不同強度運動對高脂飲食大鼠竇房結及心功能的保護作用

劉福泉，郝麗嬌，王 維，柳 凈，劉 尊，董珊珊

(1.滄州醫(yī)學高等?？茖W校健康管理與服務系，河北 滄州 061001；2.滄州市婦幼保健院手術室，河北 滄州 061001)

竇房結是心臟正常的起搏位點，對心功能起著重要的調節(jié)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食可造成脂肪過度向心內浸潤，當脂肪浸潤到竇房結會使其結構功能發(fā)生變化，神經受損，動脈狹窄，影響心臟功能，嚴重時可致死亡[2]。有研究報道，通過長期有規(guī)律的有氧運動能夠降低體內脂肪含量[3]，但有關運動能否抑制脂肪向心臟浸潤鮮有報道?；诖?，本研究從竇房結組織形態(tài)變化、脂肪浸潤量及竇房結神經變化，探討不同強度運動對長期高脂飲食引發(fā)的不良心臟功能的保護作用，旨在為健身鍛煉提供科學的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體質量(191.23±9.84)g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。大鼠于無特定病原級動物實驗室飼養(yǎng)，飲用雙蒸水，室溫為(23±2)℃，空氣濕度為40%～70%，分籠飼養(yǎng)，每籠 3只，共8籠。

1.2 試劑與儀器蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5,PGP 9.5)抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液、油紅O染液購自南京建成生物工程研究所；Vevo2100型小動物彩色多普勒超聲診斷儀購自加拿大VisualSonics公司，石蠟包埋機、冰臺、石蠟切片機、攤片機、全自動組織脫水機購自德國萊卡公司，光學顯微鏡、彩色數(shù)碼CCD攝像頭購自德國麥克奧迪公司，電子天平購自上海天平儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組與處理將大鼠適應性飼養(yǎng)(國家標準顆粒型固體大鼠飼料)1周后，隨機分為A、B、C、D組，每組6只。A組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)；B組、C組和D組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料依據文獻報道[4]配制(質量分數(shù)):普通飼料 54.5%、蔗糖20.0%、蛋黃粉15.0%、豬油9.0%、膽固醇1.0%、膽酸鈉0.5%。C組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)同時給予運動訓練，運動方法采用游泳訓練法[5-6]：水深為大鼠身體長度的2倍，水溫控制在(33±2)℃，每次放入水中3只大鼠，保證每只大鼠至少占有 0.05 m2的水面。實驗過程中為保持運動強度以小棍驅趕大鼠運動，每天確保在同一時間進行訓練。正式訓練前，第1周進行適應性游泳，每天逐漸增加游泳時間，第1周末游泳時間達到1 h；第2周開始正式實驗，每日60 min，每周6 d，持續(xù)訓練8周。D組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)同時給予運動訓練，第1周適應性游泳訓練后，逐漸增加負重進行5%體質量負重游泳，其余運動訓練方法同C組，每日60 min，每周6 d，持續(xù)訓練8周。

1.3.2 大鼠心功能測試干預8周后，清除各組大鼠胸部毛發(fā)，使用體積分數(shù)2%異氟烷吸入麻醉，應用Vevo2100型小動物彩色多普勒超聲診斷儀測量大鼠左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDS)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDD)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVVS)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fractions，LVEF)、左心室縮短分數(shù)(left ventricular shortening fraction，LVSF)。

1.3.3 大鼠竇房結取材及形態(tài)結構觀察末次游泳24 h后，各組大鼠用體積分數(shù)10%水合氯醛(0.04 mL·g-1)麻醉，取心臟，右心耳側朝上固定，以界溝為中心左右各5 mm平行剪開，上下腔靜脈處平行剪開，得一條形組織即為竇房結。取竇房結用體積分數(shù)95%的乙醇固定15 min，自來水沖洗1 min，蘇木精染色15 min，自來水沖洗1 min，伊紅染色35 s，自來水沖洗1 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察其形態(tài)結構。

1.3.4 油紅O染色法檢測大鼠竇房結脂肪細胞分布及含量采用油紅O染色法測量竇房結區(qū)脂肪細胞分布[7-8]：取竇房結組織，冰凍切片機切取15 μm 厚組織并貼于載玻片上，待組織恢復室溫，蒸餾水沖洗2 s，體積分數(shù)60%異丙醇浸洗2 s，油紅O染液浸染10 min，體積分數(shù)60%異丙醇浸染分色2 s；蒸餾水洗滌1 s，蘇木精復染2 min，自來水水洗10 min，蒸餾水沖洗 1 s，濾紙吸干水分，甘油封片，光鏡下觀察竇房結脂肪細胞分布，紅色為脂肪細胞，應用Image-Pro Plus軟件進行竇房結脂肪細胞染色陽性面積定量分析，計算整個視野內選定對象的面積總和[9-10]。

1.3.5 免疫組織化學法檢測大鼠竇房結神經標志物PGP 9.5表達應用ABC法進行免疫組織化學染色：取竇房結組織，使用全自動脫水機脫水、浸蠟、包埋，采用Leica石蠟切片機對組織蠟塊進行厚度為 5 μm 連續(xù)切片，每隔10張選1張，連續(xù)取4張，置于60 ℃ 恒溫干燥箱烘片1 h，乙醇脫蠟水化后將組織放入含有修復液的高壓鍋中加熱，有蒸汽冒出時開始計時3 min，修復完成后，自然冷卻至37 ℃左右，磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)反復清洗，滴加山羊血清，靜置20 min，滴加PGP 9.5 一抗，4 ℃過夜，PBS清洗，滴加二抗(SAB),PBS清洗，滴加DAB顯色劑，顯微鏡觀察，判斷顯色程度，自來水沖洗，蘇木精染色，溫水反藍，二甲苯透明，顯微鏡觀察，應用Image-Pro Plus軟件進行PGP 9.5染色陽性面積定量分析，計算整個視野內選定對象的面積總和[9-10]。

2 結果

2.1 4組大鼠心臟功能比較結果見表1。4組大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF、LVSF比較差異有統(tǒng)計學意義(F=6.840、6.698、4.884、15.333、17.293、41.025，P<0.05)。B組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著高于A組，SV、LVEF、LVSF顯著低于A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。C組大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF與A組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);C組大鼠LVSF顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。C組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著低于B組，SV、LVEF、LVSF顯著高于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。D組大鼠SV顯著低于A組，LVSF顯著高于A組，LVEF、LVSF顯著高于B組，SV顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組大鼠其余心功能指標分別與A組、B組及C組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 4組大鼠心功能指標比較

2.2 4組大鼠竇房結組織結構變化結果見圖1。A組大鼠竇房結形態(tài)結構完整，細胞質豐富染色均勻，細胞間隙正常。B組大鼠竇房結結構缺失，細胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂。C組大鼠竇房結形態(tài)結構良好，細胞間隙均勻較窄，細胞質染色均勻。與C組相比，D組大鼠竇房結形態(tài)結構欠佳，細胞間隙略增寬。

圖1 4組大鼠竇房結組織結構(HE染色，×40)

2.3 4組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞分布及其含量比較結果見圖2。油紅O染色結果顯示，竇房結區(qū)脂肪細胞呈橘紅色，細胞核呈藍色。與A組相比，B組、C組、D組大鼠竇房結區(qū)均出現(xiàn)大面積脂肪浸潤，B組脂肪浸潤最為嚴重，D組次之，C組較輕。A組、B組、C組、D組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞表達量分別為(675.5±53.16)、(3 263.00±560.53)、(1 007.75±230.88)、(2 227.12±632.43)mm2。4組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞陽性表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=29.657，P<0.05)。B組、C組、D組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞陽性表達量顯著高于A組，B組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞陽性表達量顯著高于C組和D組，D組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞陽性表達量顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 4組大鼠竇房結區(qū)脂肪細胞染色結果(油紅O染色，×10)

2.4 4組大鼠竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達及表達量的比較結果見圖3。PGP9.5免疫反應陽性細胞胞質呈棕灰色，神經組織多呈團塊狀。A組大鼠神經細胞最多且棕色較重，呈聚集狀；其次依次為C組、D組、B組，且棕色逐漸變淡。A組、B組、C組、D組大鼠竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達量分別為(3 348.1±429.19)、(698.9±62.24)、(3 198.5±264.17)、(1 895.2±97.28)mm2。4組大鼠竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=32.476，P<0.05)。A組大鼠竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達量顯著高于B組和D組，C組和D組大鼠竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達量顯著高于B組，C組大鼠竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達量顯著高于D組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 4組大鼠竇房結組織PGP9.5表達(免疫組織化學，×10)

3 討論

脂肪組織是人體最大的旁分泌與內分泌器官，能夠分泌多種具有生物活性的脂肪細胞因子，其分泌的抵抗素、瘦素、內脂素、脂聯(lián)素等脂肪細胞因子可夠促進心肌細胞纖維化，嚴重影響心臟功能[11-13]。而心外膜脂肪組織是最靠近心臟的脂肪組織，包裹心臟表面的80%[14-15]，隨著年齡的增長，心外膜脂肪組織會逐漸向心臟內部浸潤，一旦波及竇房結，將嚴重影響竇房結起搏及傳導功能。長期高脂飲食可造成脂肪過度向心內浸潤，影響心臟功能。本研究結果顯示，B組大鼠心臟功能指標中LVDS、LVDD、LVVS顯著高于A組，SV、LVEF、LVSF顯著低于A組，與王全河等[16]和王維敏[17]研究結果相同，證實長期高脂飲食可導致心功能顯著下降。本研究結果顯示，與A組比較，B組大鼠竇房結結構缺失，細胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂；竇房結區(qū)出現(xiàn)大面積脂肪浸潤，脂肪細胞陽性表達量顯著增高，竇房結區(qū)PGP9.5陽性表達量顯著降低，說明長期高脂飲食加速了脂肪組織向心內浸潤，導致竇房結結構缺失，細胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂，內部出現(xiàn)嚴重的脂肪浸潤，致使竇房結結構功能發(fā)生變化、神經受損、動脈狹窄等，從而影響心臟功能。

長期系統(tǒng)有規(guī)律的運動能夠改變心臟形態(tài)結構，并使其功能發(fā)生一系列的適應性變化，從而進一步增強心臟泵血功能。本研究結果顯示，與B組相比，C組、D組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著低于H組，SV、EF顯著高于B組；D組大鼠僅LVSF顯著高于B組；D組大鼠心臟功能指標LVDS、LVDD、LVVS略高于C組，EF、LVSF略低于C組，但差異無統(tǒng)計學意義；D組大鼠SV顯著低于C組。這一結果說明，通過有規(guī)律的運動能夠抑制高脂飲食造成的心功能下降現(xiàn)象，且有氧運動對心功能改善的效果要好于高強度運動。運動可增加能量消耗，降低體內脂肪含量。馬伏英等[18]研究認為，有氧運動能夠調節(jié)脂肪代謝，減少脂肪堆積；BAE等[19]和劉子銘等[20]研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動能夠降低體內脂肪含量；MATSUNAGE等[21]和CHIU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高強度運動能夠降低體內脂肪含量。本研究結果顯示，與B組相比，C組、D組大鼠脂肪浸潤現(xiàn)象顯著減輕，竇房結脂肪含量顯著降低；與C組相比，D組大鼠竇房結區(qū)脂肪含量顯著降低，D組大鼠竇房結形態(tài)結構欠佳，細胞間隙略增寬；這證實長期有規(guī)律的有氧運動能加速體內脂肪消耗，減輕體內脂肪過多堆積，阻止脂肪向竇房結的浸潤，且其效果好于高強度運動。

竇房結神經細胞數(shù)量直接影響竇房結搏動及傳導功能，進而影響心臟功能。有關運動對神經影響的研究已證實，有氧運動可以通過促使心內神經體積變大且數(shù)量增加來抵抗由于年齡增加導致的神經退行性變化[23]，有規(guī)律的運動能夠通過調節(jié)神經細胞因子的分泌及表達，調節(jié)神經遞質表達[24]；但長時間大強度運動可導致神經膠質細胞腫脹，且神經元細胞周圍空泡增多[25]。PGP9.5是神經標志物，其特異性染色為神經系統(tǒng)研究提供了高質量的技術，可特異性標志神經纖維及神經細胞，因此，本研究采用PGP9.5免疫組織化學來標記竇房結內部神經的變化，分析高脂飲食及運動對竇房結神經的影響。本研究結果顯示，C組和D組大鼠竇房結PGP9.5陽性表達量顯著高于B組，空泡程度減輕，說明有規(guī)律的運動消耗了體內脂肪，同時增加了細胞的抗氧化性，使竇房結神經損害得到改善；C組大鼠竇房結PGP9.5陽性表達量顯著高于D組，說明長期有規(guī)律的有氧運動更能有效抑制脂肪浸潤造成的竇房結神經纖維化、促使竇房結神經重塑。

綜上所述，長期有規(guī)律的有氧運動能夠顯著減輕高脂飲食引起的竇房結脂肪浸潤，促使竇房結神經重塑，維持正常竇房結組織結構及心臟功能。