基于葉片解剖結(jié)構(gòu)的12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系抗旱性分析

王煙霞，樊軍鋒，程瑋哲，高建社，周永學(xué)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

楊樹(shù)(Populusspp.)是楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)樹(shù)種的統(tǒng)稱(chēng)，有100多個(gè)種,分布在世界各地，我國(guó)分布有53個(gè)種，其中35個(gè)為特有種。楊樹(shù)因具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性，成為西北地區(qū)“三北”防護(hù)林體系的主栽樹(shù)種，在緩解木材短缺和治理生態(tài)環(huán)境方面均占有重要地位[1]。在我國(guó)，楊樹(shù)的地理分布范圍在25°～53° N和80°～134° E，主要集中于西北、華北、東北及西南等干旱、半干旱地區(qū)[2]。由于在干旱、半干旱地區(qū)缺少灌溉條件，楊樹(shù)的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，從而限制了其經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益的充分發(fā)揮，因此選育出抗旱性強(qiáng)的楊樹(shù)品種具有重要意義[3]。

長(zhǎng)期在干旱環(huán)境中生長(zhǎng)的植物，會(huì)不斷形成多種抗旱、耐旱的形態(tài)和葉片結(jié)構(gòu)特征，其中葉片結(jié)構(gòu)特征最能反映植物適應(yīng)干旱環(huán)境的能力[4-5]，而在抗旱性評(píng)價(jià)中，葉片的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)最能反映植物的抗旱能力[6]。王怡[7]選取角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度/葉肉組織厚度、第一層?xùn)艡诮M織細(xì)胞密集度等指標(biāo)，對(duì)沙棘、文冠果、虎榛子的抗旱能力進(jìn)行了鑒定。劉紅茹等[8]以5種木犀科植物為研究材料，指出主脈厚度、柵欄組織厚度等可以反映植物抗旱能力，是葉片解剖結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。邱興等[9]篩選出葉片厚度、主脈厚度、柵欄組織與海綿組織厚度之比3項(xiàng)主要指標(biāo)，并結(jié)合模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)了6個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的抗旱性。近年來(lái)，評(píng)價(jià)楊樹(shù)抗旱性的研究仍主要集中于盆栽控水后生理生化指標(biāo)的變化方面，而通過(guò)定量分析葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)楊樹(shù)抗旱性的研究較少[1-5,10-11]。

為了更好地評(píng)價(jià)各楊樹(shù)無(wú)性系的抗旱能力，本研究選取自意大利引進(jìn)的歐美楊與銀白楊的雜交無(wú)性系(La、Pa、Ta、Qg、Ti、A23、A39、A50、A54)及其近緣無(wú)性系，依據(jù)角質(zhì)層厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、主脈厚度、柵欄組織厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)等7項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行植物抗旱能力評(píng)價(jià)，以期為進(jìn)一步選育優(yōu)良抗旱楊樹(shù)無(wú)性系及其資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

12個(gè)供試楊樹(shù)無(wú)性系均來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河試驗(yàn)站種質(zhì)資源庫(kù)[12](表1)。其中歐美楊無(wú)性系 La、Pa、Ta、Qg、Ti、107 和銀白楊無(wú)性系 A23、A39、A50、A54、I-101 均為意大利引進(jìn)無(wú)性系，84K楊由韓國(guó)引進(jìn)。試驗(yàn)材料為 1 年生楊樹(shù)扦插苗的葉片，統(tǒng)一在2020-09-01采摘于扦插苗株行距為30 cm×40 cm的苗圃。每個(gè)無(wú)性系選取3株受光均勻的代表性植株，每株選取向陽(yáng)面樹(shù)冠中部的功能葉各15片，沿葉片主脈的1/2中心處切取0.5 cm×1 cm的小片，立即投入FAA固定液中固定24 h以上,以確保細(xì)胞原生質(zhì)凝固。

表1 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系及其遺傳背景Table 1 12 poplar clones and their genetic background

1.2 方 法

取在FAA固定液中固定24 h以上的供試葉片，采用常規(guī)石蠟切片法制作切片，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%，80%和95%的酒精梯度脫水后，用體積比為1∶1的無(wú)水乙醇和二甲苯進(jìn)行脫蠟，之后用體積分?jǐn)?shù)100%二甲苯再次脫蠟；完成脫蠟后進(jìn)行浸蠟包埋，使用Lecia半自動(dòng)切片機(jī)切片，厚度為 10～12 μm；切片用二甲苯脫蠟透明、番紅-固綠對(duì)染和中性樹(shù)膠封固。制作好的切片于Motic光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇結(jié)構(gòu)清晰完整的石蠟切片用 Motic Image Advanced 3.2測(cè)量軟件拍照，并測(cè)算和記錄角質(zhì)層厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、主脈厚度、柵欄組織厚度和葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度等葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)，每個(gè)視野重復(fù)30次。其中葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度按下式計(jì)算：

葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003、SPSS 20.0和Origin 2020軟件對(duì)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行單因素方差分析、相關(guān)性分析和主成分分析，最后采用隸屬函數(shù)法對(duì)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的抗旱能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3.1 單因素方差分析 利用SPSS 20.0軟件對(duì)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(Duncan’s法)，選取95%顯著水平的結(jié)果(P=0.05)進(jìn)行比較。

變異系數(shù)(CV)=(標(biāo)準(zhǔn)差/平均值)×100%。

1.3.2 相關(guān)性分析 利用Origin 2020軟件中的Pearson相關(guān)性分析方法，對(duì)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的7個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，以更直觀地了解指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)程度。

1.3.3 主成分分析 運(yùn)用主成分分析法對(duì)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的7個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步分類(lèi)和簡(jiǎn)化，因指標(biāo)間具有不同程度的相關(guān)性，信息存在相互重疊，葉片結(jié)構(gòu)變異過(guò)小的指標(biāo)往往會(huì)使分析結(jié)果不同，選取變異系數(shù)大的指標(biāo)則分析結(jié)果更具意義[13]。因此本研究選取累積貢獻(xiàn)率≥85%的指標(biāo)作為抽取主成分的原則，并結(jié)合各主成分的貢獻(xiàn)率、各主成分中每個(gè)指標(biāo)的載荷量、變異系數(shù)的大小[14-16]進(jìn)一步分類(lèi)和簡(jiǎn)化，篩選出具有代表性的指標(biāo)，以提高楊樹(shù)抗旱性評(píng)價(jià)分析的效率和可靠性。

1.3.4 楊樹(shù)抗旱性綜合評(píng)價(jià) 采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)法[17]，對(duì)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。按隸屬函數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，求得依據(jù)主成分分析法選擇的 3 項(xiàng)主要指標(biāo)的抗旱隸屬函數(shù)平均值，平均值大小與抗旱性強(qiáng)弱呈正相關(guān)，即平均值越大，表明抗旱性就越強(qiáng)[18]。隸屬函數(shù)值的計(jì)算公式如下：

(1)

如果某一指標(biāo)與抗旱性評(píng)價(jià)為負(fù)相關(guān)，可用反隸屬函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，反隸屬函數(shù)的計(jì)算公式如下：

(2)

式中：X(μ)為隸屬函數(shù)值，Xij為i無(wú)性系j指標(biāo)的測(cè)定值，Xj min和Xj max為所有供試無(wú)性系中j指標(biāo)的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片的解剖結(jié)構(gòu)

2.1.1 表皮特征 由表 2 可知，各楊樹(shù)無(wú)性系角質(zhì)層比較發(fā)達(dá)，有利于減少水分散失，其厚度為1.94～17.07 μm，其中Pa的厚度最小，A50的厚度最大，變異系數(shù)為 40.11%；從角質(zhì)層厚度來(lái)看，A50抗旱性較強(qiáng)。上表皮厚度為5.82～26.23 μm，變異系數(shù)為 49.02%；下表皮厚度為3.28～18.96 μm，變異系數(shù)為 50.08%。上述 3 項(xiàng)指標(biāo)在各楊樹(shù)無(wú)性系間存在差異。

圖1顯示，楊樹(shù)葉片上表皮和下表皮均由1層細(xì)胞組成，細(xì)胞排列整齊緊密，呈矩圓形或矩形，表皮由厚角質(zhì)層覆蓋。

1.84K;2.I-101;3.107;4.A23;5.A39;6.A50;7.A54;8.La;9.Pa;10.Qg;11.Ta;12.Ti。圖2同1.84K;2.I-101;3.107;4.A23;5.A39;6.A50;7.A54;8.La;9.Pa;10.Qg;11.Ta;12.Ti.Fig.2 is the same圖1 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片的顯微結(jié)構(gòu)(10×10)Fig.1 Microstructure of leaves of 12 poplar clones(10×10)

2.1.2 中脈特征 由表 2 可以看出，12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的主脈比較發(fā)達(dá)，厚度在496.99～1 712.35 μm，其中Pa的厚度最小，107的厚度最大，變異系數(shù)為 32.04%。由圖2可以看出，12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的維管束均為外韌維管束，其中無(wú)性系107具有3束維管束，A23、A39、A50、A54、La、Ti和Qg有2束維管束，而84K、I-101、Pa和Ta只有1束維管束。

圖2 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系維管束橫切面的顯微結(jié)構(gòu)(10×40)Fig.2 Microstructure of transverse section of vascular bundle of 12 poplar clones(10×40)

2.1.3 葉肉組織特征 觀測(cè)結(jié)果(圖1)表明，供試12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的葉片全為異面葉，其中無(wú)性系Ta、La具有雙層?xùn)艡诮M織，其余無(wú)性系均只有一層?xùn)艡诮M織。由表 2 可知，12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片厚度為39.62～201.59 μm，其中Qg的厚度最大，Pa的厚度最小，變異系數(shù)為 39.13%；柵欄組織由2層長(zhǎng)柱形細(xì)胞組成，排列緊密(圖1)，其中柵欄組織厚度最大的無(wú)性系為 107(86.94 μm)，Pa 的厚度最小(25.53 μm)，變異系數(shù)為 27.87%；葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)為27%～66%，其中La的最小(27%)，Pa的最大(66%)，變異系數(shù)為 59.09%。

2.2 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間的相關(guān)性

12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between anatomical structure indexes of 12 poplar leaves

由表3可知，在12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的7個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)中，角質(zhì)層厚度與葉片厚度、柵欄組織厚度之間呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01)；上表皮厚度與下表皮厚度、葉片厚度、主脈厚度、柵欄組織厚度之間呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01),與CTR之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P≤0.01)；下表皮厚度與葉片厚度、主脈厚度之間呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01)，與CTR之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P≤0.01)；葉片厚度與主脈厚度、柵欄組織厚度之間呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01)，與CTR之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P≤0.01)；主脈厚度與柵欄組織厚度之間呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01)，與CTR之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P≤0.01)；柵欄組織厚度與CTR之間呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01)。

2.3 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的主成分分析

從表4可知，在主成分分析中前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到85.741%，說(shuō)明前3個(gè)主成分可以較好地體現(xiàn)葉片解剖結(jié)構(gòu)7個(gè)指標(biāo)的大部分信息，因此選取前3個(gè)主成分，并計(jì)算出相應(yīng)的載荷矩陣。

表4 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的主成分分析Table 4 Principal components analysis of anatomical indexes of 12 poplar leaves

從表5可知，各指標(biāo)在3個(gè)主成分中的載荷值有很大差異，指標(biāo)的載荷值越大，說(shuō)明其對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大，典型性越優(yōu)。在第1主成分中，CTR和主脈厚度有較高的載荷值，反映了植物在干旱環(huán)境下的光合能力和自我保護(hù)能力，其中CTR的變異系數(shù)最大(59.09%)、載荷值最高(0.918)，因此選擇CTR作為第 1 主成分的典型指標(biāo)；第2主成分中，角質(zhì)層厚度的載荷值最大(0.796)，遠(yuǎn)高于其他指標(biāo)，反映對(duì)葉片細(xì)胞的保護(hù)和機(jī)械支撐能力，因此選擇角質(zhì)層厚度作為第 2 主成分的典型指標(biāo)；第 3 主成分中，葉片厚度的載荷值最高(0.725)，反映了葉片貯水保水的能力，因此選擇葉片厚度作為第 3 主成分的典型指標(biāo)。

表5 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的主成分載荷矩陣Table 5 Principal component load matrix among anatomical structure indexes of 12 poplar leaves

2.4 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系抗旱性的綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)主成分分析結(jié)果選擇的 3 個(gè)最佳指標(biāo)角質(zhì)層厚度、葉片厚度、CTR，計(jì)算隸屬函數(shù)平均值，結(jié)果如表 6 所示。對(duì)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系的隸屬函數(shù)平均值進(jìn)行排序，可知其抗旱能力從高到低依次為：A50>Qg>Ti>A23>La>107>Ta>A54>I-101>A39>84K>Pa(表6)。

表6 12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系抗旱性的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6 Comprehensive evaluation of drought resistance in 12 poplar clones

3 討論與結(jié)論

長(zhǎng)期生長(zhǎng)在干旱、半干旱地區(qū)的植物，其葉片解剖結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸發(fā)生適應(yīng)性變化。根據(jù)本研究結(jié)果，12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系因長(zhǎng)期適應(yīng)干旱缺水的環(huán)境，具有共同的旱生結(jié)構(gòu)特征，但不同無(wú)性系的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征存在不同程度的差異，主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：

(1)葉片表皮外壁有發(fā)達(dá)的角質(zhì)層。角質(zhì)層是不透水的脂肪性物質(zhì)，可以減少葉片水分蒸發(fā)；另外，發(fā)達(dá)的角質(zhì)層具有一定的機(jī)械支撐能力[19]，植物缺水時(shí)葉片不至于立即萎蔫。非耐旱性植物的角質(zhì)層厚度一般在0.03～3 μm[20]，本研究中供試楊樹(shù)無(wú)性系角質(zhì)層厚度為1.94～17.07 μm，厚度高于非耐旱性植物，說(shuō)明其耐旱性較強(qiáng)。角質(zhì)層厚度排序?yàn)锳50>A23>Qg>A54>I-101>Ta>La>Ti>107>A39>84K>Pa，這是A50、Qg、A23綜合抗旱能力較強(qiáng)，A39、84K、Pa綜合抗旱能力較弱的原因之一。

(2)葉片較厚。葉片越厚，表明其貯藏水分的能力越強(qiáng)[21]，越有利于植物在干旱環(huán)境下適應(yīng)生存。非耐旱性植物的葉片厚度一般小于90 μm[22]，本研究中12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系葉片厚度為39.62～201.59 μm，除Ta和Pa外，其他無(wú)性系葉片厚度均大于非耐旱性植物。葉片厚度排序?yàn)镼g>La>Ti>107>A50>A54>A23>A39>84K>I-101>Ta>Pa，由此可知Ti、107角質(zhì)層雖薄，但其葉片較厚，因此二者抗旱能力也較強(qiáng)。

(3)有多束維管束。葉片是植物的主要光合部位，維管束在葉片和葉鞘中擔(dān)任著運(yùn)輸養(yǎng)分和水分的功能，負(fù)責(zé)將光合作用的產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)街仓旮鞑课?，以供給自身的正常生命活動(dòng)[23]。本研究中，無(wú)性系107具有3束維管束，這也是其角質(zhì)層厚度不大但抗旱性較強(qiáng)的另一個(gè)原因。無(wú)性系A(chǔ)23、A39、A50、A54、La、Ti和Qg具有2束維管束，無(wú)性系84K、I-101、Ta、Pa只有1束維管束。

(4)擁有發(fā)達(dá)的柵欄組織。干旱地區(qū)光照強(qiáng)烈，高度發(fā)達(dá)的柵欄組織可以保護(hù)葉肉細(xì)胞免受灼傷[24]，其中柵欄組織分布于葉的背腹兩面，可使干旱缺水植物萎蔫時(shí)減少機(jī)械損傷[25]。本研究中，只有無(wú)性系Ta、La具有雙層?xùn)艡诮M織，這也是Ta雖只有1束維管束但抗旱性卻高于部分有2束維管束無(wú)性系的原因。

本研究通過(guò)主成分分析篩選出角質(zhì)層厚度、葉片厚度和葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)3個(gè)指標(biāo)為抗旱性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，運(yùn)用隸屬函數(shù)法得到12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系抗旱性大小排序?yàn)锳50>Qg>Ti>A23> La>107>Ta>A54>I-101>A39>84K>Pa。其中 A50 因其角質(zhì)層和葉片較厚、擁有2束維管束及發(fā)達(dá)的柵欄組織結(jié)構(gòu)，因此抗旱性?xún)?yōu)于其他無(wú)性系；無(wú)性系84K、I-101、Pa只有1束維管束，且角質(zhì)層和葉片較薄，因此其抗旱性相對(duì)較弱。可見(jiàn)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)能夠較好地反映楊樹(shù)的抗旱特性，所得結(jié)果比較可靠，可以作為評(píng)價(jià)12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系抗旱能力的指標(biāo)。12個(gè)楊樹(shù)無(wú)性系中，A50、Qg、Ti、A23和La抗旱性較強(qiáng)，可作為優(yōu)良楊樹(shù)無(wú)性系進(jìn)行推廣。