surfactin生物合成及應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳曉宇,趙洪源,陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

surfactin,即表面活性素,是一種通過(guò)非核糖體合成途徑合成的環(huán)狀肽和脂肪酸鏈構(gòu)成的強(qiáng)有力的脂肽類生物表面活性劑。它具有高效的抗細(xì)菌、真菌、病毒、腫瘤、支原體等活性,在生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工、化妝品研發(fā)和制藥等方面應(yīng)用前景廣闊,具有替代化學(xué)合成表面活性劑和防腐劑的潛力,這與現(xiàn)代綠色可持續(xù)發(fā)展的理念相契合。近年來(lái),surfactin相關(guān)的生物合成途徑引起了人們的廣泛關(guān)注,surfactin復(fù)雜的生物合成網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展。另外,為了提高surfactin的發(fā)酵產(chǎn)量,利用物理、化學(xué)、分子改造等手段開(kāi)展了高產(chǎn)菌株的選育及優(yōu)化發(fā)酵工藝條件等研究。但由于大多數(shù)野生型芽胞桿菌surfactin產(chǎn)量較低,成本高,限制了surfactin的大規(guī)模生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用。因此,本文主要針對(duì)surfactin的生物合成調(diào)控、分子改造及其在農(nóng)業(yè)、畜牧、食品等方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 surfactin產(chǎn)生菌株

自Arima等[1]首次發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)能夠產(chǎn)生脂肽surfactin以來(lái),抗菌肽產(chǎn)生菌集中在枯草芽胞桿菌的不同菌株之間的觀點(diǎn)便被普遍認(rèn)可。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),除枯草芽胞桿菌外,能產(chǎn)生抗菌肽的還有其他芽胞桿菌菌株(表1),諸多芽胞桿菌中,有些菌株只產(chǎn)生surfactin[2],而有些菌株能同時(shí)產(chǎn)生surfactin、fengycin和iturins[3]或surfactin、 bacillomycin和plipastatin[4];即使同一菌株產(chǎn)生的surfactin也不是純的單一化合物,其同系物的組成有所不同。表1總結(jié)了surfactin的產(chǎn)生菌株及其所產(chǎn)脂肽。

表1 產(chǎn)生脂肽的菌株Table 1 The strains of producing lipopeptides

2 surfactin合成的基因簇

surfactin屬于環(huán)脂肽類化合物,主要產(chǎn)自枯草芽胞桿菌[10]。surfactin是通過(guò)非核糖體多肽合酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)合成的。編碼surfactin合成的酶基因的開(kāi)放閱讀框包含srfAA(401×103)、srfAB(400×103)、srfAC(143×103)、srfAD(27×103),總長(zhǎng)度達(dá)27 kb。srfAA負(fù)責(zé)Leu、Glu和Val,srfAB負(fù)責(zé)Asp、Val和Leu,srfAC負(fù)責(zé)Leu,srfAD在surfactin引發(fā)肽鏈的環(huán)化反應(yīng)中起重要作用。每個(gè)模塊通常含有如下的結(jié)構(gòu)域:腺苷化結(jié)構(gòu)域(adenylation domain,A domain)、硫醇化結(jié)構(gòu)域(thiolated domain,T/PCP domain)和縮合結(jié)構(gòu)域(condensation domain,C domain)。另外srfAA和srfAB在第3個(gè)模塊含差向異構(gòu)化結(jié)構(gòu)域(epimerization domain,E domain),srfAC含硫酯化結(jié)構(gòu)域(thioesterification domain,TE domain)(圖1)。A domain識(shí)別第1個(gè)氨基或羥酸結(jié)構(gòu)單元,將其激活為氨基?；佘账?并轉(zhuǎn)移至 T/PCP domain結(jié)構(gòu)域,通過(guò)硫酯鍵進(jìn)行連接。后續(xù)的包含C domain結(jié)構(gòu)域的延伸模塊,負(fù)責(zé)將T/PCP domain結(jié)構(gòu)域上的氨基酸/羥基以肽/酯鍵的形式結(jié)合至前一個(gè)T/PCP domain結(jié)構(gòu)域[11]。除A、T和C結(jié)構(gòu)域外,在surfactin合酶中,模塊3和6中的2個(gè)差向異構(gòu)化結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與T結(jié)構(gòu)域結(jié)合的L-Leu外消旋。L-氨基酸和D-氨基酸的組合使肽具有獨(dú)特的構(gòu)象,這種構(gòu)象對(duì)于細(xì)胞靶標(biāo)的特異性相互作用很重要[12]。最后,srfAC末端連接的Ⅱ型硫酯酶基因srfAD,即終止模塊的硫酯酶結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)surfactin的環(huán)化和釋放[13]。為了具備催化酶活性,肽合酶的PCP結(jié)構(gòu)域必須通過(guò)特定的磷酸泛肽亞基轉(zhuǎn)移酶從脫輔基形式轉(zhuǎn)化為全氫形式。此外,surfactin合酶復(fù)合物由誘導(dǎo)型操縱子srfA(25 kb)編碼,在操縱子srfA下游約4 kb處的sfp基因編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTases),這是surfactin生物合成復(fù)合物的PCP結(jié)構(gòu)域從無(wú)活性的載脂蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘耐暾问剿匦璧幕騕12],且sfp行使激活surfactin合成酶的功能。

圖1 surfactin合成基因簇[10]Fig.1 The gene cluster of surfactin synthesis[10]a. 枯草芽胞桿菌的surfactin生物合成基因簇及surfactin合酶的7個(gè)模塊;b. 7個(gè)模塊的作用。A:腺苷化;C:縮合;PCP:肽基載體蛋白;E:游離異構(gòu)域;TE:具有硫酯酶活性的終止結(jié)構(gòu)域。a. The gene cluster of surfactin biosynthesis in B.subtilis and seven modules of surfactin synthase;b. The role of the seven modules. A:Adenylation;C:Condensation;PCP:Peptidyl carrier protein;E:Free isodomain;TE:Termination domain with thioesterase activity.

3 生物合成的調(diào)控系統(tǒng)

基于以往研究報(bào)道的surfactin生產(chǎn)過(guò)程,本文歸納和構(gòu)建了枯草芽胞桿菌中的一種全面性的surfactin生物合成途徑(圖2)。根據(jù)其功能劃分為6個(gè)部分,包括特定的糖酵解和三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)、脂肪酸生物合成、氨基酸生物合成、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成、surfactin的模塊化酶促合成以及surfactin的外排和抗性[14]。

圖2 枯草芽胞桿菌中surfactin的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15-16]Fig.2 The synthetic regulatory network of surfactin in B.subtilis[15-16]

3.1 前體供應(yīng)單元

上游前體供應(yīng)單元分成4個(gè)部分,提供了用于細(xì)胞發(fā)育和surfactin合成的基本前體,包括氨基酸、碳骨架、NADPH和ATP等。

第1部分代表碳或糖源的利用以及糖酵解途徑和TCA循環(huán),為細(xì)胞代謝提供碳骨架和能量。Zhi等[14]報(bào)道了編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、通透酶和6-磷酸蔗糖水解酶的基因分別為sacP、murP和sacA,它們?cè)诟弋a(chǎn)surfactin的解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciensMT45)中高效表達(dá)。糖酵解途徑中許多關(guān)鍵酶的基因受CcpA調(diào)控。此外,CcpA可直接或間接控制與TCA周期相關(guān)的檸檬酸合酶基因(citZ)的表達(dá)[17]。Zheng等[18]指出,CcpA影響戈登氏鏈球菌(Streptococcusgordonii)黏附素基因的表達(dá)、發(fā)育和生物被膜的形成,但尚未建立CcpA與surfactin生產(chǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)[19]。

盡管N末端連接的脂肪酸是surfactin的關(guān)鍵元素,但它們的生物合成途徑卻鮮見(jiàn)報(bào)道。高產(chǎn)surfactin的解淀粉芽胞桿菌中大多數(shù)涉及脂肪酸合成途徑的基因被上調(diào)[15,20]。除了NRPS外,脂肪酸的生物合成尤其是支鏈脂肪酸對(duì)于surfactin的合成至關(guān)重要,它是由構(gòu)建前體乙酰輔酶A引發(fā)的。此外,丙酮酸通過(guò)丙酮酸脫氫酶(phdABCD)的催化轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(圖2)。Hu等[20]研究表明,存在脂肪酸合成的正調(diào)節(jié)因子,包括乙酰輔酶A羧化酶(accABCD)、丙二酰輔酶A(fabD)和β-酮酰基-?；d體蛋白合成酶Ⅰ(FabH)。LDH和PTA分別促進(jìn)丙酮酸的代謝形成乳酸和促進(jìn)乙酰輔酶A的作用以形成乙酰磷酸鹽和乙酸鹽[15]。FabH催化丙二?；?酰基載體蛋白(ACP)與乙?；?CoA縮合形成β-酮基丁酰基-ACP,這是直鏈飽和脂肪酸生物合成的第一步?？莶菅堪麠U菌的FabH可以通過(guò)縮合乙酰CoA、異丁酰CoA、異戊酰CoA或α-甲基丁酰CoA與丙二酰輔酶ACP一同激活直鏈和支鏈脂肪酸的合成。支鏈脂肪酸合成前體異丁?；?CoA、異戊酰基-CoA和α-甲基丁?；?CoA可以分別衍生自支鏈氨基酸L-val、L-leu 和L-isoleu[20]。大腸桿菌硫酯酶(TesA)[15]和脂肪酸β-羥基化細(xì)胞色素P450酶(YbdT)在脂肪酸合成中發(fā)揮積極作用。Kraas等[21]的研究證明,3-羥基長(zhǎng)鏈脂肪酸的后續(xù)活化是通過(guò)激活枯草芽胞桿菌中?；鵆oA連接酶LcfA和LcfB的活力而引起的,最終被CoA激活的長(zhǎng)鏈脂肪酸被認(rèn)為是枯草芽胞桿菌的底物,即surfactin合成的起始(圖2)。該部分代表surfactin合成的第2部分。

氨基酸合成模塊涉及surfactin的固有成分Glu、Asp、Val和Leu的生物合成,這是surfactin合成的第3部分。支鏈氨基酸(L-isoleu、L-val和L-leu)參與surfactin的生物合成過(guò)程分為3個(gè)階段:支鏈氨基酸生物合成、支鏈脂肪酸和CoA活化的3-羥基脂肪酸前體生物合成以及NRPS催化的合成(圖2)。蘇氨酸可由丙酮酸經(jīng)檸檬酸循環(huán),在草酰乙酸的作用下合成天冬酰胺,后經(jīng)一系列作用合成,參與后續(xù)支鏈氨基酸的合成。支鏈氨基酸L-isoleu以蘇氨酸為起點(diǎn),在ilvA(L-蘇氨酸脫水酶)作用下合成2-酮丁酸酯,之后由ilvBN、ilvGM、ilvIH、ilvC、ilvD、ilvE酶系(乙酰羥酸合酶Ⅰ、乙酰羥酸合酶Ⅱ、乙酰羥酸合酶Ⅲ、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶、二羥酸脫水酶、支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶)共同作用實(shí)現(xiàn)生物合成[20,22]。支鏈氨基酸L-val的生物合成由與L-isoleu相同的酶系統(tǒng)調(diào)控。LeuA(2-異丙基蘋(píng)果酸合酶)、LeuB(3-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶)、LeuC(3-異丙基蘋(píng)果酸脫水酶亞基)、LeuD(3-異丙基蘋(píng)果酸脫水酶亞基 Ⅱ)作用于2-酮丁酸酯生成L-leu 的階段,參與支鏈氨基酸的合成[15,20]。3個(gè)支鏈氨基酸進(jìn)一步作用,所得中間體(支鏈α-酮酸)通過(guò)支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的支鏈?；?CoA前體:α-甲基丁?；?CoA、異丁?；?CoA和異戊?；?CoA[23]。隨后,這些支鏈?；?CoA和丙二酰-ACP在FabH的作用下,通過(guò)縮合反應(yīng)得到3-酮-4-甲基己?；?ACP、3-酮-4-甲基戊?；?ACP和3-酮-5-甲基己酰基-ACP[24],并參與隨后的脂肪酸合成。NADPH產(chǎn)生的模塊包含磷酸戊糖途徑的一部分,主要產(chǎn)生用于細(xì)胞代謝的NADPH和戊糖,屬于第4部分,文中對(duì)此不進(jìn)行陳述。

3.2 轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)和調(diào)控單元

surfactin的模塊化酶促合成,稱為中間轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)單元,這屬于surfactin合成的第5部分。surfactin的生物合成和調(diào)控是多基因參與的、與群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)相關(guān)的復(fù)雜過(guò)程。生產(chǎn)surfactin的菌芽胞桿菌的感受態(tài)形成、芽胞形成、細(xì)胞游動(dòng)性以及生物被膜的形成均與其合成相關(guān)[25]。細(xì)胞密度的信號(hào)分子、芽胞桿菌信息素ComX,一定濃度下會(huì)與膜蛋白組氨酸激酶ComP結(jié)合,誘導(dǎo)其自磷酸化,進(jìn)而將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至調(diào)控蛋白ComA,使ComA被磷酸化,磷酸化的ComA結(jié)合在surfactin合酶基因srfA啟動(dòng)子的特定區(qū)域,激活RNA聚合酶引發(fā)srfA的轉(zhuǎn)錄[26]。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激可以刺激全局調(diào)控系統(tǒng)ComP-ComA和Spo0A-AbrB,從而誘導(dǎo)srfA的表達(dá)[27],其中Spo0A蛋白被認(rèn)為是芽胞形成初期一種重要的調(diào)控蛋白,且與細(xì)菌生長(zhǎng)后期感受態(tài)的形成、抗菌物質(zhì)的分泌有關(guān)。鑲嵌在srfAB內(nèi)部的ComS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),決定芽胞桿菌形成感受態(tài)的起始,也參與枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)發(fā)育[27]。

除ComX外,由phr基因編碼的感受態(tài)刺激因子(competent stimulus factor,CSF)也參與surfactin的合成[27]。有研究表明,在枯草芽胞桿菌中,phrC基因表達(dá)產(chǎn)物是最主要的胞外CSF,并列出了其所具有的功能:1)低濃度下,刺激由ComA轉(zhuǎn)錄蛋白激活的基因表達(dá);2)高濃度下,發(fā)揮相反的作用;3)促進(jìn)芽胞的形成。有報(bào)道指出CSF通過(guò)調(diào)節(jié)ComA胞內(nèi)磷酸化水平,與SigA共同作用,促進(jìn)srfA操縱子的轉(zhuǎn)錄[27]。phr基因的上游有對(duì)應(yīng)的負(fù)責(zé)編碼天冬氨酰基磷酸酶的Rap基因[28]。Pottathil等[29]研究指出,胞外的phr前體肽通過(guò)寡肽透性酶Opp跨膜進(jìn)入胞內(nèi),并與Rap蛋白結(jié)合,發(fā)揮磷酸酶抑制作用,而phr前體跨膜輸出胞外的方式目前尚未求證。Auchtung等[30]研究發(fā)現(xiàn),phr肽與Rap蛋白結(jié)合后,ComA保持磷酸化的活躍狀態(tài),從而促進(jìn)srfA基因的轉(zhuǎn)錄。Bongiorni等[31]對(duì)枯草芽胞桿菌胞內(nèi)的Rap蛋白研究發(fā)現(xiàn),phr短肽可以專一性抑制包括RapA、RapC、RapE、RapF、RapG、RapI、RapK在內(nèi)的7種Rap蛋白。最近Hayashi等[32]研究又發(fā)現(xiàn),調(diào)控因子RghR能通過(guò)抑制Rap蛋白活性,來(lái)抑制DegU與DNA結(jié)合,進(jìn)而抑制srfA表達(dá)。

DegU是二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)DegS/DegU的伴侶,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期起著關(guān)鍵作用[14]。磷酸化的DegU可促進(jìn)胞外蛋白酶的合成,抑制sigD的表達(dá);非磷酸化的DegU,能激發(fā)ComK的表達(dá),誘發(fā)感受態(tài)形成。有研究觀察到DegU的突變引起枯草芽胞桿菌中srfA基因的表達(dá)下調(diào),認(rèn)為srfA表達(dá)可以被DegU-P激活,且DegU轉(zhuǎn)錄/表達(dá)的增加與surfactin的高產(chǎn)量相關(guān)[19]。

ComA和SigA直接與srfA啟動(dòng)子結(jié)合以引發(fā)轉(zhuǎn)錄,對(duì)surfactin生產(chǎn)具有促進(jìn)作用[14]。作為枯草芽胞桿菌次生代謝的主要調(diào)控子AbrB通過(guò)直接或間接方式抑制surfactin合酶的表達(dá),進(jìn)而抑制surfactin的合成[27]。先前報(bào)道CodY通過(guò)直接結(jié)合srfA啟動(dòng)子,占據(jù)DNA與調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn),抑制srfA的表達(dá)[33]。全局調(diào)控因子CodY的缺失也可為surfactin的生物合成提供能量和前體[15]。另外,基因Spx通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)α-CTD49中的重疊位點(diǎn)阻斷啟動(dòng)子區(qū)域中ComA和RNAP之間的相互作用來(lái)抑制srfA表達(dá)[14]。srfA的另一個(gè)抑制因子是PerR,它可抑制枯草芽胞桿菌中sfrA的表達(dá)[34],但機(jī)制尚不清楚。SinI可以促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)生,間接抑制srfA的表達(dá),導(dǎo)致surfactin的合成受到抑制[15]。最近報(bào)道,在枯草芽胞桿菌中,srfA在磷酸鹽限制條件下受到PhoP的正調(diào)控[14];但也有研究顯示PhoP與srfA展現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢(shì)[15]。鄧旗[9]研究發(fā)現(xiàn),基因rne5可以同時(shí)調(diào)控srfAA、srfAC、srfAD,該基因是1個(gè)位于核糖核酸酶E的5′UTR中的順式元件,這為surfactin高效表達(dá)提供了新的思路,但該基因的作用方式、作用條件等仍未被解析。

另外通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)或組學(xué)分析獲得的AbrB、Spx、PerR、PhoP、SinI等潛在的srfA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其功能的真實(shí)性有待明晰。這表明目前srfA轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子以及surfactin高效合成的調(diào)控機(jī)制仍不夠清晰[20],尚待進(jìn)一步的完善和發(fā)展。

3.3 外排和抗性單元

第6部分包含surfactin抗性基因的表達(dá)?？咕钚?、自抗性對(duì)于surfactin的高生產(chǎn)率至關(guān)重要[22]。研究表明,SwrC和AcrB可能協(xié)同作用以有效外排胞內(nèi)合成的surfactin[15],且對(duì)菌體自身的保護(hù)和耐藥性很重要[14]。與達(dá)托霉素(surfactin的結(jié)構(gòu)類似物)抗性相關(guān)基因的liaRSFGHI操縱子在解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciensMT45中高效表達(dá),尤其是liaH和liaI;在發(fā)酵后期過(guò)表達(dá)liaRSFGHI操縱子可能有助于菌體對(duì)抗高濃度的surfactin[14]。Hamon等[35]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子Spo0A、sigma-H和AbrB可調(diào)節(jié)枯草芽胞桿菌生物被膜的形成,Spo0A還與芽胞形成和抗菌肽產(chǎn)生有關(guān)。Chen等[36]研究發(fā)現(xiàn),作為重要的胞外信號(hào)因子,surfactin在生物被膜的形成中發(fā)揮作用。細(xì)胞膜上的組氨酸激酶(KinC)能夠感知膜上surfactin攻擊引起的K+滲透,使Spo0A磷酸化,誘導(dǎo)胞外生物被膜基質(zhì)合成進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞生理生化活動(dòng)。在環(huán)境脅迫下,菌體產(chǎn)生的surfactin既能啟動(dòng)生物被膜形成,又能終止surfactin繼續(xù)合成,是生物體確保最大限度存活率的自我保護(hù)機(jī)制。另外,一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,DNA結(jié)合蛋白SinR在細(xì)菌受到外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏信號(hào)刺激時(shí)發(fā)揮作用。SinR對(duì)細(xì)菌生物被膜形成也很重要,且與eps以及yqxM操縱子的表達(dá)關(guān)系密切。另外Hamon等[37]研究發(fā)現(xiàn),Rap-Phr可與調(diào)控蛋白(Spo0A、ComA、DegU)作用,參與芽胞和感受態(tài)的形成,而ComA-P胞內(nèi)濃度受Rap和Phr影響。

4 新型的分子改造

根據(jù)目前已有的報(bào)道,大多數(shù)野生型surfactin生產(chǎn)菌的產(chǎn)量都較低(50～100 mg·L-1)[1],這也是 surfactin 規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用的瓶頸。采用傳統(tǒng)的誘變育種或發(fā)酵優(yōu)化策略,很難在生產(chǎn)上取得重大突破,而建立經(jīng)基因修飾的surfactin生產(chǎn)菌株具有重要意義。目前主要的難點(diǎn)在于編碼surfactin合酶的srfA操縱子的大遺傳序列(超過(guò)25 kb)和群體感應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜生物合成調(diào)控[14]。srfA的異源表達(dá)具有挑戰(zhàn)性,目前提高surfactin產(chǎn)量的菌株修飾主要有以下3種策略:替換或改造srfA模塊的天然啟動(dòng)子Psrf[38]、增強(qiáng)surfactin的分泌外排以及修飾srfA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(表2)。

表2 基因工程改造菌株的surfactin產(chǎn)量Table 2 The surfactin production of strains modified by genetic engineering

續(xù)表2 Table 2 continued

4.1 srfA模塊的天然啟動(dòng)子改造

srfA模塊遺傳序列包含在26.2 kb的簇中,導(dǎo)致srfA異源表達(dá)不是提高效價(jià)的首選方法。而啟動(dòng)子工程被認(rèn)為是提高surfactin生產(chǎn)力的最佳手段,可以滿足規(guī)模化生產(chǎn)的要求[20]。生產(chǎn)surfactin的枯草芽胞桿菌,主要有組成型、誘導(dǎo)型和自誘導(dǎo)型3種啟動(dòng)子[47]。Wu等[15]利用強(qiáng)啟動(dòng)子P43,結(jié)合其他基因改造,顯著提高了surfactin產(chǎn)量。Sun等[38]使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pspac代替天然PsrfA啟動(dòng)子的工程化枯草芽胞桿菌fmbR-1,將surfactin產(chǎn)量提高到3.87 g·L-1。Cheng等[48]研究發(fā)現(xiàn),自誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Ppst和Pcry3Aa)對(duì)處于對(duì)數(shù)晚期和穩(wěn)定期細(xì)胞的靶基因表達(dá)有效。除了使用天然強(qiáng)啟動(dòng)子外,Jiao等[40]整合了枯草芽胞桿菌的PgroE啟動(dòng)子區(qū)域、大腸桿菌lacI-lacO操縱子和枯草芽胞桿菌sigma因子的上游70、35和10區(qū)域的3個(gè)點(diǎn)突變,得到1個(gè)超強(qiáng)啟動(dòng)子Pg3,使surfactin產(chǎn)量達(dá)8.61 g·L-1,是原始菌株的15.6倍。啟動(dòng)子替換也有不利的結(jié)果,仍待進(jìn)一步深入研究。

4.2 增強(qiáng)surfactin的分泌外排

surfactin跨膜外排的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚,但根據(jù)其具有增加生物膜的通透性、去穩(wěn)定性的作用,推測(cè)跨膜運(yùn)輸可能是其分泌方式。Tsuge等[49]研究表明,可能存在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的surfactin外排機(jī)制,且發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌宿主的表面活性和耐藥性可以通過(guò)Yerp的無(wú)效突變而極大降低,其中Yerp編碼1個(gè)與RND(耐藥性,結(jié)瘤和細(xì)胞分裂)家族排泄泵同源的蛋白。Li等[43]用脂質(zhì)體和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑證實(shí)枯草芽胞桿菌THY-7中surfactin的轉(zhuǎn)運(yùn)能量,主要依賴于質(zhì)子動(dòng)力,而不依賴于ATP水解,并確定了依賴于質(zhì)子動(dòng)力的脂肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YcxA,該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的移碼突變導(dǎo)致surfactin無(wú)法在菌體中轉(zhuǎn)運(yùn)。Wu 等[15]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)SwrC、AcrB和Lia蛋白顯著提高了surfactin的產(chǎn)量,并提出SwrC和AcrB協(xié)同促進(jìn)surfactin分泌,且Lia蛋白促進(jìn)細(xì)胞存活,使細(xì)胞在高surfactin濃度下生長(zhǎng)。以上結(jié)果與Zhi等[14]報(bào)道的surfactin高產(chǎn)菌株解淀粉芽胞桿菌MT45中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平相一致。

4.3 修飾srfA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因

srfA操縱子的表達(dá)還受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。依賴細(xì)胞密度的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng),在srfA操縱子的調(diào)節(jié)中起重要作用。ComX和CSF介導(dǎo)枯草芽胞桿菌芽胞形成的群體感應(yīng)[50]。基因簇srfA(srfAB)中包含感受態(tài)調(diào)控基因comS,使srfA基因的轉(zhuǎn)錄受到信息素ComX 和感受態(tài)刺激因子Phr的調(diào)控[51]。Jung等[44]研究指出,信號(hào)因子ComX和PhrC的過(guò)表達(dá)可增加surfactin產(chǎn)量。將全局調(diào)控因子CodY直接結(jié)合到srfA啟動(dòng)子區(qū)域可以抑制srfA轉(zhuǎn)錄,使surfactin產(chǎn)量下降[33]。刪除基因epsA-O和tasA-sipW-yqxM,能夠提高srfA的轉(zhuǎn)錄[52]。此外研究人員也相繼報(bào)道了srfA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的負(fù)調(diào)節(jié)因子PerR、SinI和PhoP[15,32]。曹國(guó)強(qiáng)[53]研究發(fā)現(xiàn),敲除phr基因surfactin產(chǎn)量是原始菌株的2倍,而敲除comA基因產(chǎn)量減少;過(guò)表達(dá)comA基因產(chǎn)量是原始菌株的2倍,過(guò)表達(dá)comK產(chǎn)量沒(méi)有提高。另外,有研究還提供了一種surfactin高產(chǎn)菌株的完整組學(xué)概況,為surfactin生產(chǎn)菌的基因組和轉(zhuǎn)錄組的比較提供便利,并指出srfA操縱子表達(dá)、前體重定向和抗性能力的差異對(duì)surfactin的生產(chǎn)率影響巨大[14],為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)和方向。

4.4 其他改造菌株的手段

Wu等[15]研究表明,剔除eps基因操縱子和tasA-sipW-yqxM操縱子,可使生物被膜相關(guān)基因無(wú)法轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致能量和底物重新分配于surfactin的生產(chǎn)。脂肪酸是surfactin的關(guān)鍵成分之一。支鏈脂肪酸的合成始于FabH催化支鏈α-酮?；鵆oA與丙二酸-ACP的反應(yīng),且芽胞桿菌中的FabH對(duì)支鏈α-酮?；?CoA具有更好的選擇性。研究表明過(guò)表達(dá)與P43啟動(dòng)子融合的FabH可以增強(qiáng)支鏈脂肪酸合成,過(guò)表達(dá)lipALM可以消除BKD與其他硫辛酸依賴性復(fù)合物之間的脂?；?jìng)爭(zhēng),進(jìn)而加強(qiáng)硫辛酸的生物合成,消除細(xì)胞生長(zhǎng)和surfactin產(chǎn)生的抑制作用[15]。

除了使用基因工程獲得高產(chǎn)surfactin菌株外,一些修飾surfactin結(jié)構(gòu)的策略也逐漸被開(kāi)發(fā),主要集中于肽環(huán)和疏水性脂肪酸鏈。通過(guò)定點(diǎn)誘變、取代、插入、缺失和模塊重排的方式,可極大限度重組非核糖體肽合酶生物合成模板中的肽模塊,產(chǎn)生新肽結(jié)構(gòu)。脂?；Y(jié)構(gòu)的修飾是改造surfactin的另一種手段。Dufour 等[54]將C14surfactin線性化合成,得到相比環(huán)狀結(jié)構(gòu)更低的、甚至沒(méi)有溶血活性的surfactin。Coutte等[45]研究發(fā)現(xiàn),敲除負(fù)責(zé)最終降解支鏈氨基酸的lpdV基因,線性C14surfactin的比例會(huì)顯著增加。姜建[55]利用分子手段,獲得了缺失1個(gè)氨基酸、抑菌活性高、溶血活性低的surfactin脂肽。

5 surfactin在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及食品領(lǐng)域的應(yīng)用

5.1 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)

脂肽的抗細(xì)菌或抗真菌活性增加了枯草芽胞桿菌在環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)力,枯草芽胞桿菌是目前公認(rèn)安全的微生物,其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抑制植物致病菌的能力,可用于農(nóng)業(yè)上的生物防治,且效果顯著[56-57]。戴芳等[58]在稻草和麩皮的堆肥中添加surfactin,證實(shí)surfactin具有抑制植物致病菌的作用,且堆肥時(shí)間極大縮短。另外,surfactin在農(nóng)藥中還具有助溶劑的作用,在促進(jìn)農(nóng)藥作用的同時(shí),還可促進(jìn)有機(jī)農(nóng)藥降解,減少對(duì)環(huán)境的損害[56]。

5.2 畜牧及水產(chǎn)業(yè)

肽類抗生素可強(qiáng)烈抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng),促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。肽類抗生素在消化道內(nèi)發(fā)揮作用,幾乎不被腸道吸收[59]。若人類或動(dòng)物采食后一般不存在體內(nèi)殘留問(wèn)題,肽類抗生素長(zhǎng)期添加在飼料中,既能調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群,又不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,是效果穩(wěn)定、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)致細(xì)菌耐藥性的環(huán)保型飼料添加劑。吳先華等[60]研究表明枯草芽胞桿菌fmbJ所產(chǎn)脂肽對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能及免疫機(jī)能具有較好的調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用。楊麗莉等[61]研究表明,枯草芽胞桿菌fmbJ所產(chǎn)脂肽對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydivphila)有很強(qiáng)的抑制效果,使銀鯽的免疫及抗氧化能力得到顯著提升。另外,surfactin具有增強(qiáng)魚(yú)體生長(zhǎng)性能,降低飼料系數(shù),改善血脂水平,降低全魚(yú)和肝臟粗脂肪含量,增加腸道絨毛和皺襞的高度,維持和修復(fù)腸道屏障,提升腸道脂肪酶和蛋白酶活性及抗氧化等能力[62]。

5.3 食品領(lǐng)域

我國(guó)目前食品添加標(biāo)準(zhǔn)允許使用的天然防腐劑主要有乳鏈菌肽(Nisin)和納他霉素(Natamycin)[3]。在食品工業(yè)中,抗菌脂肽因?yàn)槠浔砻婊钚院?、分子質(zhì)量較小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),可以用作乳化劑,來(lái)提高乳中各構(gòu)相之間的表面張力,使之形成均勻穩(wěn)定的分散體或乳化體,從而改善食品的組織結(jié)構(gòu)、口感和外觀,達(dá)到提高食品品質(zhì)的目的[63]。章棟梁[64]將高純度的surfactin應(yīng)用于肉品的防腐保鮮,結(jié)果顯示 surfactin 能明顯抑制肉丸中乳酸菌和假單胞菌屬的生長(zhǎng)繁殖,效果優(yōu)于Nisin;同時(shí) surfactin可以減少肉丸儲(chǔ)藏過(guò)程中脂肪氧化和pH值的上升,顯示出較好的護(hù)色功效,減少儲(chǔ)藏過(guò)程中因微生物作用而產(chǎn)生的惡臭味。胡仿香等[51]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌LS-9所產(chǎn)的脂肽surfactin,對(duì)串珠鐮刀菌及孢子的生長(zhǎng)、伏馬菌素B1的合成、禾谷鐮刀菌菌體的生長(zhǎng)和嘔吐毒素的產(chǎn)生均表現(xiàn)出一定的抑制作用,并成功將該脂肽運(yùn)用于玉米的儲(chǔ)藏。梅雨薇等[65]指出surfactin可顯著降低食物中的致病菌李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)和腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)在不銹鋼和聚丙烯表面的黏附力。

產(chǎn)surfactin的芽胞桿菌屬于益生菌,surfactin本身也展現(xiàn)出類似于益生菌方面的作用,包括調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、助消化生長(zhǎng)、降血脂等特性,并且surfactin 還具有降低膽固醇、抗凝血和抗氧化作用[66]。surfactin降低膽固醇功能主要體現(xiàn)在抗菌脂肽可以抑制膽固醇?；D(zhuǎn)移酶或低密度脂蛋白膽固醇與巨噬細(xì)胞的鍵合作用,使巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的脂蛋白含量下降,體內(nèi)膽固醇水平降低[66]。從這個(gè)角度考慮,脂肽surfactin具有諸多的益生菌功能,鑒于其高的安全級(jí)別,似乎不失為一種良好的食品添加物、輔料亦或是開(kāi)發(fā)功能食品如保健食品的優(yōu)選原料(作為膳食補(bǔ)充,緩解肥胖、高脂引起的Ⅱ型糖尿病等),這些可能會(huì)成為脂肽研究的新方向。

6 總結(jié)與展望

由于諸多的生物和物理化學(xué)特性,surfactin在科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用中引起相當(dāng)大的關(guān)注,但目前的發(fā)酵工藝成本高,不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。解決這一瓶頸的策略主要從2個(gè)方面開(kāi)展:1)針對(duì)發(fā)酵工藝,開(kāi)展優(yōu)化或開(kāi)發(fā)生物合成高效工藝研究,包括優(yōu)化培養(yǎng)基配方、發(fā)酵條件。另外尋找廉價(jià)的生物質(zhì)作為原料,例如農(nóng)業(yè)或工業(yè)廢棄物。但是存在發(fā)酵產(chǎn)量低、產(chǎn)物提取困難的問(wèn)題[67]。2)針對(duì)生產(chǎn)菌株,包括高產(chǎn)菌株的篩選和菌株的分子改造,從根本上解決產(chǎn)率低的問(wèn)題,以及采用低價(jià)高效的分離純化技術(shù)以輔助生產(chǎn)。

目前對(duì)于surfactin的抑菌機(jī)制、合成調(diào)控機(jī)制(前體供應(yīng),NRPS調(diào)控,外排和抗性),包括引發(fā)模塊(C-AGlu-PCP)的底物特異性,均需要進(jìn)一步探究。基于分子水平的修飾,目前仍存在許多阻礙,如修飾surfactin肽環(huán)的組合生物合成技術(shù),在非核糖體合成酶模塊之間的功能連接,修飾肽產(chǎn)物效果的不確定性以及低產(chǎn)率問(wèn)題,沒(méi)有直接調(diào)節(jié)surfactin脂肪?；Y(jié)構(gòu)的有效手段等。增強(qiáng)脂肪酸前體的從頭合成途徑可能是提高具有特定脂肪酰基結(jié)構(gòu)surfactin產(chǎn)量的有效策略,需要進(jìn)一步研究。隨著基因工程和合成生物學(xué)的發(fā)展完善,高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)率菌株的構(gòu)建指日可待。

就抗菌脂肽surfactin的應(yīng)用而言,目前的產(chǎn)量仍然無(wú)法滿足產(chǎn)業(yè)化需求,但對(duì)于小批量、高價(jià)值產(chǎn)品的應(yīng)用可行性極大,例如高端化妝品及制藥行業(yè)。另外從surfactin的功能與應(yīng)用來(lái)看,主要是基于其強(qiáng)有力的表面活性、抗菌、抗腫瘤、抗炎癥等特性,而對(duì)于其抗氧化作用、溶纖和溶血栓作用、抗肥胖細(xì)胞、改善腸道健康等可以作為益生角度的功能,并沒(méi)有得到足夠關(guān)注。隨著人民生活水平不斷提高以及對(duì)綠色健康食品的迫切需求,surfactin作為保健食品輔料或作為食品添加劑,其添加標(biāo)準(zhǔn)、安全性問(wèn)題等可能會(huì)成為新的研究方向。