小麥鐮刀菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法研究及應(yīng)用

雷欣宇 李 曦 趙 珊 鄭幸果 仲伶俐

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（成都），成都610066）

小麥赤霉病又稱麥穗枯、爛麥頭、紅麥頭，是一種典型的流行性氣候型病害，是威脅麥類生產(chǎn)的主要病害之一[1]。鐮刀菌是小麥赤霉病的主要病原菌。經(jīng)鐮刀菌浸染后的小麥不僅品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴(yán)重?fù)p失，其次級代謝物鐮刀菌毒素留存于小麥籽粒中，還會嚴(yán)重危害人畜健康[2～4]。鐮刀菌毒素主要包括單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素、伏馬菌素和一些丁烯酸內(nèi)酯、倍半萜類化合物[5]。小麥易受浸染的毒素中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3－乙?；撗跹└牭毒┐迹?－ADON）、15－乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15－ADON）和雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）等單端孢霉烯族化合物為主，其中又以DON污染范圍最廣，污染情況最嚴(yán)重，對小麥產(chǎn)品的品質(zhì)安全產(chǎn)生極大的威脅。

由鐮刀菌引起的小麥赤霉病在我國麥區(qū)均有發(fā)生。韓小敏等[6]調(diào)查了安徽、北京、河南、吉林和山東小麥粉中10種鐮刀菌毒素的污染情況，發(fā)現(xiàn)小麥粉易受B類單端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮的污染，其中又以DON的污染最為嚴(yán)重，受3－ADON、15－ADON和NIV污染水平較低。馬玉彤等[7]對我國11個(gè)麥區(qū)的小麥中7種鐮刀菌毒素含量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，小麥毒素污染以NIV為主，NIV含量在各麥區(qū)間無顯著差異；DON和3－ADON的含量在長江中下游冬麥區(qū)中最高；15－ADON含量較低，在各麥區(qū)間差異不明顯。陳新元等[8]研究發(fā)現(xiàn)，四川小麥毒素污染種類以NIV為主，DON其次，3－ADON、15－ADON和鐮刀菌烯醇（4ANIV）發(fā)生較輕。四川是我國小麥主產(chǎn)區(qū)之一，也是小麥赤霉病常年流行區(qū)域，持續(xù)關(guān)注四川地區(qū)小麥鐮刀菌毒素污染情況，對今后開展小麥赤霉病的預(yù)報(bào)和防治工作，以及小麥品質(zhì)安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警研究具有重要意義。

目前，真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[9]、 酶聯(lián)免疫法[10]、 高效液相色譜法[11～12]和液質(zhì)聯(lián)用法[13～16]等，上述方法除液質(zhì)聯(lián)用法外均只能檢測單一或同一類毒素。液質(zhì)聯(lián)用法可實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)測定，具有高靈敏度、高分離度和高精密度的優(yōu)勢，成為近幾年熱門的分析手段。本研究采用QuEChERS凈化技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）建立小麥中4種鐮刀菌毒素的分析方法，并利用該方法對四川地區(qū)450份小麥樣品中DON、3－ADON、15－ADON和NIV 4種鐮刀菌毒素進(jìn)行含量測定，以了解四川小麥鐮刀菌毒素污染水平，以期為四川小麥質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作提供監(jiān)測手段和數(shù)據(jù)支持。

一、材料與方法

（一）材料與試劑 乙腈、甲醇（色譜純），美國Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，四川優(yōu)普超純科技有限公司；DON（200μg/mL）、3－ADON（100μg/mL）、15－ADON（100μg/mL）、NIV（100μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，ROMER公司；乙酸銨（色 譜 純），QuEChERS凈 化 管 （貨 號SBEQCA8805－H，含無水硫酸鎂200 mg、氯化鈉100 mg、檸檬酸鈉100 mg、C18100 mg），0.22μm有機(jī)濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

（二）儀器與設(shè)備超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀Xevo TQ－XS，美國Waters公司；AUY220型分析天平，日本島津公司；渦旋振蕩器，上海旌派儀器有限公司；TG－1850高速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司。

（三）樣品采集與制備

1.樣品采集。根據(jù)四川小麥種植區(qū)域布局情況，選取成都、德陽、綿陽等10個(gè)市的小麥種植區(qū)為采樣點(diǎn)，抽取2020年收獲小麥樣品共450份。樣品采集信息見表1。每份樣品抽取2 kg，以尼龍網(wǎng)袋包裝，放于陰涼通風(fēng)處保存。

2.樣品制備。采用四分法將樣品縮減至500 g，高速粉碎后通過20目篩，混勻后裝入樣品密封袋中，于－18℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（四）試驗(yàn)方法

1.色譜條件。色譜柱：Phenomenex Kinetex XB－C18100A（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2μL；流動相：5 mmol/L乙酸銨水溶液（A相）、甲醇（B相）；梯度洗脫程序：0～2.5 min，90%A→40%A；2.5～3.5 min，40%A→10%A；3.5～3.6 min，10%A→90%A；3.6～5.5 min，90%A。

2.質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；電離模式：ESI；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：250℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔反吹氣流量：150 L/h。質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

3.樣品提取與凈化。稱取小麥粉5 g于離心管，加入50%乙腈水溶液20 mL，渦旋5 min后，于搖床以200 r/min振蕩30 min。振蕩完成后以4 000 r/min離心10 min，取4 mL上清液到干凈離心管中，加入QuEChERS凈化試劑，快速渦旋1 min再以4 000 r/min離心10 min。取全部上層清液氮吹至近干，用50%乙腈水溶液定容至1 mL，混勻后過0.22μm濾膜，供UPLC－MS/MS檢測。

4.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制。取不含有DON、3－ADON、15－ADON和NIV的空白小麥樣品，按上文“3.樣品提取與凈化”方法制備空白基質(zhì)溶液。將4種鐮刀菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品用上述空白基質(zhì)溶液稀釋成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中DON、3－ADON和15－ADON系列濃度為10、50、200、500、1 000 ng/mL，NIV系列濃度為40、100、200、500、1 000 ng/mL。

二、結(jié)果與分析

（一）質(zhì)譜條件優(yōu)化根據(jù)化合物分子的化學(xué)電離性質(zhì)，分別采用正、負(fù)離子模式采集化合物響應(yīng)。經(jīng)比較，DON、3－ADON、15－ADON在正離子模式下響應(yīng)較高，NIV在負(fù)離子模式下靈敏度更好，因此選擇正負(fù)離子同時(shí)掃描模式。利用儀器軟件自動調(diào)諧功能，對目標(biāo)化合物子離子、錐孔電壓、碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳MRM質(zhì)譜參數(shù)（見表2）。

（二）色譜條件優(yōu)化在液質(zhì)聯(lián)用分析中，流動相組成不僅影響液相色譜的分離效果，還影響目標(biāo)化合物的離子化效率和質(zhì)譜靈敏度[17]。本文分別考察了甲醇－水、甲醇－0.1%甲酸水、甲醇－5 mmol/L乙酸銨水和甲醇－0.1%氨水對4種目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，流動相為甲醇－水和甲醇－0.1%甲酸水時(shí)，采用負(fù)離子模式的NIV均無質(zhì)譜響應(yīng)；采用甲醇－5 mmol/L乙酸銨水和甲醇－0.1%氨水為流動相時(shí)，4種化合物均能有效分離。在甲醇－5 mmol/L乙酸銨水條件下，雖然NIV響應(yīng)強(qiáng)度弱于甲醇－0.1%氨水條件，但其余3種化合物響應(yīng)強(qiáng)度更優(yōu)，因此最終采用甲醇－5mmol/L乙酸銨水作為流動相。經(jīng)優(yōu)化后4種鐮刀菌毒素MRM色譜圖見圖1。

（三）方法的線性范圍與靈敏度將制備的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上文色譜和質(zhì)譜條件由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣檢測。以目標(biāo)化合物峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，4種化合物在各自線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均≥0.997。以3倍信噪比時(shí)各化合物對應(yīng)濃度為檢出限，10倍信噪比時(shí)對應(yīng)濃度為定量限，DON、3－ADON、15－ADON檢出限為5μg/kg，定量限為10μg/kg；NIV檢出限為20μg/kg，定量限為40μg/kg（見表3）。

（四）方法的回收率與精密度在空白小麥樣品中分別添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行5次平行測定，計(jì)算各目標(biāo)化合物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4。如表4所示，4種鐮刀菌毒素平均回收率范圍為81.5%～94.5%，RSD范圍為2.4%～8.6%，說明本方法準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足實(shí)際樣品的檢測要求。

表4 4種鐮刀菌毒素的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝5）

（五）四川小麥樣品中鐮刀菌毒素的檢測采用本文方法對四川小麥進(jìn)行鐮刀菌毒素檢測，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，450份小麥樣品中檢出含4種鐮刀菌毒素樣品334個(gè)，總體檢出率74.2%；4種鐮刀菌毒素均有檢出，所有樣品中4種鐮刀菌毒素檢出率按高低順序依次是DON（67.8%）＞NIV（60.9%）＞3－ADON（4.2%）＞15－ADON（0.4%），以DON和NIV的污染情況最為普遍。從檢出含量看，NIV污染程度最嚴(yán)重，最大值、平均值和中位值均最高，最大值達(dá)4 505.7μg/kg；DON污染程度次之，有13個(gè)（2.9%）樣品DON含量高于國家規(guī)定的限量值1 000μg/kg，超標(biāo)值范圍為1 070.3～3 081.1μg/kg；3－ADON和15－ADON污染程度較輕，中位值低于檢出限（LOD），最高值未超過100μg/kg。

表5 四川小麥鐮刀菌毒素含量總體水平

（六）不同地區(qū)小麥樣品中鐮刀菌毒素污染情況四川不同地區(qū)小麥樣品中4種鐮刀菌毒素含量的檢測結(jié)果見表6，經(jīng)比較數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，DON在10個(gè)地區(qū)均有檢出，檢出率范圍在31.7%～100%，其中綿陽地區(qū)受污染范圍較小，雅安地區(qū)受污染范圍最大，超標(biāo)樣品分別來自雅安（3個(gè)）和成都（10個(gè)），DON含量檢出最高值來自成都，經(jīng)對比，雅安和成都小麥樣品檢測均值顯著高于其他地區(qū)（P＜0.05）；與DON情況相似，NIV在各地區(qū)小麥樣品中普遍存在，檢出率范圍在18.3%～100%，綿陽地區(qū)受污染較輕，雅安和達(dá)州樣品受污染范圍最廣，NIV檢出最高值同樣來自成都，經(jīng)對比，達(dá)州和成都小麥NIV檢出均值較高，與其他地區(qū)存在顯著性差異（P＜0.05）；3－ADON僅在眉山、雅安和成都3個(gè)地區(qū)有分布，15－ADON僅在成都地區(qū)有分布，兩種鐮刀菌毒素均檢出量少、含量較低，在各個(gè)地區(qū)間沒有顯著差異。

表6 不同地區(qū)小麥樣品鐮刀菌毒素污染情況

三、結(jié)論

本研究建立了UPLC－MS/MS技術(shù)檢測小麥中DON、3－ADON、15－ADON和NIV 4種鐮刀菌毒素含量的方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證后，確認(rèn)本方法回收率高且穩(wěn)定、精確度好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠滿足小麥中鐮刀菌毒素的檢測要求，適用于在我國糧食產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作中檢測相關(guān)真菌毒素。

從檢測結(jié)果看，2020年采收的450份四川小麥樣品中鐮刀菌毒素總體檢出率74.2%，超標(biāo)率2.9%；4種鐮刀菌毒素以NIV和DON污染程度較為嚴(yán)重，3－ADON和15－ADON污染較輕，此結(jié)果與何珊[18]對四川小麥鐮刀菌毒素化學(xué)型的鑒定結(jié)果相符。不同麥區(qū)間NIV和DON的污染水平存在顯著性差異，達(dá)州和成都地區(qū)的NIV污染水平及雅安和成都地區(qū)的DON污染水平明顯高于其他地區(qū)。NIV作為廣泛性污染禾谷類作物的毒素，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，毒性強(qiáng)于DON[19～20]，對其可能造成的安全風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)予以重視?？傮w上，四川小麥產(chǎn)品質(zhì)量安全受鐮刀菌毒素影響有限，但存在一定風(fēng)險(xiǎn)，關(guān)于鐮刀菌毒素污染特點(diǎn)與毒素間相關(guān)性還有待作進(jìn)一步分析。