白、表達(dá)蛋白、轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子,剩余16個基因中含有1個已報道的與水稻條紋葉和白穗有關(guān)的基因(LOC_Os06g14620)[11]?；蚪M測序表明,wp8突變體中該基因編碼區(qū)第1外顯子第314位堿基G突變?yōu)锳,導(dǎo)致編碼蛋白翻譯由精氨酸變?yōu)榻M氨酸。在篩選‘寧粳6號’突變體中發(fā)現(xiàn)了wp8的另一個等位突變體wsl9,其編碼區(qū)第1外顯子第157位堿基G突變?yōu)锳,導(dǎo)致編碼蛋白由天冬氨酸變?yōu)樘於０?。突變體wsl9僅表現(xiàn)為幼苗期和抽穗期白條紋葉片表型,而穗部與野生型沒有明顯的差異。

圖5 wp8突變基因的定位Fig.5 Mapping of wp8 mutant geneA. 基因定位:n. 極端隱性單株數(shù);Chr. 染色體。最終定位于B4和B5之間。A. Gene mapping:n. The number of extreme recessive plants;Chr. Chromosome. It is finally positioned between B4 and B5.B. 候選基因突變位點:wp8在基因第1外顯子上(黑色方框)檢測到1個堿基的突變(紅線表示),同時顯示另一個等位突變體wsl9的突變位點(紅線表示)。B. Mutational sites of candidate gene:a single base mutation(indicated by a red line)in the first exon(black box)of the WP8 gene is shown. In addition,an allelic mutation site from wsl9 mutant is also indicated by a red line.

2.6 WP8編碼核糖核苷二磷酸還原酶小亞基蛋白

通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)預(yù)測,WP8編碼一個核糖核苷二磷酸還原酶小亞基蛋白(RNRS1)。該基因包含1個外顯子,編碼340個氨基酸,相對分子質(zhì)量約38.37×103。核糖核苷二磷酸還原酶在DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)過程中起作用,它以核苷二磷酸為底物,催化其形成脫氧核苷二磷酸[11]。對WP8基因的氨基酸序列進行比對分析,發(fā)現(xiàn)WP8基因只有一個保守結(jié)構(gòu)域(氨基酸25～300)。同源分析表明WP8蛋白與粟(XP_004965173.1)、節(jié)節(jié)麥(XP_020183739.1)、大麥(KAE_8781384.1)、玉米(NP_001130908.2)的同源蛋白具有很高相似性(圖6)。

圖6 WP8同源蛋白的氨基酸序列比Fig.6 Comparison of amino acid sequence of WP8 homologous proteins下劃線代表核糖核苷酸還原酶結(jié)構(gòu)域;等位突變體wp8、wsl9、st1、st-wp、gws和slwp蛋白突變位點以紅色字體和線框標(biāo)出。比較序列分別來自水稻(LOC_Os06g14620)、粟(XP_004965173.1)、節(jié)節(jié)麥(XP_020183739.1)、大麥(KAE_87813884.1)和玉米(NP_001130908.2)。Underlines represent nucleotide reductase domain;Red font and frame indicate mutation sites of allelic mutants wp8,wsl9,st1,st-wp,gws and slwp. The compared sequences are from Oryza sativa(LOC_Os06g14620),Setaria italica(XP_004965173.1),Aegilops tauschii(XP_020183739.1),Hordeum vulgare(KAE_87813884.1)and Zea mays(NP_001130908.2),respectively.

2.7 WP8基因表達(dá)分析

通過RT-PCR對野生型和wp84葉期第3葉和抽穗期劍葉的WP8表達(dá)情況進行分析。結(jié)果(圖7)表明突變體中WP8基因的表達(dá)水平比野生型略高,這可能是由于突變體WP8基因功能部分缺失,為了維持植株的正常發(fā)育,反饋調(diào)節(jié)使WP8表達(dá)升高。此外,檢測WP8基因在野生型的根、莖、葉、穗、葉鞘、莖節(jié)中均表達(dá),在葉片中的表達(dá)水平最高。

圖7 WP8基因在WT和wp8 4葉期第3葉(A)和成熟期劍葉(B)以及在WT不同組織(C)中的表達(dá)分析Fig.7 WP8 gene expression analysis in the third leaf at 4-leaf stage in wild-type and wp8 seedling(A), flag leaf at maturity(B),as well as various tissues in wild-type plant(C)MR:成熟根Mature root;MSM:成熟莖Mature stem;ML:成熟葉Mature leaf;P:穗Panicle;MSH:成熟葉鞘Mature sheath;MN:成熟莖節(jié)Mature node.

2.8 葉綠體發(fā)育和合成相關(guān)基因表達(dá)分析

從圖8-A可見:wp8突變體中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)受不同程度的調(diào)控,表明WP8基因突變導(dǎo)致葉綠素合成途徑發(fā)生紊亂,進而影響葉綠素合成?；趙p8突變體葉綠體發(fā)育異常,對野生型和wp8苗期葉綠體發(fā)育相關(guān)基因進行了表達(dá)分析。從圖8-B可見:大多數(shù)質(zhì)體編碼的細(xì)菌型RNA聚合酶(PEP)轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)水平下調(diào),如psaA1、psbD1、ndh4、RCA、atpA和atpB,核基因編碼的噬菌體型RNA聚合酶(NEP)轉(zhuǎn)錄基因rpoB表達(dá)水平下調(diào),rpoC1表達(dá)水平上調(diào)(圖8-B)。這些結(jié)果表明wp8突變體中葉綠體發(fā)育受損與基因表達(dá)密切關(guān)聯(lián)。

圖8 WT和wp8基因表達(dá)分析Fig.8 Gene expression analysis of WT and wp8 mutantA. HEMA:谷氨酰t-RNA還原酶基因Glutamyl t-RNA reductase gene;HEML:谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶基因Glutamate-1-semialdehyde-2,1-aminomutase gene;HEMB:膽色素原合酶基因Porphobilinogen synthase;HEMC:羥甲基后膽色素原合酶基因Hydroxymethylbilane synthase gene;URO-D:尿卟啉原Ⅲ合酶基因Uroporphyrinogen decarboxylase gene;HEME:尿卟啉原脫羧酶基因Uroporphyrinogen Ⅲ decarboxylase gene;HEMF:糞卟啉原氧化脫羧酶基因Coproporphyrinogen Ⅲ oxidase gene;CHLH:鎂螯合酶H亞基基因Mg-chelatase subunit H gene;CHLI:鎂螯合酶Ⅰ亞基基因Mg-chelatase subunitⅠgene;CHLM:鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶基因Mg-protoporphyrin Ⅸ methyltransferase gene;CRD:鎂原卟啉原Ⅸ單甲酯環(huán)化酶基因Mg-protoporphyrin Ⅸ monomethyl ester(oxidative)cyclase gene;DVR:二乙烯基還原酶基因Divinyl reductase gene;POR:原葉綠素酸氧化還原酶基因Protochlorophyllide oxidoreductase gene;CHLG:葉綠素合酶G亞基基因Mg-chelatase subunit G gene.B. psaA1:光系統(tǒng)Ⅰ亞基A1基因PhotosystemⅠP700 chlorophyll a apoprotein A1 gene;psaA2:光系統(tǒng)Ⅰ亞基A2基因PhotosystemⅠP700 chlorophyll a apoprotein A2 gene;psbD1:光系統(tǒng)Ⅰ亞基D1基因PhotosystemⅠD1 gene;ndh2:NADH脫氫酶亞基2基因Hydroxylamine reductase subunit 2 gene;ndh4:NADH脫氫酶亞基4基因Hydroxylamine reductase subunit 4 gene;RCA:Rubisco活化酶基因Rubisco activase gene;RBCL:核酮糖二磷酸羧化酶大亞基基因Ribulose-bisphosphate carboxylase large subunit gene;atpA:ATP合酶亞基A基因ATP synthase subunit A gene;atpB:ATP合酶亞基B基因ATP synthase subunit B gene;rpoB:RNA聚合酶亞基B基因RNA polymerase subunit B gene;rpoC1:RNA聚合酶亞基C1基因RNA polymerase subunit C1 gene.

3 討論

葉色突變體是進行光合作用、葉綠素合成、葉綠體發(fā)育等基礎(chǔ)研究的理想材料。從已有的白穗突變體來看,其在苗期即顯示出明顯的白條紋葉性狀,抽穗期葉片呈現(xiàn)不同粗細(xì)的條紋,且伴隨植株生長延緩,植株農(nóng)藝性狀變差[6,11-12,18-19]。

在水稻葉片從葉鞘中抽出時,莖總是帶有4個處于不同發(fā)育階段的未成熟葉片。這些未成熟葉片顯示葉片發(fā)育連續(xù)階段,稱為P1(葉原基)、P2(第2片葉)、P3(第2片葉)和P4(第2片葉),這是葉片發(fā)育的早期階段。新抽葉片和展開葉片分別命名為P5和P6,它們是葉片發(fā)育的后期階段。通常,在野生型中,質(zhì)體轉(zhuǎn)錄/翻譯裝置的rpo和rps基因在葉片發(fā)育的P4階段高表達(dá)[20]。psaA1、psbD1、ndh4、RCA、atpA、atpB、rpoB等質(zhì)體發(fā)育基因在突變體wp8中轉(zhuǎn)錄水平下降,類囊體片層結(jié)構(gòu)消失,這說明wp8突變影響了葉綠體分化。在突變體wp8中,葉綠素合成基因紊亂,這可能是wp8葉綠素降低的主要原因。研究表明,一些葉綠體逆行信號因子,如四吡咯分子和氧化還原信號傳導(dǎo),對細(xì)胞核和質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)起協(xié)調(diào)作用[21],這與本研究中氧化還原相關(guān)基因表達(dá)變化一致。

WP8編碼核糖核苷二磷酸還原酶小亞基(RNRS1),可以與RNRL1(核糖核苷酸還原酶大亞基蛋白)互作并形成異源二聚體,其影響質(zhì)體基因組的復(fù)制,進而控制葉綠體的發(fā)育與分化[18]。WP8與已報道的ST-WP、GWS(GREEN-WHITE-STRIPE)、ST1和SLWP為等位基因[11-12,18-19]。wp8、wsl9、st1、st-wp和slwp分別在該蛋白的第105、53、40、103和259位點發(fā)生單氨基酸突變,gws在編碼區(qū)314～317堿基處發(fā)生堿基的突變和缺失,突變后蛋白發(fā)生截斷,只有118個氨基酸殘基(圖6)。st1由粳稻品種‘FL176’自然突變獲得,當(dāng)其生長到四、五葉后,再次生長出的新生葉片表現(xiàn)縱向白綠相間的條紋,抽穗后恢復(fù)為綠色葉片[18];gws由粳稻品種‘日本晴’T-DNA插入突變獲得,從第2葉開始葉片表現(xiàn)一定程度的綠白相間的條紋[19];st-wp由秈稻品種‘9311’經(jīng)60Co-γ輻射誘變突變獲得,從苗期至抽穗期葉片均帶有平行于葉脈的白綠相間條紋,抽穗后穎殼和枝梗均呈現(xiàn)白化表型[12];slwp從2葉期開始在整個生育期均表現(xiàn)出條紋葉表型,抽穗期時幼穗白化,成熟期時突變體穎殼為白色[11];wp8葉片和穗部表型與st-wp相似,wsl9僅葉片表現(xiàn)白條紋癥狀(比wp8更加明顯,數(shù)據(jù)未顯示),穗部表型與野生型相似。這些等位突變體在葉片部位均有條紋表型,除st1農(nóng)藝性狀未報道,其他5個突變體的水稻產(chǎn)量均降低。從遺傳背景看,幼穗白化突變體st-wp和slwp均為秈稻背景;粳稻品種的突變體st1和gws未顯示白穗表型。已有研究表明葉色基因由于秈粳背景不同可能呈現(xiàn)不同的表型[22]。而本研究在粳稻中發(fā)現(xiàn)了該基因的不同位點突變顯示不同的表型(wp8幼穗白化,wsl9未顯示白穗表型)。wp8與wsl9均為‘寧粳6號’背景,排除了遺傳背景對基因突變的影響。本材料可用于探索基因的不同保守結(jié)構(gòu)域?qū)е虏町惐硇偷脑颉?/p>

綜上,wp8在水稻生長的大部分時期都有明顯的葉色突變表型,并且伴隨著矮稈的性狀,其對一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒型、千粒重等農(nóng)藝性狀影響不明顯,因此wp8有望在兩系雜交稻不育系幼苗和抽穗期除雜中發(fā)揮一定作用。

致謝:農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心和南方粳稻研究開發(fā)有限公司對本研究給予支持。