一種高通量鑒定甘藍型油菜耐低氮種質(zhì)的方法及其應(yīng)用

萬何平　何冰冰　陳敬東　戢強強　曾長立

摘要：構(gòu)建了一套高通量的油菜水培平臺，以104份甘藍型油菜（Brassica napus L.）種質(zhì)為研究材料，采用該水培平臺研究測定不同油菜品種（系）苗期在高氮（10 mmol/L）和低氮（0.6 mmol/L）供應(yīng)水平下的生長情況，并對104份甘藍型油菜品種（系）的耐低氮脅迫能力進行分級。結(jié)果顯示，與高氮水平相比，低氮環(huán)境能夠顯著抑制甘藍型油菜的生長，且不同基因型材料間的抑制程度存在廣泛遺傳變異。通過葉片數(shù)比值、地上部分長度比值和地上鮮質(zhì)量比值進行聚類分析，共將104份油菜品種（系）分為低氮耐受型、低氮敏感型和中間型3個等級，其中7個低氮耐受型品種，65個低氮敏感型品種，剩下32個為中間型，為油菜低氮耐受能力的遺傳改良提供了理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：甘藍型油菜;氮高效;低氮脅迫;聚類分析

中圖分類號：S634.303 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0078-06

氮是植物生長所必需的大量元素之一，它對植物代謝、產(chǎn)量和品質(zhì)的形成具有重要作用。據(jù)估計，全球谷物增長的將近1/2歸因于氮肥的施用[1]。農(nóng)作物只能吸收約1/2的農(nóng)業(yè)氮肥，土壤中殘留的大量氮會導(dǎo)致嚴重的生態(tài)問題，如土壤酸化、水富營養(yǎng)化等[2-3]。油菜是我國重要的油料作物之一，種植面積約670萬hm2/年，產(chǎn)菜籽油約500萬t/年，約占自產(chǎn)植物油總量的45%以上[4-5]。與其他農(nóng)作物相比，油菜生長期間需要大量投入肥料，尤其是氮肥，然而油菜的氮利用效率卻很低[6-7]。甘藍型油菜（Brassica napus L.）是3種油菜（白菜型油菜、芥菜型油菜、甘藍型油菜）中種植范圍最廣的種類，是我國重要的油料作物[5]。近年來，為了適應(yīng)經(jīng)濟發(fā)展的需求，油菜的用途已從油用為主，逐漸發(fā)展為蔬菜、觀賞、飼料等多功能用途[8]。其中，依托油菜花海打造農(nóng)業(yè)觀光旅游正成為各大投資商關(guān)注的新熱點，目前已經(jīng)打造的有江西婺源、陜西漢中、江蘇興化、湖北荊門、云南羅平、重慶潼南和青海門源等15個油菜觀賞基地[9-10]。隨著美麗鄉(xiāng)村建設(shè)的推進，全國各地還涌現(xiàn)出一大批以油菜花為主題的景觀。在此大的背景下，急需篩選出適應(yīng)性廣、耐低氮的油菜品種（系），以降低油菜花海景觀的種植成本。

目前，對于不同作物的氮高效種質(zhì)的篩選研究主要包括苗期篩選和全生育期篩選。但全生育期篩由于周期長、易受到環(huán)境因子的影響，難以真正全面地反映出作物對低氮的耐受能力。因此，更多的研究是在苗期對作物進行初篩，再用全生育期加以驗證[11]。近年來，關(guān)于油菜氮高效基因型種質(zhì)和高效機理的研究已取得了一些研究進展[12-14]。洪娟利用土培的方法對100份油菜種質(zhì)在低氮和氮正常條件下地上部干質(zhì)量、葉片數(shù)、葉片葉綠素含量、含氮量和氮累積量進行考察，初步篩選出氮高效和氮低效油菜種質(zhì)各3份，認為生物量積累和氮素積累量是評價油菜苗期氮高效的可靠指標，葉片數(shù)可作為參考指標[15]。顧熾明等利用營養(yǎng)液培養(yǎng)的方法考察了162份油菜種質(zhì)在低氮和氮正常條件下的生物量、主根長、側(cè)根長、根冠比、氮累積量及氮吸收和利用效率，初步將162份油菜種質(zhì)按氮效率分成了3類，其中雙高效型23份、雙低效型28份、中間型111份，同樣認為生物量積累是評價油菜苗期氮高效的可靠指標[16]。究其原因，生物量積累是油菜生長發(fā)育最終結(jié)果的體現(xiàn)，能綜合反映出植株在低氮環(huán)境下的生長情況[12]。

目前，篩選鑒定油菜氮高效的栽培方式主要為水培和土培，其中水培技術(shù)由于其能夠精準控制營養(yǎng)成分的含量，已被成功應(yīng)用于油菜肥料利用效率的研究上[14，17]。但是，目前的油菜水培技術(shù)還存在規(guī)模小、通量低、控制成本高等不足，無法滿足對大規(guī)模油菜種質(zhì)資源的篩選鑒定要求。為此，本研究建立了一套高通量的油菜水培系統(tǒng)，利用該平臺對104份甘藍型油菜種質(zhì)進行耐低氮能力的篩選鑒定，在此基礎(chǔ)上篩選獲得耐低氮的油菜品種（系），為油菜氮高效遺傳改良提供了理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗供試材料包括104份甘藍型油菜核心種質(zhì)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所伍曉明研究員提供，主要來自我國各油菜主產(chǎn)區(qū)的地方品種（系）、育種材料和栽培品種（系），油菜種質(zhì)適應(yīng)性強，具有廣泛的遺傳多樣性。

1.2試驗設(shè)計及表型鑒定

為了盡可能減少栽培環(huán)境對試驗結(jié)果的影響，本試驗建立了一套同時可容納超過3 000株油菜幼苗的精準化控制水培系統(tǒng)（培養(yǎng)池的長、寬、高分別為12.5、0.8、0.4 m），主要包括營養(yǎng)液補充系統(tǒng)、營養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)、空氣泵和補光系統(tǒng)等（圖1），并利用該系統(tǒng)對104份甘藍型油菜進行種植。本試驗于江漢大學(xué)湖北省漢江流域生物資源與利用工程中心的油菜水培實驗室內(nèi)進行。

甘藍型油菜水培法的具體步驟如下。

（1）播種。用干凈的尼龍繩將長、寬、高分別為60、40、12 cm的藍色盆子分成60格，并在最上面鋪上1層無菌紗布。向苗床內(nèi)加滿純水保證紗布浸濕，將104份甘藍型油菜材料均勻播撒到對應(yīng)的小格中并記下編號，每個材料播種約50粒。

（2）制作培養(yǎng)板。將2 cm的高密度泡沫板制成60 cm×100 cm規(guī)格的培養(yǎng)板，培養(yǎng)板上用打孔器均勻打出140個直徑約為2 cm的圓形小孔。將厚度約為2 cm的海綿剪成邊長約為2.5 cm的方塊，并將海綿方塊沿1條對角線剪開1個小口用來固定幼苗。

（3）移苗和營養(yǎng)管理。配制經(jīng)改良的適合甘藍型油菜水培的營養(yǎng)液[18]。播種7 d后將甘藍型油菜幼苗從紗布上取出，用海綿方塊夾住下胚軸基部，然后移植至培養(yǎng)板上的小孔中并貼上標簽，每個材料取48株生長一致的幼苗，分別移栽至6個培養(yǎng)板中，每個培養(yǎng)板移栽8株，其中高氮處理3板、低氮處理3板。最后將固定有幼苗的培養(yǎng)板放置在2個裝有1/4全營養(yǎng)液的培養(yǎng)池（營養(yǎng)液總體積為 1 000 L）中進行培養(yǎng)。1周后更換1/2全營養(yǎng)液，再過1周后更換全營養(yǎng)液。

（4）不同氮濃度脅迫處理。幼苗移栽21 d后進行不同氮水平處理，設(shè)置高氮（10 mmol/L）和低氮（0.6 mmol/L）2個處理，具體營養(yǎng)液濃度見表1。

（5）表型考察與數(shù)據(jù)分析。不同氮處理21 d后測定甘藍型油菜苗的葉片數(shù)（NL）、地上長度（SL）、地上部分鮮質(zhì)量（SFW）。為了消除不同甘藍型油菜的基因型背景差異，計算3個性狀的低氮耐受指數(shù)（LNT-NL、 LNT-SL和LNT-SFW，其為低氮條件下的性狀值與對照條件下性狀值的比值[14，19]）。所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進行分析處理，圖片使用Origin 8.0和R軟件制作。

2結(jié)果與分析

2.1不同氮水平條件下甘藍型油菜品種（系）表型分析

如表2所示，在低氮處理條件下，甘藍型油菜幼苗的NL的平均值為4.93張，變化范圍為3.20～975張，變異系數(shù)為18.78%;SL的平均值為 1598 cm，變化范圍為10.38～22.30 cm，變異系數(shù)為14.21%;SFW的平均值為4.26 g，變化范圍為179～12.47 g，變異系數(shù)為29.98%。在高氮條件下，甘藍型油菜幼苗的NL的平均值為6.94張，變化范圍為5.00～12.33張，變異系數(shù)為16.51%;SL的平均值為21.94 cm，變化范圍為14.46～27.53 cm，變異系數(shù)為14.48%;SFW的平均值為 10.91 g，變化范圍為5.61～26.65 g，變異系數(shù)為30.36%;各性狀在低氮環(huán)境下的表型值均極顯著低于高氮環(huán)境下的表型值。在2種氮營養(yǎng)水平下，NL、SL和SFW都呈現(xiàn)連續(xù)性分布（圖2），說明這些性狀都符合數(shù)量性狀特征。

3個低氮脅迫耐受指數(shù)（LNT-NL、LNT-SL和LNT-SFW）呈現(xiàn)出較大的遺傳變異，LNT-NL的平均值為0.71，變化范圍為0.55～0.93，變異系數(shù)為11.01%;LNT-SL的平均值為0.73，變化范圍為061～0.89，變異系數(shù)為9.43%;LNT-SFW的平均值為0.41，變化范圍為0.21～0.73，變異系數(shù)為31.57%。結(jié)果表明，低氮脅迫環(huán)境對不同甘藍型油菜品種葉片數(shù)、地上長度和地上鮮質(zhì)量的抑制效果存在顯著差異，其中地上鮮質(zhì)量受影響最大。此外，3個耐低氮指數(shù)性狀均符合連續(xù)型正態(tài)分布的特征（圖2），說明油菜耐低氮性狀符合數(shù)量性狀的遺傳特征。

2.2甘藍型油菜品種（系）各性狀間的相關(guān)性分析

如圖3所示，LNT-NL與低氮葉片數(shù)、低氮地上鮮質(zhì)量和LNT-SFW呈極顯著正相關(guān);LNT-SL與低氮葉片數(shù)、低氮地上長度、低氮地上鮮質(zhì)量以及LNT-SFW呈顯著正相關(guān)，LNT-SL與高氮地上長度呈顯著負相關(guān);LNT-SFW與低氮葉片數(shù)、LNT-NL、LNT-SL以及低氮地上鮮質(zhì)量呈顯著正相關(guān)性， 與高氮地上長度和高氮地上鮮質(zhì)量呈顯著

負相關(guān);LNT-NL和LNT-SFW間呈顯著正相關(guān);LNT-SL和LNT-SFW間呈顯著正相關(guān)，而LNT-NL和LNT-SL之間不存在相關(guān)性。

2.4甘藍型油菜低氮脅迫耐受能力的初步分級

根據(jù)LNT-NL、LNT-SL和LNT-SFW性狀對104份甘藍型油菜進行聚類分析，結(jié)果如圖4所示，104份材料被分成了三大類，其中7個材料劃分為低氮耐受型品種（系）（表3），其LNT-NL≥0.8，LNT-SL≥0.68，且LNT-SFW≥0.41;65個材料被劃分為低氮敏感型品種（系），這些材料的LNT-NL和LNT-SL普遍在0.7以下，且LNT-SFW普遍在0.4左右，表現(xiàn)為對低氮敏感。剩下32個材料則被劃分為中間型材料。

3討論與結(jié)論

作物耐低氮性狀是由多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，基因與環(huán)境之間存在著明顯的相互作用，易受非遺傳因素的影響[20-21]。因此，選擇正確的評價方法是獲得準確表型的關(guān)鍵。目前，甘藍型油菜耐低氮種質(zhì)的篩選方法主要有田間試驗法和盆栽模擬試驗法[22-23]。盆栽模擬試驗按生長介質(zhì)的不同可分為土培試驗法和水培試驗法。其中，土培盆栽試驗更接近實際生產(chǎn)，是篩選耐低氮基因型最直接、最可靠的方法，但難以進行根系形態(tài)和生理生化特性的研究[24]。

近年來，水培技術(shù)已成功地應(yīng)用于養(yǎng)分吸收的研究[9，17，25]中。在水培試驗中，營養(yǎng)液中各種營養(yǎng)素的濃度、類型和供給時間都可精確控制，營養(yǎng)素分布相對均勻，因此十分適合用來篩選大量的耐低氮作物遺傳資源[26]。盡管如此，目前普遍采用的油菜水培系統(tǒng)還存在以下2點不足：第一，傳統(tǒng)油菜水培通常采用小規(guī)格的塑料方盒作為栽培容器，不同材料間會存在營養(yǎng)競爭關(guān)系，因此，小規(guī)格的水培容器不利于維持養(yǎng)分的均勻和穩(wěn)定。第二，由于油菜根系長期浸入營養(yǎng)液中，會影響根系的正常呼吸作用，進一步影響根系對營養(yǎng)離子的吸收與轉(zhuǎn)運。以上問題極大地限制了油菜水培的規(guī)模和表型鑒定的精準性。為此，本研究通過不斷的摸索實踐，建立了可容納3 000余株油菜幼苗的水培體系，包括營養(yǎng)液補充系統(tǒng)、營養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)、空氣泵和補光系統(tǒng)。對104份甘藍型油菜種質(zhì)進行表型鑒定，結(jié)果顯示，該水培體系能滿足甘藍型油菜的正常生長，是鑒定營養(yǎng)吸收相關(guān)表型的理想方法。

油菜是小麥、水稻和大麥輪作的一種非常適宜的作物，對后續(xù)谷物的產(chǎn)量產(chǎn)生了積極的影響[27-29]。然而，油菜比其他作物需要更多的氮肥[7]。盡管油菜可以從土壤中吸收大量的氮，但它一直被認為是一種氮肥利用率低、單位施氮種子產(chǎn)量低的作物，約為谷類作物的1/2[30]。此外，油菜不同時期需氮量差別很大，其中氮素苗期占全生育期40%以上[31]。因此，苗期是油菜對氮脅迫相對敏感的時期。本研究選擇對甘藍型油菜苗期的耐低氮能力進行鑒定和評價，結(jié)果顯示，低氮脅迫能顯著地抑制甘藍型油菜幼苗的生長發(fā)育，主要體現(xiàn)在葉片數(shù)的減少、生物量積累的受限等方面。通過計算各個性狀的耐低氮指數(shù)，發(fā)現(xiàn)在104份不同遺傳背景的甘藍型油菜種質(zhì)中，其耐低氮能力存在廣泛的遺傳變異。通過對3個耐低氮指數(shù)進行聚類分析，篩選得到7個低氮耐受型油菜品種（系），為進一步提升現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)油菜品種的氮利用效率提供了遺傳基礎(chǔ)。目前，雖然關(guān)于低氮脅迫對油菜的苗期和成熟期的研究相對較多，然而對種子萌發(fā)期和開花期等生長發(fā)育關(guān)鍵時期的研究還十分少見。因此，后期有必要繼續(xù)開展這方面的研究，篩選得到全生育期耐低氮能力強的油菜資源。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0100202-25）;湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心開放基金（編號：06450003）;江漢大學(xué)博士啟動基金（編號：06450002）。

作者簡介：萬何平（1988—），男，湖北武漢人，博士，講師，主要從事油菜遺傳研究。E-mail：362057164@qq.com。

通信作者：曾長立，博士，教授，主要從事油菜種質(zhì)資源鑒定與利用。E-mail：973345988@qq.com。